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Neuroscience

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Abstract

La actina, el componente principal del citoesqueleto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la estructura y la función neuronales. Bajo estados fisiológicos, la actina se produce en equilibrio en sus dos formas: globular monomérica (G-actina) y filamentosa polimerizada (F-actina). En los terminales sinápticos, el citoesqueleto de actina forma la base para las funciones críticas pre y post-sinápticas. Además, los cambios dinámicos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre las formas globulares y filamentosas de actina) están estrechamente relacionados con las alteraciones relacionadas con la plasticidad en la estructura y función sináptica. Se presenta aquí una metodología basada en fluorescencia modificada para evaluar el estado de polimerización de la actina en condiciones ex vivo. El ensayo emplea faloidina marcada fluorescentemente, una fallotoxina que se une específicamente a los filamentos de actina (F-actina), proporcionando una medida directa de actina filamentosa polimerizada. Como prueba de principio, proporcionamos pruebas de la idoneidad del ensayo tanto en roedores como en homogeneados de tejido cerebral humano post mortem. Usando la latrunculina A (una droga que despolimeriza los filamentos de la actina), confirmamos la utilidad del análisis en alteraciones de la supervisión en niveles de la F-actina. Además, extendemos el ensayo a fracciones bioquímicas de terminales sinápticos aislados en los que confirmamos un aumento de la polimerización de actina tras la estimulación por despolarización con altoK+extracelular.

Introduction

La actina de la proteína citoesquelérea está implicada en funciones celulares múltiples, incluyendo la ayuda estructural, el transporte celular, la movilidad y la división celulares. La actina se produce en equilibrio en dos formas: actina globular monomérica (G-actina) y actina filamentosa polimerizada (F-actina). Los cambios rápidos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre sus formas G y F) dan lugar a un rápido montaje y desmontaje de filamentos y subyacen a sus funciones reguladoras en la fisiología celular. La actina forma el componente principal de la estructura citoesquelética neuronal e influye en una amplia gama de funciones neuronales1,2. Cabe destacar que el citoesqueleto de actina forma parte integral de la plataforma estructural de los terminales sinápticos. Como tal, es un determinante importante de la morfogénesis sináptica y la fisiología y juega un papel fundamental en el control del tamaño, número y morfología de las sinapsis3,4,5. En particular, la polimerización-despolimerización dinámica de actina es un determinante clave de la remodelación sináptica asociada con la plasticidad sináptica subyacente a los procesos de memoria y aprendizaje. De hecho, tanto las funciones presinápticas (como la liberación de neurotransmisores6,7,8,9,10)como las funciones postsinápticas (remodelación dinámica relacionada con la plasticidad11,12,13,14)dependen críticamente de los cambios dinámicos en el estado de polimerización del citoesqueleto de actina.

En condiciones fisiológicas, los niveles de F-actina se regulan de forma dinámica y rigurosa a través de una vía multimodal que implica la modificación postraduccional4,15,16, así como proteínas de unión a actina (ABP)4,17. Los ABP pueden influir en la dinámica de la actina a múltiples niveles (como iniciar o inhibir la polimerización, inducir la ramificación de filamentos, cortar los filamentos a piezas más pequeñas, promover la despolimerización y proteger contra la despolimerización), y a su vez están bajo un estricto control modulador sensible a diversas señales extra e intracelulares18,19,20. Tales controles regulatorios en múltiples niveles dictan una regulación estricta de la dinámica de la actina en el citoesqueleto sináptico, afinando los aspectos pre y postsinápticos de la fisiología neuronal tanto en los estados basales como inducidos por la actividad.

Dados los importantes papeles de la actina en la fisiología neuronal, no es sorprendente que varios estudios hayan proporcionado evidencia de alteraciones en la dinámica de la actina como eventos patógenos críticos relacionados con una amplia gama de trastornos neurológicos, incluyendo neurodegeneración, enfermedades psicológicas, así como dolencias del neurodesarrollo3,21,22,23, 24,25,26,27. A pesar de la riqueza de datos de investigación que apuntan a los papeles clave de la actina en la fisiología neuronal y la fisiopatología, sin embargo, todavía quedan lagunas significativas en la comprensión de la dinámica de la actina, particularmente en el citoesqueleto sináptico. Se necesitan más estudios de investigación para tener una mejor comprensión de la actina neuronal y sus alteraciones en condiciones patológicas. Una de las principales áreas de interés en este contexto es la evaluación del estado de polimerización de la actina. Hay kits comerciales a base de western blotting (kit bioquímico de ensayo G-Actin/F-Actin in vivo; Citoesqueleto SKU BK03728,29)y ensayos caseros para la evaluación de los niveles de F-actina6. Sin embargo, debido a que estos requieren el aislamiento bioquímico de la F-actina y la G-actina y porque su cuantificación posterior se basa en protocolos de immunoblotting, pueden ser lentos. En este documento se presenta un ensayo basado en espectroscopia de fluorescencia adaptado de un estudio previo30 con modificaciones que pueden ser utilizados para evaluar tanto los niveles basales de F-actina, así como los cambios dinámicos en su montaje-desmontaje. En particular, hemos modificado eficientemente el protocolo original que requiere muestras adecuadas para una cubeta de 1 mL al formato actual de placa de 96 pozos. Por lo tanto, el protocolo modificado ha reducido significativamente la cantidad de tejido/muestra necesaria para el ensayo. Además, proporcionamos evidencia de que el protocolo es adecuado no solo para homogeneados de tejido cerebral, sino también para fracciones subcelulares como terminales sinápticos aislados (sinaptosomas y sinaptoneurosomas). Por último, el ensayo se puede emplear para tejidos cerebrales de roedores recién disecados y muestras de cerebro humano post mortem almacenadas a largo plazo. Cabe destacar que, si bien el ensayo se presenta en un contexto neuronal, puede extenderse adecuadamente a otros tipos de células y procesos fisiológicos asociados con ellos.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las normas del Comité de Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Otago (Protocolo de Ética No. AUP95/18 y AUP80/17) y legislatura de Nueva Zelanda. Los tejidos cerebrales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco del Hospital Clínic-IDIBAPS de Barcelona, España. Todos los protocolos de recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Clínic de Barcelona y se obtuvo el consentimiento informado de las familias.

1. Preparación de tampones y reactivos

  1. Prepare los siguientes tampones para la homogeneización del tejido cerebral y la preparación de la fracción enriquecida de terminales sinápticos:
    Tampón de homogeneización: 5 mM HEPES, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M
    Tampón de resuspensión: 5 mM Tris, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M
    Tampón de lavado: 5 mM Tris, pH 8.1
    Sacarosa de 1,2 M
    sacarosa de 1,0 M
    sacarosa de 0,85 M
  2. Agregue una mezcla casera o comercial de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
    NOTA: Hemos utilizado la versión EDTA-libre de la mezcla completa del inhibidor de proteasa (1 tableta por el almacenador intermediario de 10 mL) y del cóctel iv del inhibidor de la fosfatasa (1:100; volumen: volumen).
  3. Prepare los siguientes tampones y reactivos para la fijación, permeabilización y unión de faloidina:
    Tampón Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucosa, 20 mM HEPES, pH 7,4
    KCl de 1 M
    25% glutaraldehído (solución común)
    Tampón Krebs que contiene 0,1 % Tritón X-100 y 1 mg/mL naBH4
    400x Alexa Fluor 647 Faloidina en DMSO
    Tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M
    Latrunculina A de 50 μM en DMSO (solución común)
    1 M KCl (solución común)
    PRECAUCIÓN: La faloidina es tóxica (LD50 = 2 mg/kg) y debe manipularse con cuidado. La inhalación de glutaraldehído es tóxica y debe manipularse en una campana extractora de humos.
  4. Almacene los tampones a 4 °C y la faloidina y latrunculina A a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    Nota : no se recomienda el almacenamiento a largo plazo de búferes. El protocolo se puede pausar aquí.

2. Homogeneización del tejido cerebral

  1. Homogeneizar el tejido cerebral de rata criopreservado o recién diseccionado en 10 volúmenes de tampón de homogeneización en un tubo de vidrioPotter-Elvehjem y pestle en el hielo.
    NOTA: La homogeneización óptima se logra mediante 15-20 golpes del pestle a mano para los tejidos cerebrales. La homogeneización exitosa se puede confirmar por el flujo suave de la suspensión a través del tubo de vidrio. El protocolo se puede pausar aquí.
  2. Determinar la concentración de proteínas en el homogeneato utilizando un ensayo de Bradford31.
    NOTA: También se pueden utilizar ensayos alternativos caseros o comerciales para la estimación de proteínas.
  3. Diluir muestras de homogeneato en tampón Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL.
    NOTA: En algunos de nuestros experimentos, incubamos homogeneados con 2 μM de latrunculina A o DMSO (controles) a 37 °C durante 1 h. Para ello, los homogenados se resuspensan en 48 μL de tampón krebs, y se añaden 2 μL de latrunculina A de 50 μM o 2 μL de DMSO. Además para el inmunoblotting, se recoge una pequeña cantidad de muestra (10 μg) después de la incubación.
  4. Fijar las muestras de homogeneato (sección 5).

3. Preparación de terminales nerviosas aisladas

  1. Preparación de synaptosomes
    NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos32,33 para sinaptosomas.
    1. Centrífuga cerebro homogeneado a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C.
    2. Deseche el pellet, que es la fracción nuclear cruda.
    3. Centrífuga adicional el sobrenadante (S1) obtenido en el paso 3.1.1 a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    4. Retire el sobrenadante (S2), que es la fracción citosólica soluble.
    5. Resuspend el pellet (P2) obtenido en el paso 3.1.3, que es la fracción sinaptosomal cruda en tampón de resuspensión.
      NOTA: El volumen de tampón de resuspensión depende de la cantidad de tejido inicial y la cantidad de pellet obtenido. Por ejemplo, al comenzar con 150-300 mg de tejidos cerebrales, el pellet obtenido se puede resuspended en 200 μL de tampón de resuspensión.
    6. Cargue los sinaptosomas crudos resuspended sobre un gradiente discontinuo de sacarosa hecho de volúmenes iguales de 0.85-1.0-1.2 M sacarosa.
      NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada una de la solución de sacarosa (para tejido de 150-300 mg). Esto se puede cambiar según cantidades más grandes del tejido. Los gradientes discontinuos se pueden hacer usando una jeringa 25G presionada contra la pared interna del tubo ultracentrífuga y capas suaves de las capas de sacarosa.
    7. Centrífuga a 85.000 x g durante 2 h a 4 °C.
      NOTA: Debido a la alta velocidad de centrifugación, se requiere una ultracentrífuga capaz de crear un vacío para reducir el calentamiento.
    8. Recoger la fracción sinaptosomal en la interfaz entre 1,0 y 1,2 M de sacarosa utilizando una punta de pipeta de 200 μL.
    9. Lave la fracción sinaptosomal con tampón de lavado helado por centrifugación a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Para el lavado, la fracción sinaptosomal obtenida en la interfase de sacarosa de 1,0 y 1,2 M se recoge en un tubo fresco de 1,5 mL, y se añade un volumen igual de tampón de lavado, asegurando la eliminación de la sacarosa alta del medio.
    10. Lavar de nuevo el pellet sinaptosomal con tampón de homogeneización helada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
    11. Resuspend los sinaptosomas en tampón de homogeneización sobre hielo.
      Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.
    12. Determine la concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford.
    13. Resuspend los sinaptosomas en el tampón de Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas deben ser despolarizados por KCl; ver sección 4).
      NOTA: Para la resuspensión, la fracción sinaptosomal se gira primero a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C y se elimina el sobrenadante (tampón). El pellet sinaptosomal se resuspende en el tampón Krebs mediante un pipeteo suave utilizando una punta de pipeta de 200 μL.
    14. Proceder con la despolarización (sección 4).
  2. Preparación de synaptoneurosomes
    NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos34,35 para sinaptoneurosomas.
    1. Pase el homogeneato cerebral a través de un filtro neto pre-humedeado de tamaño de poro de 100 μm en un portafiltros usando una jeringa de 1 mL.
      NOTA: La pre-humectación de todos los filtros es importante para evitar la pérdida de la muestra y debe hacerse utilizando un tampón de homogeneización. Para esto, el tampón de homogeneización se pasa a través de los filtros en el portafiltros utilizando una jeringa de 1 ml hasta que el tampón fluya hacia fuera.
    2. Recoja el filtrado (F1) en un tubo de 1,5 mL pre-refrigerado sobre hielo.
    3. Repetir el proceso (pasos 3.2.1 y 3.2.2) para la fracción F1 para obtener el segundo filtrado (F2).
    4. Pase el filtrado F2 a través de un filtro neto de 5 μm de tamaño de poro.
    5. Recoger el filtrado (F3) en un tubo pre-refrigerado de 1,5 mL sobre hielo.
    6. Filtrado de centrífuga F3 a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
    7. Resuspend el pellet (sinaptoneurosomas) en tampón krebs sobre hielo a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas van a ser despolarizados por KCl; ver sección 4).
      Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.
    8. Estime la concentración de proteínas utilizando un ensayo de Bradford.
    9. Proceder con la despolarización (sección 4).

4. Despolarización mediada por KCl de terminales sinápticos aislados

  1. Equilibrar sinaptosomas/sinaptoneurosomas a 37 °C durante 5-10 min.
  2. Estimular los sinaptosomas/sinaptoneurosomas añadiendo KCl para aumentarK+ extracelular a 50 mM durante 30 s a 37 °C y añadir el mismo volumen de tampón Krebs al respectivo conjunto de control no estimulado.
    NOTA: Por ejemplo, añadir 2,5 μL de 1 M KCl a los sinaptosomas resuspended en 47,5 μL de tampón Krebs; y añadir 2,5 μL de tampón Krebs al respectivo sinastosoma de control no estimulado. Para experimentos en los que un gran número de muestras están involucradas, proceda con no más de 2 muestras a la vez para que el tiempo de despolarización no exceda de 30 s.
  3. Termine la estimulación agregando glutaraldehído (sección 5).

5. Fijación y tinción de faloidina de muestras

  1. Añadir glutaraldehído a muestras homogenadas/sinaptosomales/sinaptoneurosomales a una concentración final de 2,5% durante 2-3 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Añadimos 6 μL de solución de glutaraldehído al 25% para que la concentración final de glutaraldehído en las muestras de 50 μL (homogenados/sinaptosomas/sinaptoneurosomas) fuera de aprox. 2,5%. La fijación es crítica y debe ser rápida y por lo tanto inmediatamente después de agregar glutaraldehído, la muestra debe ser vigorosamente vórtice.
  2. Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.
  3. Retire el sobrenadante.
    NOTA: Deseche el sobrenadante en una campana extractora de humos ya que el glutaraldehído es tóxico.
  4. Permeabilizar el pellet por resuspensión en 100 μL de tampón Krebs que contiene 0,1% Tritón X-100 y 1 mg/mL de NaHB4 durante 2-3 min a temperatura ambiente.
  5. Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.
  6. Retire el tampón de permeabilización.
  7. Lavar el pellet con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.
  8. Resuspend y manche el pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondiente a 500 μU) en 100 μL de tampón Krebs durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
    NOTA: Otras variedades de análogos fluorescentes de faloidina están disponibles comercialmente y se pueden reemplazar para el ensayo. La concentración de faloidina y el volumen total de la muestra de incubación pueden tener que modificarse de acuerdo con la cantidad y el tipo de tejido/muestra que se está probando y las condiciones óptimas deben estandarizarse en consecuencia.
  9. Centrifugar las muestras teñidas a 20.000 x g durante 5 min.
  10. Retire la faloidina sin enlazar (sobrenadante).
  11. Lavar la muestra con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.
  12. Resuspend en 200 μL de tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M.
    Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.

6. Análisis fluorométrico y dispersión de luz

  1. Dispense las muestras teñidas de faloidina Alexa Fluor 647 en una placa negra de 96 pozos.
  2. Mida la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 645 nm y una longitud de onda de emisión de 670 nm en un lector de placas a temperatura ambiente.
  3. Transfiera las muestras de la placa negra de 96 pozos a la placa transparente de 96 pozos utilizando puntas de pipeta de 200 μL.
  4. Mida la dispersión de luz a 540 nm para corregir cualquier pérdida que pueda haber ocurrido durante los pasos anteriores de fijación, permeabilización y tinción.
    NOTA: Las variaciones en el material biológico retenido en las muestras teñidas podrían ser más prominentes para cantidades más pequeñas de material de partida (ver Discusión).
  5. Incluya un conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin en el tampón Krebs a diferentes concentraciones (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x y 1x correspondientes a 25, 50, 125, 175, 250, 375 y 500 μU) para cada lote del ensayo como una curva estándar.
    NOTA: Este es un paso opcional y no afecta a los resultados del ensayo, especialmente cuando los niveles de F-actina se expresan de manera relativa (Sección 7). El protocolo se puede pausar aquí.

7. Análisis de datos

  1. La cantidad de F-actina en las muestras es directamente proporcional a la intensidad de fluorescencia de la faloidina unida. Expresar en términos absolutos de unidades de enlace de faloidina calculadas a partir de la curva lineal del estándar de faloidina marcado.
    NOTA: Como ejemplo, véanse las figuras 2A-B, 3A, 4A-B y la figura complementaria 2.
  2. Exprese los niveles de F-actina como una fracción de las muestras de control.
    NOTA: Como ejemplo, consulte las figuras 5A-B.

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Representative Results

Linealidad del ensayo para la evaluación de los niveles de F-actina
En primer lugar, se comprobó una curva estándar para el aumento lineal de la fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin, que se repitió para cada conjunto de experimentos (Figura 1). Para investigar el rango lineal del ensayo, se procesaron diferentes cantidades de homogenados cerebrales de roedores(Figuras 2A y 2B)y sujetos humanos post mortem(Figuras 3A y 3B). Se encontró que el ensayo era lineal en el rango de 50-200 μg de proteína según lo evaluado por las cantidades de faloidina etiquetada retenidas. Se utilizó la dispersión de luz a 540 nm para confirmar las diferentes cantidades de muestras (Figura 2C y Figura 3C).

La latrunculina, un agente despolimerizante de actina reduce la unión de la faloidina etiquetada
La latrunculina A es conocida por despolimerizar los filamentos de actina y reducir los niveles de F-actina36,37,38,39. Los homogenados de roedores o tejidos cerebrales humanos se incubaron con latrunculina A de 2 μM durante 1 hora a 37 °C para despolimerizar los filamentos de actina. Los respectivos conjuntos de control no tratados se incubaron con DMSO durante la misma duración de 1 hora a 37 °C. El ensayo midió robustamente la pérdida de los niveles de F-actina de 95,7 ± 6,6 (media ± SEM) en muestras de control a 72,0 ± 3,2 (media ± SEM) μU de faloidina unida en muestras tratadas con latrunculina A en homogenados cerebrales de roedores(Figura 4A). También se observó una disminución similar (de 83,7 ± 3,9 a 66,9 ± 4,2 μU) en la retención de faloidina etiquetada cuando los homogeneados de los tejidos cerebrales humanos fueron sometidos al tratamiento con latrunculina A(Figura 4B). Cabe destacar que los niveles totales de actina, según lo evaluado por inmunoblotting, no se alteraron tras el tratamiento con latrunculina A tanto en ratas(Figura Suplementaria 1A-B)como en humanos(Figura Suplementaria 1C-D)homogeneados cerebrales.

La despolarización de terminales sinápticos aisladosestimula la polimerización de actina y la formación de filamentos
La despolarización ex vivo de terminales sinápticos aislados se ha mostrado para dar lugar al estímulo rápido de la polimerización6,30,40,y este fenómeno fue utilizado como otra confirmación del análisis divulgado adjunto. Las fracciones bioquímicas enriquecidas en terminales sinápticos fueron preparadas de dos diversas maneras; un método de ultracentrifugación basado en gradiente para obtener "sinaptosomas"41,42,43,44 y un protocolo secuencial basado en filtración para obtener "sinaptoneurosomas"43,45,46. Debido a que el rendimiento de este último es mayor, lo utilizamos para los tejidos cerebrales post mortem humanos en los que las cantidades de tejido a menudo son limitantes. Por otro lado, preferimos utilizar sinaptosomas con un mayor grado de enriquecimiento de fragmentos sinápticos41 para nuestros experimentos de tejido cerebral de rata.

La despolarización de synaptosomes o synaptoneurosomes y el estímulo de la polimerización de la actinia fueron alcanzados por una explosión corta (30 segundos) del aumento en K extracelular+ a 50 milímetros. La exposición al KCl dio lugar a un aumento de la unión a faloidina en casi un 40% en los sinaptosomas cerebrales de roedores en comparación con los respectivos controles simulados estimulados(Figura 5A;véase también la Figura suplementaria 2A). Un menor (alrededor del 20%) pero también se observó un aumento constante en los sinaptoneurosomas humanos tratados con KCl(Figura 5B;véase también la Figura Suplementaria 2A). Estos experimentos validan la robustez de nuestro ensayo en la determinación de alteraciones en los niveles de F-actina en muestras de tejido cerebral, incluyendo terminales sinápticos aislados.

Figure 1
Figura 1. Curva estándar para fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin.  La linealidad de la emisión de fluorescencia de diferentes cantidades (25-500 μU) de faloidina etiquetada fue confirmada por espectroscopia de fluorescencia a una excitación de 645 nm y emisión de 670 nm(R2 = 0,9942). Los datos se representan como media ± SEM (n=3). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Linearidad del phalloidin que atasca a los homogenados de la entero-célula del tejido cerebral de la rata.  (A)Se evaluó la unión de faloidina a diferentes cantidades de homogenados (proteína de 50-300 μg). (B)La unión fue lineal en el rango de 50-200 μg de proteína(R2 = 0,9602). (C)Se utilizó la dispersión a 540 nm para confirmar diferentes cantidades de las muestras(R2 = 0,8319). Los datos se representan como media ± SEM (n=4). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Phalloidin que atasca a los homogenados de la entero-célula del tejido cerebral humano post mortem.  (A)Se evaluó la retención de faloidina en un rango de cantidades de homogenados (proteína de 50-300 μg). (B)Se encontró que la unión a faloidina era lineal en el rango de 50-200 μg de proteína(R2 = 0,8832). (C) La dispersión a 540 nm confirmó las cantidades variables de las muestras (R2 = 0,9730). Los datos se representan como media ± SEM (n=4). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Efectos de la latrunculina A sobre los niveles de F-actina.  El tratamiento de los homogenados cerebrales con el agente despolimerizante de actina Latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) dio lugar a una disminución significativa de las cantidades de filamentos de actina en comparación con las respectivas muestras de control tratadas con simulación, evaluadas por la retención de faloidina etiquetada tanto en roedores (p = 0,0034; prueba tde Student de dos colas emparejada)(A)como en tejidos humanos post mortem (p = 0,0011; prueba tde Student de dos colas emparejada)(B). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Efectos de la despolarización KCl-mediada sobre cantidades de la F-actina en terminales sinápticos aislados.  (A)La incubación de sinaptosomas del cerebro de rata con 50 mM de KCl durante 30 s a 37 °C estimuló la polimerización de actina que, en consecuencia, dio lugar a un aumento en la unión a faloidina (p = 0,0014; prueba tde Student de dos colas emparejada). (B)También se observó un aumento menor en la fracción sinaptoneurosómica de los tejidos cerebrales humanos post mortem (p = 0,014; prueba tde Student de dos colas emparejada). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura suplementaria 1. Efectos de la latrunculina A sobre los niveles totales de actina.  Los homogenados cerebrales se incubaron con latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) o volumen igual de DMSO (1 h a 37°C). Se recogieron 10 μg de proteína por muestra (controles tratados con latrunculina A y dmso simulados tratados) antes de la fijación. Los niveles totales de la actina fueron evaluados immunoblotting. Las manchas rubias representativas se muestran para los homogenados cerebrales de rata(A)y humanos(C). La latrunculina A no alteró los niveles totales de la actinia en rata(B;p = 0,40; t-prueba de estudiante de dos colas apareada) y humano(D;p = 0,42; homogenados apareados del cerebro de tde Student de dos colas). Los datos se representan como media ± SEM (n=3 pares). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2. Efectos de la despolarización KCl-mediada sobre niveles de la F-actina en synaptosomes de la rata y synaptoneurosomes humanos.  (A)La incubación de sinaptosomas del cerebro de rata con 50 mM de KCl (30 s a 37 °C) estimuló la polimerización de actina y un consiguiente aumento en la unión a faloidina (p = 0,0019; prueba tde Student de dos colas emparejada). (B)El aumento en la retención del phalloidin también fue observado en la fracción synaptoneurosomal humana despolarizada por KCl comparado a los controles sin estimular respectivos (p = 0,015; apareadode dos colas t de Student - prueba). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El ensayo aquí descrito, esencialmente adaptado de un estudio anterior30 con modificaciones, emplea una fallotoxina, faloidina etiquetada con una etiqueta fluorescente. Los análogos fluorescentes de faloidina se consideran el estándar de oro para la tinción de filamentos de actina en tejidos fijos47,48,49. De hecho, son las herramientas más antiguas para identificar específicamente los filamentos de actina50 y siguen siendo los instrumentos más utilizados para detectar filamentos de actina, especialmente para los análisis posteriores basados en microscopía de fluorescencia. Es importante destacar que se ha demostrado que la faloidina tiñe incluso la malla suelta e irregular de filamentos cortos de actina51,lo que indica que la unión a la faloidina no depende de la longitud del filamento. Nuestro protocolo, por otro lado, se basa en la espectroscopia de fluorescencia para analizar la dinámica de la actina en muestras biológicas ex vivo, por ejemplo, tejidos cerebrales de roedores y humanos.

La principal ventaja del protocolo es que reduce considerablemente el tiempo necesario con respecto a los protocolos existentes que requieren en primer lugar un aislamiento bioquímico de alta velocidad basado en la centrifugación de la F-actina (separación de la G-actina basada en la insolubilidad de los filamentos de actina en ciertos detergentes como Triton X-100) y el posterior análisis de los niveles inmunorreactivos utilizando Western blotting6,28,29. La eficiencia en el tiempo de nuestro ensayo también es una ventaja con respecto a las técnicas de inmunocitoquímica basadas en faloidina40,52,aunque podría haber algunos otros beneficios asociados con este último. Otra ventaja es que se puede aplicar a los tejidos cerebrales humanos post mortem criopreservados, cuya obtención siempre se asocia con algún retraso post mortem. Además, con respecto al protocolo original30 a partir del cual se ha modificado esta metodología, hemos reducido considerablemente el requisito de la cantidad de tejido de 1 mL de cubeta a un solo pozo de una placa de 96 pozos. Por otra parte, debido a la inclusión de una curva estándar de faloidina en cada conjunto de experimentos, nuestro protocolo puede cuantificar los niveles absolutos de filamentos de actina en unidades de faloidina unidas (Figuras 2A-B, 3A, 4A-B; véase también la Figura suplementaria 2),así como los niveles relativos a las muestras de control (Figura 5A-B).

Cabe señalar que la aplicación de faloidina para evaluar los niveles de F-actina sin embargo se restringe a las células fijas y muestras, tanto para nuestro protocolo de ensayo, así como protocolos basados en microscopía. Esto se debe a que la faloidina es esencialmente un heptapeptida bicíclico tóxico que se une específicamente en la interfaz entre las subunidades de F-actina con alta afinidad y estabiliza estos filamentos de actina, haciéndolos incapaces de despolimerizar y de hecho aumentando la conversión neta de G-actina en F-actina40,53,54. Por lo tanto, la faloidina estabiliza los filamentos de actina in vivo e in vitro,y puede dar lugar a cambios significativos en el estado de equilibrio de la actina per se47,55. Como tal evaluación del estado de polimerización de actina mediada por faloidina fluorescente se basa en estructuras de filamentos detenidos. Además, debido a su baja permeabilidad a través de la bicapa lipídica, las metodologías basadas en faloidina se basan en la permeabilización de las células o muestras biológicas. La inviabilidad de un análisis de la vivo-célula del curso del tiempo es por lo tanto una limitación importante del protocolo como con los métodos immunocytochemistry-basados que emplean el phalloidin.

La inviabilidad de los métodos basados en faloidina para evaluar los cambios dinámicos en los filamentos de actina en células vivas no fijadas plantea la pregunta de si existen procedimientos alternativos para hacerlo. De hecho, se han realizado avances en este sentido con la expresión exógena de análogos fluorescentes-actina antes del análisis mediante protocolos como la micrografía de vídeo36, 56,la recuperación de fluorescencia tras el fotoblanqueo (FRAP)38 o la resonancia de fluorescencia de transferencia de energía (FRET)39. La expresión heteróloga de péptidos y proteínas marcados fluorescentemente que se unen a los filamentos de actina también se emplea para estudiar la dinámica de la actina en células vivas; sin embargo, existen desventajas y limitaciones asociadas con ellos, así como con la expresión heteróloga de la actina marcada fluorescentemente47,49,57. Por ejemplo, la G-actina que comprende el 50-70% de la actina total en la mayoría de las células es soluble y libremente difusible en el citosol, lo que resulta en un fondo más alto que causa desafíos en la diferenciación de las señales de los filamentos de actina específicamente57.

Un factor crítico en el ensayo es el que se muestra en la Figura 2 y la Figura 3; no es lineal en todo el rango de cantidades de proteínas analizadas. Por lo tanto, una cantidad óptima de proteína adecuada para el ensayo debe determinarse primero o la cantidad de análogo de faloidina debe ajustarse de tal manera que ya no sea limitante (a cantidades más altas de proteínas). Otro aspecto crítico del protocolo es que los múltiples pasos basados en la centrifugación para la eliminación del fijador, agente de permeabilización y faloidina no unida pueden conducir a la pérdida variable de proteínas (y F-actina unida a faloidina) de las muestras, particularmente cuando se utilizan cantidades más bajas de muestras. Por lo tanto, es importante normalizar la cantidad de muestra retenida mediante el monitoreo de la dispersión de la luz a 540 nm. Por último, dado que la actina está en un estado dinámico de interconversión entre sus formas F y G, la fijación debe ser rápida. Un aspecto crítico relacionado menor del ensayo es que no pudimos evaluar su eficiencia en la evaluación de la polimerización farmacológica de actina. A diferencia de la despolimerización farmacológica de la actina por latrunculina A, la jasplakinolide (un agente polimerizante de actina fiable y ampliamente utilizado) tiene sitios de unión superpuestos con faloidina e inhibe competitivamente su unión a filamentos de actina58,59. Sin embargo, el empleo de terminales sinápticos estimulados por KCl como modelo ex vivo para el aumento de la polimerización de actina indica que nuestro ensayo también puede detectar aumentos en los niveles de F-actina.

En conclusión, se describe un robusto tiempo eficiente y de alto rendimiento ensayo para el análisis de filamentos de actina (F-actina) y sus alternancias en estados fisiológicos y fisiopatológicos adecuados para un formato de placa de 96 pocillos. En combinación con otros métodos existentes para la evaluación de la F-actina en muestras fijas y no fijadas, el protocolo demostrará ser una herramienta esencial en los estudios relacionados con la actina en el campo de las neurociencias, así como en otras áreas de la investigación de la ciencia biológica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Neurológica de Nueva Zelanda (1835-PG), el Consejo de Investigación de Salud de Nueva Zelanda (#16-597) y el Departamento de Anatomía de la Universidad de Otago, Nueva Zelanda. Estamos en deuda con el Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco HCB-IDIBAPS (España) para tejidos cerebrales humanos. Agradecemos a Jiaxian Zhang por su ayuda en la grabación y edición del video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

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