Summary
Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.
Abstract
Actin, o principal componente do citoesqueleto, desempenha um papel crítico na manutenção da estrutura e função neuronal. Nos estados fisiológicos, a actina ocorre em equilíbrio em suas duas formas: globular monomérica (G-actin) e fisordenos polimerizados (F- actina). Nos terminais sinápticos, o citoesqueleto de actin forma a base para funções críticas pré e pós-sináptica. Além disso, mudanças dinâmicas no status de polimerização da actina (interconversão entre formas globulares e relacionáveis de actina) estão intimamente ligadas a alterações relacionadas à plasticidade na estrutura e função sináptica. Informamos aqui uma metodologia baseada em fluorescência modificada para avaliar o status de polimerização da actina em condições ex vivo. O ensaio emprega fábulina fluorescentemente rotulada, uma falotoxina que se liga especificamente aos filamentos de actina (F-actin), fornecendo uma medida direta de ato de fiomatos polimerizados. Como prova de princípio, fornecemos evidências para a adequação do ensaio tanto em roedores quanto em homogeneizações de tecido cerebral humano pós-morte. Utilizando latrunculin A (uma droga que despomeriza filamentos de actina), confirmamos a utilidade do ensaio no monitoramento de alterações nos níveis de F-actin. Além disso, estendemos o ensaio a frações bioquímicas de terminais sinápticos isolados em que confirmamos o aumento da polimerização da actina após a estimulação por despolarização com alto K+extracelular .
Introduction
A actina de proteína citoesquelél está envolvida em múltiplas funções celulares, incluindo suporte estrutural, transporte celular, motilidade celular e divisão. A actina ocorre em equilíbrio em duas formas: actina globular monomérica (G-actin) e ato de fisordenada polimerizada (F-actin). Mudanças rápidas no status de polimerização da actina (interconversão entre suas formas G e F) resultam em rápida montagem de filamentos e desmontagem e fundamentam suas funções regulatórias na fisiologia celular. Actin forma o principal componente da estrutura citoesquelético neuronal e influencia uma ampla gama de funções neuronais1,2. Note-se que o citoesqueleto actin forma parte integrante da plataforma estrutural dos terminais sinápticos. Como tal, é um dos principais determinantes da morfogênese sináptica e da fisiologia e desempenha um papel fundamental no controle do tamanho, número e morfologia das sinapses3,4,5. Em particular, a polimerização dinâmica de actina-despomerização é um determinante fundamental da remodelagem sináptica associada à plasticidade sináptica subjacente aos processos de memória e aprendizagem. De fato, tanto as funções pressiná-iânfmáticas (como a liberação neurotransmissor6,7,8,9,10) quanto as funções postsintálicas (remodelagem dinâmica relacionada à plasticidade11,12,13,14) dependem criticamente de mudanças dinâmicas no status de polimerização do citoesqueleto actin.
Em condições fisiológicas, os níveis de F-actin são dinamicamente e firmemente regulados através de uma via multimodal envolvendo modificação pós-transacional4,15,16, bem como proteínas de ligação de actina (ABPs)4,17. Os ABPs podem influenciar a dinâmica da actina em vários níveis (como iniciar ou inibir a polimerização, induzir ramificações de filamentos, cortar filamentos em peças menores, promover a despomerização e proteger contra a despomerização), e estão em turno sob um rigoroso controle modulatório sensível a vários sinais extra e intracelular18,19,20. Tais verificações regulatórias em vários níveis ditam uma regulação rigorosa da dinâmica da actina no citoesqueleto sináptico, afinando aspectos pré e postinopticos da fisiologia neuronal, tanto nos estados basais quanto induzidos pela atividade.
Dado os importantes papéis da actina na fisiologia neuronal, não é de surpreender que vários estudos tenham fornecido evidências de alterações na dinâmica da actina como eventos patogênicos críticos ligados a uma ampla gama de distúrbios neurológicos, incluindo neurodegeneração, doenças psicológicas e doenças neurodesenvolvimentares3,21,22,23,24,25,26,27. Apesar da riqueza de dados de pesquisa que apontam para papéis-chave da actina na fisiologia neuronal e na fisiopatologia, no entanto, lacunas significativas ainda permanecem na compreensão da dinâmica da actina, particularmente no citoesqueleto sináptico. Mais estudos de pesquisa são necessários para ter uma melhor compreensão da actina neuronal e suas alterações em condições patológicas. Uma das principais áreas de foco nesse contexto é a avaliação do status de polimerização de actina. Existem kits comerciais baseados em manchas ocidentais (G-Actin/F-Actin in vivo assay bioquímico kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) e ensaios caseiros para avaliação dos níveis de F-actin6. No entanto, como estes requerem isolamento bioquímico de F-actin e G-actin e porque sua quantificação subsequente é baseada em protocolos de imunobloquetação, eles podem ser demorados. Aqui relatamos um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência adaptado de um estudo anterior30 com modificações que podem ser usadas para avaliar tanto os níveis basais de F-actin, como mudanças dinâmicas em sua montagem-desmontagem. Notavelmente, modificamos eficientemente o protocolo original que requer amostras adequadas para um cuvette de 1 mL para o formato atual de placa de 96 poços. O protocolo modificado reduziu significativamente a quantidade de tecido/amostra necessária para o ensaio. Além disso, fornecemos evidências de que o protocolo é adequado não apenas para homogeneizadores de tecido cerebral, mas também frações subcelulares, como terminais sinápticos isolados (sinápttos e sinápticos). Por fim, o ensaio pode ser empregado para tecidos cerebrais de roedores recém-dissecados e amostras cerebrais humanas pós-morte armazenadas a longo prazo. Note-se que, embora o ensaio seja apresentado em um contexto neuronal, ele pode ser adequadamente estendido a outros tipos de células e processos fisiológicos associados a eles.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética da Universidade de Otago no Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Protocolo de Ética Nº. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandesa. Os tecidos cerebrais humanos foram obtidos do Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank em Barcelona, Espanha. Todos os protocolos de coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Clínic, em Barcelona, e o consentimento informado foi obtido das famílias.
1. Preparação de tampões e reagentes
- Prepare os seguintes buffers para a homogeneização do tecido cerebral e a preparação de fração enriquecida de terminais sinápticos:
Tampão de homogeneização: 5 mM HEPES, pH 7.4 suplementado com 0,32 M de sacarose
Tampão de resuspensão: 5 mM Tris, pH 7.4 suplementado com sacarose de 0,32 M
Tampão de lavagem: 5 mM Tris, pH 8.1
1,2 M de sacarose
1,0 M de sacarose
0,85 M de sacarose - Adicione mistura caseira ou comercial de inibidores de protease e fosfatase.
NOTA: Usamos a versão sem EDTA do mix completo do Inibidor protease (1 comprimido por tampão de 10 mL) e coquetel inibidor de fosfatase IV (1:100; volume: volume). - Prepare os seguintes buffers e reagentes para a fixação, permeabilização e vinculação da falooidina:
Tampão krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3,10 mM de glicose, 20 mM HEPES, pH 7.4
1 M KCl
Glutaraldeído 25% (solução de estoque)
Tampão krebs contendo 0,1 % Triton X-100 e 1 mg/mL NaBH4
400x Alexa Fluor 647 Phalloidin em DMSO
Tampão krebs contendo 0,32 M de sacarose
50 μM latrunculin A em DMSO (solução de estoque)
1 M KCl (solução de estoque)
ATENÇÃO: A falooidina é tóxica (LD50 = 2 mg/kg) e deve ser tratada com cuidado. A inalação de glutaraldeído é tóxica e deve ser manuseada em um capô de fumaça. - Armazene os buffers a 4 °C e a faloideína e latrunculin A a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
NOTA: O armazenamento a longo prazo de buffers não é recomendado. O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Homogeneização do tecido cerebral
- Homogeneize o tecido cerebral de rato criopreservado ou recém-dissecado em 10 volumes de tampão de homogeneização em um tubo de vidroPotter-Elvehjem e pilão no gelo.
NOTA: A homogeneização ideal é alcançada por 15-20 golpes do pilão à mão para tecidos cerebrais. A homogeneização bem sucedida pode ser confirmada pelo fluxo suave da suspensão através do tubo de vidro. O protocolo pode ser pausado aqui. - Determine a concentração de proteína no homogeneizar usando um ensaio de Bradford31.
NOTA: Ensaios caseiros ou comerciais alternativos para estimativa de proteínas também podem ser usados. - Diluir amostras homogeneizadas no tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL.
NOTA: Em alguns de nossos experimentos, incubamos homogeneizadores com 2 μM latrunculin A ou DMSO (controles) a 37 °C por 1 h. Para isso, os homogeneizadores são resuspended em 48 μL de buffer Krebs, e 2 μL de 50 μM latrunculin A ou 2 μL de DMSO é adicionado. Além disso, para a imunoblotação, uma pequena quantidade de amostra (10 μg) é coletada após a incubação. - Fixar as amostras homogeneizais (seção 5).
3. Preparação de terminais nervosos isolados
- Preparação de sinástomos
NOTA: Protocolos alternativos32,33 para sináttoso também podem ser usados.- Centrífuga cerebral homogeneiza a 1.200 x g por 10 min a 4 °C.
- Descarte a pelota, que é a fração nuclear bruta.
- Mais centrífuga o supernascido (S1) obtido na etapa 3.1.1 a 12.000 x g para 15 min a 4 °C.
- Remova o supernatante (S2), que é a fração citosolica solúvel.
- Resuspend a pelota (P2) obtida na etapa 3.1.3, que é a fração sintásica bruta no tampão de resuspensão.
NOTA: O volume do tampão de ressuspensão depende da quantidade de tecido inicial e da quantidade de pelotas obtida. Por exemplo, quando começa com 150-300 mg de tecidos cerebrais, a pelota obtida pode ser resuspended em 200 μL de tampão de resuspensão. - Carregue os sinapstos brutos resuspendados em um gradiente de sacarose descontínuo feito de volumes iguais de 0,85-1.0-1,2 M de sacarose.
NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada uma da solução de sacarose (para tecido de 150-300 mgs). Isso pode ser alterado de acordo com quantidades maiores de tecido. Gradientes descontínuos podem ser feitos usando uma seringa 25G pressionada contra a parede interna do tubo ultracentrífuga e camadas suaves das camadas de sacarose. - Centrifugar a 85.000 x g por 2 h a 4 °C.
NOTA: Devido à alta velocidade da centrifugação, é necessário um ultracentrifuge capaz de criar um vácuo para reduzir o aquecimento. - Colete a fração sinapstosômica na interface entre 1,0 e 1,2 M de sacarose usando uma ponta de tubulação de 200 μL.
- Lave a fração sinaptosômica com tampão de lavagem gelado por centrifugação a 18.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
NOTA: Para a lavagem, a fração sinaptosômica obtida na interface de 1,0 e 1,2 M de sacarose é coletada em um tubo fresco de 1,5 mL, e um volume igual de tampão de lavagem é adicionado, garantindo a remoção de alta sacarose do meio. - Lave a pelota sinaptosômica novamente com tampão de homogeneização gelada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
- Resuspense os sinapstosos no tampão de homogeneização no gelo.
NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui. - Determine a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.
- Resuspenda os sinapstosmos em tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados por KCl; ver seção 4).
NOTA: Para a resuspensão, a fração sinapstosômica é primeiramente girada em 12.000 x g por 5 min a 4 °C e o supernascido (tampão) é removido. A pelota sinaptosômica é então resuspendida no tampão Krebs por pipetação suave usando uma ponta de tubulação de 200 μL. - Prossiga com a despolarização (seção 4).
- Preparação de sináticos
NOTA: Protocolos alternativos34,35 para sináptos também podem ser usados.- Passe o cérebro homogeneizar através de um filtro de rede pré-molhado de 100 μm de tamanho de poro em um suporte de filtro usando uma seringa de 1 mL.
NOTA: A pré-motação de todos os filtros é importante para evitar a perda da amostra e deve ser feita usando tampão de homogeneização. Para isso, o tampão de homogeneização é passado através dos filtros no suporte do filtro usando uma seringa de 1 mL até que o buffer flua. - Colete o filtrado (F1) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.
- Repita o processo (etapas 3.2.1 e 3.2.2) para a fração F1 para obter o segundo filtrado (F2).
- Passe f2 filtrado através de um filtro líquido de 5 μm tamanho de poros.
- Colete o filtrado (F3) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.
- Centrífuga filtra F3 a 1.500 x g por 10 min a 4 °C.
- Resuspend a pelota (sináptogoso) em tampão de Krebs no gelo a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados pela KCl; ver seção 4).
NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui. - Estime a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.
- Prossiga com a despolarização (seção 4).
- Passe o cérebro homogeneizar através de um filtro de rede pré-molhado de 100 μm de tamanho de poro em um suporte de filtro usando uma seringa de 1 mL.
4. Despolarização mediada por KCl de terminais sinápticos isolados
- Equilibre os sináceos/sináptosmos a 37 °C por 5-10 min.
- Estimule os sinápstosmos/sináptorias adicionando KCl para aumentar k extracelular+ para 50 mM para 30 s a 37 °C e adicionar o mesmo volume de tampão Krebs ao respectivo conjunto de controle não estimulado.
NOTA: Por exemplo, adicione 2,5 μL de 1 M KCl aos sinápstoses resuspentados em 47,5 μL de buffer Krebs; e adicionar 2,5 μL de tampão Krebs ao respectivo sinaptosomo de controle não estimulado. Para experimentos em que um grande número de amostras estão envolvidas, proceda com no máximo 2 amostras por vez para que o tempo de despolarização não exceda os 30 s. - Finalce a estimulação adicionando glutaraldeído (seção 5).
5. Fixação e mancha de faloideína de amostras
- Adicione glutaraldeído a amostras homogeneizas/sinapstosômicas/sinapstoneurosomais a uma concentração final de 2,5% para 2-3 min à temperatura ambiente.
NOTA: Adicionamos 6 μL de solução de glutaraldeído de 25% para que a concentração final de glutaraldeído nas amostras de 50 μL (homogeneizados/sinápitos/sinapontorosos) fosse de cerca de 2,5%. A fixação é crítica e deve ser rápida e, portanto, imediatamente após a adição de glutaraldeído, a amostra deve ser vigorosamente vórticada. - Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.
- Remova o supernatante.
NOTA: Descarte o supernatante em uma capa de fumaça, pois o glutaraldeído é tóxico. - Permeabilize a pelota por resuspensão em 100 μL de tampão Krebs contendo 0,1% Triton X-100 e 1 mg/mL NaHB4 para 2-3 min em temperatura ambiente.
- Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.
- Remova o tampão de permeabilização.
- Lave a pelota com 200 μL de tampão Krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.
- Resuspend e colora a pelota com 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondente a 500 μU) em 100 μL de tampão Krebs por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
NOTA: Outras variedades de análogos fluorescentes de faloideína estão disponíveis comercialmente e podem ser substituídas para o ensaio. A concentração de faloidina e o volume total de amostra de incubação podem ter que ser modificados de acordo com a quantidade e o tipo de tecido/amostra que está sendo testado e as condições ideais devem ser padronizadas em conformidade. - Centrifugar as amostras manchadas a 20.000 x g por 5 min.
- Remova a falooidina desvinculada (supernante).
- Lave a amostra com 200 μL de tampão krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.
- Resuspend em 200 μL de tampão Krebs contendo 0,32 M de sacarose.
NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.
6. Análise fluorométrica e dispersão de luz
- Dispense alexa fluor 647 amostras manchadas de phalloidina em uma placa preta de 96 poços.
- Meça a intensidade da fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 645 nm e um comprimento de onda de emissão de 670 nm em um leitor de placas à temperatura ambiente.
- Transfira as amostras da placa preta de 96 poços para a placa transparente de 96 poços usando pontas de tubulação de 200 μL.
- Meça a dispersão de luz em 540 nm para corrigir quaisquer perdas que possam ter ocorrido durante as etapas anteriores de fixação, permeabilização e coloração.
NOTA: Variações no material biológico retido nas amostras manchadas podem ser mais proeminentes para quantidades menores de material inicial (ver Discussão). - Inclua um conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin no buffer Krebs em diferentes concentrações (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x correspondente a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) para cada lote do ensaio como curva padrão.
NOTA: Esta é uma etapa opcional e não afeta os resultados do ensaio especialmente quando os níveis de F-actin estão sendo expressos de forma relativa (Seção 7). O protocolo pode ser pausado aqui.
7. Análise de dados
- A quantidade de F-actin nas amostras é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência da faloideina ligada. Expresse em termos absolutos de unidades de faloideína encadernadas calculadas a partir da curva linear do padrão de faloideina marcada.
NOTA: Como exemplo, ver Figuras 2A-B, 3A, 4A-B e Figura Suplementar 2. - Expresse níveis de F-actin como uma fração das amostras de controle.
NOTA: Como exemplo, consulte figuras 5A-B.
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Representative Results
Linearidade do ensaio para avaliação dos níveis de F-actin
Primeiro, foi verificada uma curva padrão para o aumento linear da fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin e repetida para cada conjunto de experimentos(Figura 1). Para investigar a faixa linear do ensaio, foram processadas diferentes quantidades de homogeneizadores cerebrais de roedores(Figuras 2A e 2B) e indivíduos humanos pós-morte(Figura 3A e 3B). O ensaio foi encontrado como linear na faixa de 50-200 μg de proteína, conforme avaliado por quantidades de fálica rotulada retidas. A dispersão de luz a 540 nm foi utilizada para confirmar as diferentes quantidades de amostras(Figura 2C e Figura 3C).
Latrunculin, um agente despolimerizador actin reduz a vinculação da fáliceina rotulada
Latrunculin A é conhecido por despolimerizar filamentos actin e reduzir os níveis de F-actin36,37,38,39. Homogeneados de roedores ou tecidos cerebrais humanos foram incubados com 2 μM latrunculin A por 1 hora a 37 °C para despolimerizar filamentos de actina. Os respectivos conjuntos de controle não tratados foram incubados com DMSO durante a mesma duração de 1 hora a 37 °C. O ensaio mediu robustamente a perda dos níveis de F-actin de 95,7 ± 6,6 (média ± SEM) em amostras de controle para 72,0 ± 3,2 (média ± SEM) μU de faloideina amarrada em amostras tratadas com latrunculina em homogeneados cerebrais roedores(Figura 4A). Também foi observada uma redução semelhante (de 83,7 ± 3,9 para 66,9 ± 4,2 μU) na retenção de faloideina rotulada quando homogeneizados de tecidos cerebrais humanos submetidos ao tratamento de latrunculina A(Figura 4B). Notavelmente, os níveis totais de actina, conforme avaliado pela imunoblotação, não alteraram no tratamento com latrunculina A tanto em ratos (Figura Suplementar 1A-B) quanto em homogeneizadores cerebrais humanos(Figura Suplementar 1C-D).
Despolarização de terminais sinápticos isoladosestimula polimerização e formação de filamentos
A despolarização ex vivo de terminais sinápticos isolados tem sido demonstrada como resultado de rápida estimulação da polimerização de actina6,30,40, e esse fenômeno foi utilizado como mais uma confirmação do ensaio aqui relatado. Frações bioquímicas enriquecidas em terminais sinápticos foram preparadas de duas maneiras diferentes; um método de ultracenrifugação baseado em gradiente para obter "sinátulas"41,42,43,44 e um protocolo sequencial baseado em filtração para obter "sinatoneuros"43,45,46. Como o rendimento para este último é maior, usamos para tecidos cerebrais pós-morte humanos, onde as quantidades de tecido são muitas vezes limitantes. Por outro lado, preferimos usar sinapstosomos com maior grau de enriquecimento dos fragmentos sinápticos41 para nossos experimentos de tecido cerebral de ratos.
A despolarização de sinástomos ou sinápitos e estimulação da polimerização da actina foram alcançadas por uma pequena (30 segundos) de aumento em K extracelular+ para 50 mM. A exposição à LCL resultou no aumento da ligação com a faloideina em quase 40% em sinatos cerebrais roedores em comparação com os respectivos controles simulados estimulados(Figura 5A; ver também Figura Suplementar 2A). Um menor (em torno de 20%) mas o aumento consistente também foi observado em sináptos humanos tratados com LCL (Figura 5B; ver também Figura Suplementar 2A). Esses experimentos validam a robustez de nosso ensaio na determinação de alterações nos níveis de F-actin em amostras de tecido cerebral, incluindo terminais sinápticos isolados.
Figura 1. Curva padrão para fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin. A linearidade da emissão de fluorescência de diferentes quantidades (25-500 μU) de fhalloidina rotulada foi confirmada por espectroscopia de fluorescência a uma excitação de 645 nm e emissão de 670 nm (R2 = 0,9942). Os dados são representados como média ± SEM (n=3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Linearidade da fhalloidina ligando-se a homogeneizadores de células inteiras do tecido cerebral de rato. (A) Foi avaliada a ligação da falooidina a diferentes quantidades de homogeneizadores (50-300 μg de proteína). (B) A ligação foi linear na faixa de 50-200 μg de proteína (R2 = 0,9602). (C) A dispersão a 540 nm foi utilizada para confirmar diferentes quantidades das amostras (R2 = 0,8319). Os dados são representados como média ± SEM (n=4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A faloidina liga-se a homogeneizadores de células inteiras do tecido cerebral humano pós-morte. (A) A retenção de falooidina em uma gama de quantidades de homogeneizadores (50-300 μg de proteína) foi avaliada. (B) A ligação com a faloideina foi encontrada linear na faixa de 50-200 μg de proteína (R2 = 0,8832). (C) A dispersão a 540 nm confirmou as quantidades variadas das amostras (R2 = 0,9730). Os dados são representados como média ± SEM (n=4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeitos da latrunculina A nos níveis de A-actin. O tratamento de homogeneizações cerebrais com o agente despolimerizador de actina Latrunculin A (2 μM, 1 h a 37°C) resultou em diminuição significativa nas quantidades de filamentos de actina em comparação com as respectivas amostras de controle tratadas simuladas, avaliadas pela retenção de fápio rotulado tanto em roedor (p = 0,0034; emparelhado t-testede duas caudas do aluno) (A) e tecidos humanos pós-morte (p = 0,0011; emparelhado t-teste de duascaudas) (B). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeitos da despolarização mediada por KCl em quantidades de F-actin em terminais sinápticos isolados. (A) Incubação de sinápstoses do cérebro de rato com 50 mM KCl para 30 s a 37°C estimulada polimerização de actina que resultou em um aumento na ligação de faloideina (p = 0,0014; emparelhado teste t-tdo aluno de duas caudas). (B) Um aumento menor também foi observado na fração sináptonista dos tecidos cerebrais humanos pós-morte (p = 0,014; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1. Efeitos da latrunculina A nos níveis totais de actina. Os homogeneizadores cerebrais foram incubados com latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) ou igual volume de DMSO (1 h a 37°C). Foram coletados 10 μg de proteína por amostra (latrunculin A tratado e controles tratados com mock- treated DMSO) antes da fixação. Os níveis totais de actina foram avaliados por imunoblotação. Manchas representativas são mostradas para homogeneizadores cerebrais de ratos (A) e humanos(C). Latrunculin A não alterou os níveis totais deactin em ambos os ratos (B; p = 0,40; emparelhado t-teste do aluno de duas caudas) e humano(D; p = 0,42; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como média ± SEM (n=3 pares). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2. Efeitos da despolarização mediada por KCl nos níveis de F-actin em sinátutos de ratos e sinapontorosos humanos. (A) Incubação de sinápstoses do cérebro de rato com 50 mM KCl (30 s a 37 °C) estimulada polimerização deactina e um consequente aumento na ligação de faloideina (p = 0,0019; emparelhado t-teste do aluno de duas caudas). (B) O aumento da retenção de falooidina também foi observado na fração sinatoneurosomal humana despolarizada pela LCI em comparação com os respectivos controles não estimulados (p = 0,015; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O ensaio aqui descrito, essencialmente adaptado de um estudo anterior30 com modificações, emprega uma falotoxina, phalloidina marcada com um rótulo fluorescente. Os análogos fluorescentes de faloidina são considerados o padrão-ouro para filamentos de actina de coloração em tecidos fixos47,48,49. Na verdade, são as ferramentas mais antigas para identificar especificamente os filamentosactin 50 e ainda permanecem os instrumentos mais utilizados para detectar filamentos de actina, particularmente para análises subsequentes baseadas em microscopia de fluorescência. É importante ressaltar que a faloidina tem sido demonstrada para manchar mesmo a malha irregular e solta de filamentos de ato curto51,indicando que a ligação de faloideina não depende do comprimento do filamento. Nosso protocolo, por outro lado, conta com espectroscopia de fluorescência para analisar a dinâmica da actina em amostras biológicas ex vivo, como tecidos cerebrais de roedores e humanos.
A maior vantagem do protocolo é que ele reduz consideravelmente o tempo necessário em relação aos protocolos existentes que primeiro requerem um isolamento bioquímico baseado em centrifugação de alta velocidade de F-actin (separação da G-actina com base na insolubilidade de filamentos de actina em certos detergentes como Triton X-100) e análise subsequente dos níveis imunoretivos usando manchas ocidentais6,28,29. A eficiência temporal do nosso ensaio também é uma vantagem no que diz respeito às técnicas de imunocitoquímica baseadas em falotoidina40,52, embora possa haver alguns outros benefícios associados a este último. Outra vantagem é que ele pode ser aplicado a tecidos cerebrais humanos pós-morte criopreservados, que são sempre associados a algum atraso pós-morte. Além disso, em relação ao protocolo original30 do qual essa metodologia foi modificada, reduzimos consideravelmente a exigência da quantidade de tecido de 1 mL cuvette para um único poço de uma placa de 96 poços. Além disso, devido à inclusão de uma curva padrão de falo em cada conjunto de experimentos, nosso protocolo pode quantificar níveis absolutos de filamentos actin em unidades de phalloidin bound (Figuras 2A-B, 3A, 4A-B; ver também Figura Suplementar 2), bem como os níveis relativos às amostras de controle(Figura 5A-B).
Deve-se notar que a aplicação da falooidina para avaliar os níveis de F-actin, no entanto, é restrita a células e amostras fixas, tanto para o nosso protocolo de ensaio quanto para protocolos baseados em microscopia. Isso porque a faloidina é essencialmente um heptapeptida bicíclico tóxico que se liga especificamente à interface entre subunidades F-actin com alta afinidade e estabiliza esses filamentos de actina, tornando-os incapazes de despomerizar e de fato aumentando a conversão líquida de G-actin em F-actin40,53,54. Assim, a fhalloidina estabiliza os filamentos actin in vivo e in vitro,podendo resultar em mudanças significativas no estado de equilíbrio da actina por si47,55. Como tal avaliação do status de polimerização de actina mediada por fhalloidina fluorescente baseia-se em estruturas de filamento presas. Além disso, devido à sua baixa permeabilidade através da bicamada lipídica, as metodologias baseadas em faloides dependem da permeabilização das células ou amostras biológicas. A inviávelibilidade de um ensaio de células vivas do curso de tempo é, portanto, uma grande limitação do protocolo, como acontece com métodos baseados em imunocitoquímica que empregam a falooidina.
A inviávelidade dos métodos baseados em falooidina para avaliar mudanças dinâmicas nos filamentos de actina em células não fixas vivas levanta a questão de se existem procedimentos alternativos para fazê-lo. De fato, avanços foram feitos a este respeito com a expressão exógena de análogos fluorescentes-actinas antes da análise usando protocolos como micrografia de vídeo36,56, recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP)38 ou fluorescência resonance energy transfer (FRET)39. A expressão heteróloga de peptídeos e proteínas marcadas fluorescentes que ligam filamentos de actina também são empregadas para estudar a dinâmica da actina em células vivas; no entanto, há desvantagens e limitações associadas a eles, bem como com a expressão heteróloga de ato fluorescente marcado em47,49,57. Por exemplo, g-actin que compreende 50-70% do total de actina na maioria das células é solúvel e livremente difusível no citosol, resultando em um fundo mais alto causando desafios na diferenciação de sinais de filamentos de actina especificamente57.
Um fator crítico no ensaio é que, como mostrado na Figura 2 e Figura 3; não é linear em toda a gama de quantidades de proteínas testadas. Assim, uma quantidade ideal de proteína adequada para o ensaio deve ser determinada primeiro ou a quantidade de analógico de falo deve ser ajustada de modo que não seja mais limitante (em maiores quantidades de proteínas). Outro aspecto crítico do protocolo é que as múltiplas etapas baseadas em centrifugação para a remoção de agente fixativo, permeabilização e phalloidina desvinculada podem levar à perda variada de proteínas (e f-actina ligada à fhalloidina) das amostras, particularmente quando quantidades menores de amostras são usadas. Por isso, é importante normalizar a quantidade de amostra retida por meio do monitoramento da dispersão de luz a 540 nm. Por fim, uma vez que actin está em um estado dinâmico de interconversão entre suas formas F e G, a fixação deve ser rápida. Um aspecto crítico menor relacionado ao ensaio é que não pudemos avaliar sua eficiência na avaliação da polimerização da actina farmacológica. Ao contrário da despolimerização farmacológica da actina por latrunculin A, jasplakinolide (um agente polimerizador de actina confiável e amplamente utilizado) tem locais de encadernação sobrepostos com fálica e inibe competitivamente sua vinculação aos filamentos de actina58,59. No entanto, o emprego de terminais sinápticos estimulados pela LCA como modelo ex vivo para o aumento da polimerização de actina indica que nosso ensaio também pode detectar aumentos nos níveis de F-actin.
Em conclusão, descrevemos um robusto ensaio de tempo eficiente e de alta produtividade para análise de filamentos de actina (F-actin) e suas alternâncias em estados fisiológicos e fisiofósicos adequados para um formato de placa de 96 poços. Em combinação com outros métodos existentes para avaliação do F-actin em amostras fixas e não fixadas, o protocolo provará ser uma ferramenta essencial em estudos relacionados à actina no campo da neurociência, bem como em outras áreas de pesquisa em ciências biológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Neurológica da Nova Zelândia (1835-PG), pelo Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia (#16-597) e pelo Departamento de Anatomia da Universidade de Otago, Nova Zelândia. Estamos em dívida com o Banco de Tecidos Neurológicos do HCB-IDIBAPS BioBank (Espanha) por tecidos cerebrais humanos. Agradecemos a Jiaxian Zhang por sua ajuda na gravação e edição do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
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