Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Abstract

Sitoskeletonun ana bileşeni olan Actin, nöronal yapı ve fonksiyonun korunmasında kritik bir rol oynar. Fizyolojik durumlar altında, aktin dengede iki şekilde meydana gelir: monomerik globüler (G-actin) ve polimerize filamentli (F- aktin). Sinaptik terminallerde, aktin sitoskeleton kritik pre-ve post-sinaptik fonksiyonların temelini oluşturur. Ayrıca, aktiin polimerizasyon durumundaki dinamik değişiklikler (globüler ve filamentli aktiin formları arasındaki interkonversiyon) sinaptik yapı ve işlevdeki plastisite ile ilgili değişikliklerle yakından bağlantılıdır. Burada, ex vivo koşullarda akinin polimerizasyon durumunu değerlendirmek için modifiye edilmiş floresan bazlı bir metodoloji rapor ediyoruz. Tahlil, özellikle aktüen filamentlere (F-actin) bağlanan ve polimerize filamentli aktinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayan bir phallotoxin olan floresan etiketli phalloidin'i kullanmaktadır. İlke kanıtı olarak, tahlillerin hem kemirgen hem de ölüm sonrası insan beyin dokusu homojenliklerinde uygunluğuna dair kanıt sunuyoruz. Latrunculin A (actin filamentlerini depolymerize eden bir ilaç) kullanarak, F-actin seviyelerindeki değişiklikleri izlemede tahlilin yararını onaylıyoruz. Ayrıca, tahlilleri izole sinaptik terminallerin biyokimyasal fraksiyonlarına genişletiyoruz, burada yüksek hücre dışı K+ile depolarizasyon ile uyarılma üzerine artan aktin polimerizasyonunu onaylıyoruz.

Introduction

Sitoskeletal protein aktin, yapısal destek, hücresel taşıma, hücre hareketliliği ve bölünme dahil olmak üzere birden fazla hücresel işlevde yer alır. Aktin dengede iki şekilde ortaya çıkar: monomerik globüler aktin (G-actin) ve polimerize filamentli aktin (F-actin). Akinin polimerizasyon durumundaki hızlı değişiklikler (G ve F formları arasındaki interkonversiyon) hızlı filament montajına ve sökülmesine neden olur ve hücresel fizyolojideki düzenleyici rollerinin altında yatmaktadır. Actin nöronal sitoskeletal yapının ana bileşenini oluşturur ve çok çeşitli nöronal fonksiyonları etkiler1,2. Not olarak, aktin sitoskeleton sinaptik terminallerin yapısal platformunun ayrılmaz bir parçasını oluşturur. Bu nedenle, sinaptik morfogenez ve fizyolojinin önemli bir belirleyicisidir ve sinapsların boyutunun, sayısının ve morfolojisinin kontrolünde temel bir rol oynar3,4,5. Özellikle, dinamik aksin polimerizasyon-depolimerizasyon, hafıza ve öğrenme süreçlerinin altında sinaptik plastisite ile ilişkili sinaptik yeniden şekillendirmenin önemli bir belirleyicisidir. Gerçekten de, hem presynaptik (nörotransmittersalınımı 6,7,8,9,10gibi) hem de postsinaptik fonksiyonlar (plastisite ile ilgili dinamik yeniden şekillendirme11,12,13,14)kritik olarak aktin sitoskeletonunun polimerizasyon durumundaki dinamik değişikliklere dayanır.

Fizyolojik koşullar altında, F-actin seviyeleri, posttranslational modifikasyon 4 ,15 , 16ve aksin bağlayıcı proteinler (ABP' ler)4,17 içeren multimodal bir yol ile dinamik ve sıkı bir şekilde düzenlenir. ABP'ler birden fazla düzeyde (polimerizasyonun başlatılması veya inhibe edilmesi, filament dallanmasının teşvik edilmesi, filamentlerin daha küçük parçalara kesilmesi, depolimerizasyonun teşvik edilmesi ve depolimerizasyona karşı koruma gibi) aksin dinamiklerini etkileyebilir ve sırayla çeşitli hücre dışı ve hücre içi sinyallere duyarlı sıkı bir modüler kontrol altındadır18, 19,20. Birden fazla düzeydeki bu tür düzenleyici kontroller, sinaptik sitoskeletondaki aktin dinamiklerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini, nöronal fizyolojinin hem bazal hem de aktivite kaynaklı durumlarda ince ayarlı ön ve postynaptik yönlerini belirler.

Aktinin nöronal fizyolojideki önemli rolleri göz önüne alındığında, çeşitli çalışmaların nörodejenerasyon, psikolojik hastalıklar ve nörogelişimsel rahatsızlıklar 3 , 21 , 22 ,23,24,25 , 26,27 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozukluklarla bağlantılı kritik patojenik olaylar olarak aksin dinamiklerindeki değişiklikler için kanıt sağlaması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aktin'in kilit rollerine işaret eden araştırma verilerinin zenginliğine rağmen, özellikle sinaptik sitoskeletonda aktin dinamikleri anlayışında hala önemli boşluklar devam etmektedir. Nöronal akinin ve patolojik koşullar altındaki değişimlerinin daha iyi anlaşılması için daha fazla araştırma çalışmasına ihtiyaç vardır. Bu bağlamda ana odak alanlarından biri aksin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesidir. Batı blotting tabanlı ticari kitler vardır (G-Actin/F-Actin in vivo tahlil biyokimyasal kiti; Cytoskeleton SKU BK03728,29) ve F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için ev yapımı tahliller6. Bununla birlikte, bunlar F-actin ve G-actin'in biyokimyasal izolasyonu gerektirdiğinden ve sonraki nicelemeleri immünblotting protokollerine dayandığından, zaman alıcı olabilirler. Burada, önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil, hem F-actin bazal seviyelerini hem de montaj sökümsünü dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilecek değişikliklerle rapor ediyoruz. Özellikle, 1 mL cuvette için uygun numuneleri mevcut 96 kuyu plakası formatına uygun numuneler gerektiren orijinal protokolü verimli bir şekilde değiştirdik. Bu nedenle modifiye edilen protokol, test için gerekli olan doku/numune miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Ayrıca, protokolün sadece beyin dokusu homojenatları için değil, aynı zamanda izole sinaptik terminaller (sinaptozomlar ve sinaptoneurozomlar) gibi hücre altı fraksiyonlar için de uygun olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Son olarak, test taze parçalanmış kemirgen beyin dokuları ve uzun süreli saklanan ölüm sonrası insan beyin örnekleri için kullanılabilir. Not olarak, test nöronal bağlamda sunulurken, onlarla ilişkili diğer hücre tiplerine ve fizyolojik süreçlere uygun şekilde genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel işlemler Otago Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Etik Kurulu'nun yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Etik Protokol No. AUP95/18 ve AUP80/17) ve Yeni Zelanda yasama organı. İnsan beyin dokuları, İspanya'nın Barselona kentindeki Clínic-IDIBAPS BioBank Hastanesi Nörolojik Doku Bankası'ndan elde edildi. Tüm doku toplama protokolleri Barselona'daki Clínic Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve ailelerden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Beyin dokusunun homojenizasyonu ve sinaptik terminallerin zenginleştirilmiş fraksiyonunun hazırlanması için aşağıdaki tamponları hazırlayın:
    Homojenizasyon tamponu: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M sakkaroz ile desteklenmiş
    Resüspenzyon tamponu: 5 mM Tris, 0,32 M sakkaroz ile desteklenmiş pH 7,4
    Yıkama tamponu: 5 mM Tris, pH 8.1
    1.2 M sakaroz
    1.0 M sakaroz
    0.85 M sakaroz
  2. Proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin ev yapımı veya ticari karışımını ekleyin.
    NOT: Komple Proteaz inhibitör karışımının (10 mL tampon başına 1 tablet) ve Fosfataz inhibitörü kokteyl IV'ün (1:100; hacim: hacim) EDTA içermeyen sürümünü kullandık.
  3. Phalloidinin sabitlenmesi, permeabilizasyonu ve bağlanması için aşağıdaki tamponları ve reaktifleri hazırlayın:
    Krebs tampon: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7.4
    1 M KCl
    %25 glutaraldehit (stok çözeltisi)
    % 0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaBH4 içeren Krebs tamponu
    DMSO'da 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin
    0.32 M sakkaroz içeren Krebs tamponu
    DMSO'da 50 μM latrunculin A (stok çözümü)
    1 M KCl (stok çözümü)
    DİkKAT: Phalloidin toksiktir (LD50 = 2 mg/kg) ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Glutaraldehitin solunması toksiktir ve bir duman kaputunda ele alınmalıdır.
  4. Tamponları 4 °C'de, phalloidin ve latrunculin A'yı ise -20 °C'de uzun süreli depolama için saklayın.
    NOT: Arabelleklerin uzun süreli depolanmasının önerilmez. Protokol burada duraklatılabilir.

2. Beyin dokusu homojenizasyonu

  1. Bir Potter-Elvehjem cam tüpünde ve buzda pestle içinde 10 cilt homojenizasyon tamponunda kriyoprezer korunmuş veya taze parçalanmış sıçan beyin dokusunu homojenize edin.
    NOT: Optimal homojenizasyon, beyin dokuları için elle 15-20 inme ile elde edilir. Başarılı homojenizasyon, süspansiyonun cam tüpten sorunsuz akışı ile doğrulanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
  2. Bradford tahlil31kullanarak homojenattaki protein konsantrasyonu belirleniyor.
    NOT: Protein tahmini için alternatif ev yapımı veya ticari tahliller de kullanılabilir.
  3. Krebs tamponunda homojenat örnekleri 50 μL hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda seyreltin.
    NOT: Bazı deneylerimizde, homojenleri 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A veya DMSO (kontroller) ile kuluçkaya yatırıyoruz. Bunun için homojenatlar 48 μL Krebs tamponunda yeniden sulanır ve 50 μM latrunculin A veya 2 μL DMSO'nun 2 μL'si eklenir. İmmünblotting için ayrıca, inkübasyondan sonra az miktarda örnek (10 μg) toplanır.
  4. Homojen örnekleri düzeltin (bölüm 5).

3. İzole sinir terminallerinin hazırlanması

  1. Sinaptozomların hazırlanması
    NOT: Sinaptozomlar için alternatif protokoller32,33 de kullanılabilir.
    1. Santrifüj beyin 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da homojendir.
    2. Ham nükleer fraksiyon olan peleni atın.
    3. 3.1.1 adımda elde edilen süpernatantı (S1) 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca daha fazla santrifüj edin.
    4. Çözünür sitozolitik fraksiyon olan süpernatantı (S2) çıkarın.
    5. Resüspensyon tamponunda ham sinaptozomal fraksiyon olan 3.1.3 adımında elde edilen peletin (P2) yeniden dürttü.
      NOT: Resüspenzyon tamponunun hacmi başlangıç dokusunun miktarına ve elde edilen pelet miktarına bağlıdır. Örneğin, 150-300 mg beyin dokusu ile başlarken, elde edilen pelet 200 μL resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılabilir.
    6. Yeniden canlanan ham sinaptozomları 0,85-1,0-1,2 M sakkaroz eşit hacimlerde yapılmış süreksiz bir sakkaroz gradyanı üzerine yükleyin.
      NOT: Tipik olarak sakkaroz çözeltisinin her biri için 1 mL kullanırız (150-300 mg doku için). Bu daha büyük doku miktarlarına göre değiştirilebilir. Süreksiz gradyanlar, ultracentrifuge tüpünün iç duvarına bastırılmış 25G şırıng ve sakkaroz katmanlarının yumuşak katmanları kullanılarak yapılabilir.
    7. 4 °C'de 2 saat için 85.000 x g'da santrifüj.
      NOT: Santrifüjlemenin yüksek hızı nedeniyle, ısıtmayı azaltmak için vakum oluşturabilen bir ultra merkezigül gereklidir.
    8. 200 μL pipet ucu kullanarak 1.0 ile 1.2 M sakkaroz arasındaki arayüzde sinaptozmal fraksiyonu toplayın.
    9. Sinaptozomal fraksiyonu 18.000 x g'da santrifüjleme ile buz gibi yıkama tamponu ile 4 °C'de 10 dakika yıkayın.
      NOT: Yıkama için, 1.0 ve 1.2 M sakkaroz arayüzünde elde edilen sinaptozmal fraksiyon taze bir 1.5 mL tüpte toplanır ve yüksek sakkarozun ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan eşit hacimde bir yıkama tamponu eklenir.
    10. Sinaptozomal peletı 12.000 g'da buz gibi homojenizasyon tamponu ile 4 °C'de 10 dakika tekrar yıkayın.
    11. Sinaptozomları buzdaki homojenizasyon tamponunda yeniden dirsintir.
      NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
    12. Bradford tahlilini kullanarak protein konsantrasyonu belirlen.
    13. Krebs tamponundaki sinaptozomları 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
      NOT: Resüspensiyon için, sinaptozomal fraksiyon ilk olarak 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürülür ve üst düğme (tampon) çıkarılır. Sinaptozomal pelet daha sonra 200 μL pipet ucu kullanılarak hafif pipetleme ile Krebs tamponunda yeniden sınıflandırılmıştır.
    14. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).
  2. Sinaptonürozomların hazırlanması
    NOT: Sinaptoneurozomlar için alternatif protokoller34,35 de kullanılabilir.
    1. Beyni homojenatı, 1 mL şırıngan kullanarak bir filtre tutucusunda 100 μm gözenek boyutunda önceden ıslanmış bir ağ filtresinden geçirin.
      NOT: Numune kaybını önlemek için tüm filtrelerin önceden ıslatılması önemlidir ve homojenizasyon tamponu kullanılarak yapılmalıdır. Bunun için homojenizasyon tamponu, tampon dışarı akana kadar filtre tutucusunda bulunan filtrelerden 1 mL şırıng kullanılarak geçirilir.
    2. Filtratı (F1) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
    3. İkinci filtrat (F2) elde etmek için F1 kesir için işlemi (adım 3.2.1 ve 3.2.2) tekrarlayın.
    4. F2 filtratı 5 μm gözenek boyutunda bir ağ filtresinden geçirin.
    5. Filtratı (F3) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte toplayın.
    6. Santrifüj filtrat F3 1,500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca.
    7. Krebs tamponundaki peleti (sinaptoneurozomlar) 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda buz üzerinde yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
      NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
    8. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu tahmin edin.
    9. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).

4. İzole sinaptik terminallerin KCl aracılı depolarizasyonu

  1. 5-10 dakika boyunca 37 °C'de eşkenel lipatokomlar/sinaptoneurozomlar.
  2. Hücre dışı K+ 'yı 37 °C'de 30 sn için 50 mM'ye çıkarmak ve ilgili uyarılmamış kontrol kümesine eşit hacimde Krebs tamponu eklemek için KCl ekleyerek sinaptozomları /sinaptoneurozomları uyarın.
    NOT: Örneğin, 47,5 μL Krebs arabelleğine yeniden harcanan sinaptozomlara 2,5 μL 1 M KCl ekleyin; ve ilgili uyarılmamış kontrol sinaptozomlarına 2,5 μL Krebs tamponu ekleyin. Çok sayıda örneğin yer aldığı deneyler için, depolarizasyon süresinin 30 s'yi geçmemesi için aynı anda en fazla 2 örnekle devam edin.
  3. Glutaraldehit ekleyerek stimülasyonu sonlandırın (bölüm 5).

5. Örneklerin fiksasyonu ve phalloidin lekelenmesi

  1. Homojenat/sinaptozomal/sinaptoneurosomal örneklere glutaraldehit ekleyin, oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca% 2,5'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: 50 μL numunede (homojenatlar/sinaptozomlar/sinaptoneurozomlar) glutaraldehitin son konsantrasyonunun %2,5 olması için 6 μL%25 glutaraldehit çözeltisi ekledik. Fiksasyon kritiktir ve hızlı olmalı ve bu nedenle glutaraldehit ekledikten hemen sonra, örnek güçlü bir şekilde girdaplanmalıdır.
  2. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
  3. Üsttekini çıkarın.
    NOT: Glutaraldehit toksik olduğu için süpernatantı duman kaputuna atın.
  4. Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaHB4 içeren 100 μL Krebs tamponunda resüspenzyon ile peleti dengele.
  5. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
  6. Geçirgenleştirme arabelleği kaldırılın.
  7. Peletin 200 μL Krebs tamponu ile 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.
  8. Peletin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 100 μL Krebs tamponunda 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (500 μU'ya karşılık gelir) ile yeniden depolayın ve lekeleyin.
    NOT: Floresan phalloidin analoglarının diğer çeşitleri ticari olarak mevcuttur ve test için değiştirilebilir. Phalloidin konsantrasyonu ve toplam inkübasyon örnek hacmi, test edilen doku/numune miktarına ve türüne göre değiştirilmek ve buna göre optimal koşullar standartlaştırılmalıdır.
  9. Lekeli numuneleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.
  10. İlişkisiz phalloidin 'i (süpernatant) çıkarın.
  11. Numuneyi 200 μL Krebs tamponu ile 20.000 x g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın.
  12. 0,32 M sakkaroz içeren 200 μL Krebs tamponunda yeniden diriltme.
    NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.

6. Florometrik analiz ve ışık saçılım

  1. Alexa Fluor 647 Phalloidin lekeli örnekleri siyah 96 kuyu plakasında dağıtin.
  2. Floresan yoğunluğunu 645 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve oda sıcaklığında bir plaka okuyucuda 670 nm emisyon dalga boyunda ölçün.
  3. 200 μL pipet uçları kullanarak numuneleri siyah 96 kuyu plakasından şeffaf 96 kuyu plakasına aktarın.
  4. Önceki sabitleme, permeabilizasyon ve boyama adımları sırasında meydana gelmiş olabilecek kayıpları düzeltmek için ışığın saçılmasını 540 nm olarak ölçün.
    NOT: Lekeli numunelerde tutulan biyolojik malzemedeki varyasyonlar, daha az miktarda başlangıç malzemesi için daha belirgin olabilir (bkz. Tartışma).
  5. Krebs tamponuna farklı konsantrasyonlarda bir dizi Alexa Fluor 647 Phalloidin ekleyin (0.05x, Standart eğri olarak testlerin her bir partisi için 25, 50, 125, 175, 250, 375 ve 500 μU'ya karşılık gelen 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x ve 1x.
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve özellikle F-actin düzeyleri göreceli olarak ifade edilirken tahlil sonuçlarını etkilemez (Bölüm 7). Protokol burada duraklatılabilir.

7. Veri analizi

  1. Numunelerdeki F-aktinin miktarı, bağlı phalloidin floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Etiketli phalloidin standardının doğrusal eğrisinden hesaplanan phalloidin bağlı birimlerinin mutlak cinsinden ifade.
    NOT: Örnek olarak, bkz.
  2. Kontrol örneklerinin bir kısmı olarak F-actin seviyelerini ifade edin.
    NOT: Örnek olarak, bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için test doğrusallığı
İlk olarak, Alexa Fluor 647 Phalloidin floresanında doğrusal artış için standart bir eğri tespit edildi ve her deney seti için tekrarlandı (Şekil 1). Tahlilin doğrusal aralığını araştırmak için kemirgenlerden (Şekil 2A ve 2B)ve ölüm sonrası insan deneklerden(Şekil 3A ve 3B)farklı miktarlarda beyin homojenliği işlenmiştir. Test, tutulan etiketli phalloidin miktarları ile değerlendirildiği gibi 50-200 μg protein aralığında doğrusal bulunmuştur. Farklı miktarda numuneyi doğrulamak için 540 nm'de ışık saçılım kullanıldı (Şekil 2C ve Şekil 3C).

Latrunculin, bir aktüer depolimerizasyon ajanı etiketli phalloidin bağlanmasını azaltır
Latrunculin A'nın actin filamentlerini depolymerize etmesi ve F-actin36 , 37,38,39seviyelerini azaltması bilinmektedir. Kemirgen veya insan beyin dokularından elde edilen homojenatlar, aktüer filamentlerini depolimerize etmek için 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A ile inkübe edildi. İlgili işlenmemiş kontrol setleri 37 °C'de 1 saat aynı süreyle DMSO ile inkübe edildi. Test, kontrol örneklerinde F-actin seviyelerinin kaybını 95.7 ± 6.6'dan (ortalama ± SEM) kemirgen beyin homojenatlarında latrunculin A ile tedavi edilen örneklerde 72.0 ± 3.2 (ortalama ± SEM) μU bağlı phalloidin μU'ya kadar güçlü bir şekilde ölçtü (Şekil 4A). İnsan beyin dokularından elde edilen homojenatlar latrunculin A tedavisine tabi tutulduğunda etiketli phalloidinin tutulmasında benzer bir azalma (83,7 ± 3,9'dan 66,9'a ±4,2μU) da gözlenmiştir ( Şekil 4B). İmmünblotting ile değerlendirilen dikkat çekici, toplam aktin seviyeleri, hem sıçanda(Ek Şekil 1A-B)hem de insanda ( EkŞekil 1C-D) beyin homojenlerinde latrunculin A ile tedavide değişmedi.

İzole sinaptik terminallerin depolarizasyonuaktüer polimerizasyonunu ve filament oluşumunu uyarır
İzole sinaptik terminallerin ex vivo depolarizasyonunun, aksin polimerizasyonu6, 30,40'ınhızlı uyarılmasıyla sonuçlandığını göstermiştir ve bu fenomen burada bildirilen tahlilin daha fazla teyidi olarak kullanılmıştır. Sinaptik terminallerde zenginleştirilmiş biyokimyasal fraksiyonlar iki farklı şekilde hazırlanmıştır; "Sinaptozomlar" elde etmek için gradyan tabanlı ultrasantrifüjleme yöntemi41,42,43,44 ve sıralı filtrasyon tabanlı bir protokol elde etmek için "sinaptonürosomes"43,45,46. İkincisi için verim daha yüksek olduğu için, doku miktarlarının genellikle sınırlandığı insan ölüm sonrası beyin dokuları için kullandık. Öte yandan, sıçan beyin dokusu deneylerimiz için sinaptik parçaların41 zenginleştirilmesi daha yüksek dereceye sahip sinaptozomları kullanmayı tercih ettik.

Sinaptozomların veya sinaptoneurozomların depolarizasyonu ve aksin polimerizasyonunun uyarılması, hücre dışı K+ ila 50 mM'de kısa (30 saniye) bir artış patlaması ile elde edildi. KCl maruziyeti, kemirgen beyin sinaptozomlarında ilgili mock-uyarılmış kontrollere kıyasla neredeyse% 40 oranında phalloidin bağlanmasına neden oldu (Şekil 5A; ayrıca bkz. Ek Şekil 2A). Daha küçük (%20 civarında) ancak KCl ile tedavi edilen insan sinaptonürozomlarında da tutarlı bir artış gözlenmiştir (Şekil 5B; ayrıcabkz. Bu deneyler, izole sinaptik terminaller de dahil olmak üzere beyin dokusu örneklerinde F-aktüer seviyelerindeki değişiklikleri belirlemede testimizin sağlamlığını doğrular.

Figure 1
Şekil 1. Alexa Fluor 647 Phalloidin floresan için standart eğri.  Farklı miktarlarda (25-500 μU) etiketli phalloidin floresan emisyonunun doğrusallığı, floresan spektroskopisi ile 645 nm'lik bir ekstrüzyonda ve 670 nm'lik bir emisyonla doğrulandı (R2 = 0.9942). Veriler ortalama ± SEM (n=3) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Sıçan beyin dokusundan tüm hücre homojenlerine penisoidin bağlanmasının doğrusallığı.  (A) Phalloidinin farklı miktarlarda homojenatlara (50-300 μg protein) bağlanması değerlendirildi. (B) Bağlama 50-200 μg protein aralığında doğrusaldı (R2 = 0.9602). (C) Numunelerin farklı miktarlarını doğrulamak için 540 nm'de saçılma kullanıldı (R2 = 0.8319). Veriler ortalama ± SEM (n=4) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Ölüm sonrası insan beyin dokusundan tüm hücre homojenlerine phalloidin bağlanması.  (A) Çeşitli miktarlarda (50-300 μg protein) phalloidin tutulması değerlendirildi. (B) Phalloidin bağlanmasının 50-200 μg protein aralığında doğrusal olduğu bulunmuştur (R2 = 0.8832). (C) 540 nm'de saçılma, numunelerin değişen miktarlarını doğruladı (R2 = 0.9730). Veriler ortalama ± SEM (n=4) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Latrunculin A'nın F-actin seviyeleri üzerindeki etkileri.  Beyin homojenatlarının aktilyimerleştirici ajan Latrunculin A (2 μM, 1 h at 37°C) ile tedavisi, kemirgende etiketli phalloidin tutulması ile değerlendirilen ilgili sahte işlem görmüş kontrol örneklerine kıyasla akren filamentlerinin miktarlarında önemli bir azalmaya neden oldu (p = 0.0034; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi) (A) ve ölüm sonrası insan dokuları (p = 0.0011; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi) (B). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. KCl aracılı depolarizasyonun izole sinaptik terminallerde F-aktilon miktarları üzerindeki etkileri.  (A) 37 °C'de 30 s uyarılmış aktiin polimerizasyonunda 50 mM KCl ile sıçan beyninden sinaptozomların inkübasyonu, sonuç olarak phalloidin bağlanmasında bir artışa neden oldu (p = 0.0014; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test). (B) Ölüm sonrası insan beyin dokularından sinaptoneurosomal fraksiyonda da daha küçük bir artış gözlenmiştir (p = 0.014; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 1. Latrunculin A'nın toplam akredin seviyeleri üzerindeki etkileri.  Beyin homojenatları latrunculin A (2 μM, 37°C'de 1 saat) veya eşit hacimde DMSO (37°C'de 1 saat) ile inkübe edildi. Sabitlemeden önce numune başına 10 μg protein (latrunculin A işlenmiş ve DMSO mock-işlemli kontroller) toplanmıştır. Toplam aktiin düzeyleri immünblotting ile değerlendirildi. Sıçan (A) ve insan (C) beyin homojenatları için temsili lekeler gösterilir. Latrunculin A, hem sıçan(B; p = 0.40; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test) hem de insan (D; p = 0.42; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test) beyin homojenatlarındaki toplam aktüer seviyelerini değiştirmedi. Veriler ortalama ± SEM (n=3 çift) olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2. KCl aracılı depolarizasyonun sıçan sinaptozomlarında ve insan sinaptonüromlarında F-aktüer seviyeleri üzerindeki etkileri.  (A) 50 mM KCl (37 °C'de 30 sn) ile sıçan beyninden sinaptozomların inkübasyonu aktisin polimerizasyonunu ve bunun sonucunda phalloidin bağlanmasında bir artışa neden oldu (p = 0.0019; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi). (B) Phalloidin tutulmasında artış, KCl tarafından depolarize edilen insan sinaptoneurosomal fraksiyonunda da ilgili uyarılmamış kontrollere göre gözlenmiştir (p = 0.015; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan test, esasen değişikliklerle önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış, floresan etiketle etiketlenmiş bir phallotoxin, phalloidin kullanmaktadır. Floresan phalloidin analogları sabit dokularda akrin filamentlerinin boyanmasının altın standardı olarak kabul edilir47,48,49. Aslında, özellikle actin filamentleri50'yi tanımlamak için en eski araçlardır ve özellikle sonraki floresan mikroskopi tabanlı analizler için aksin filamentlerini tespit etmek için hala en yaygın kullanılan araçlar olmaya devam etmektedir. Daha da önemlisi, phalloidin'in kısa aktüen filamentlerin51'ingevşek, düzensiz meshwork'lerini bile lekelediği gösterilmiştir, bu da phalloidin bağlanmasının filament uzunluğuna bağlı olmadığını gösterir. Öte yandan protokolümüz, örneğin kemirgenlerden ve insanlardan gelen beyin dokuları gibi ex vivo biyolojik örneklerdeki akin dinamiklerini analiz etmek için floresan spektroskopisine dayanmaktadır.

Protokolün en büyük avantajı, F-actin'in yüksek hızlı santrifüj bazlı biyokimyasal izolasyonunu (Triton X-100 gibi belirli deterjanlardaki aktin filamentlerinin çözünmezliğine dayanarak G-actin'den ayrılma) ve daha sonra Batı blotting 6 , 28,29kullanarak immünoreaktif seviyelerin analizini gerektiren mevcut protokollerle ilgili olarak geçen süreyi önemli ölçüde azaltmasıdır. Tahlilimizin zaman verimliliği, phalloidin bazlı immünosimya teknikleri açısından da bir avantajdır40,52, ikincisi ile ilişkili başka faydalar da olabilir. Diğer bir avantaj, satın alınması her zaman bazı ölüm sonrası gecikmelerle ilişkili olan kriyoprezer korunmuş ölüm sonrası insan beyin dokularına uygulanabilmesidir. Ayrıca, bu metodolojinin değiştirildiği orijinal protokol30 ile ilgili olarak, doku miktarı gereksinimini 1 mL cuvette'den 96 kuyu plakasının tek bir kuyusuna önemli ölçüde azalttık. Ayrıca, her deney kümesine bir phalloidin standart eğrisinin dahil edilmesi nedeniyle, protokolümüz phalloidin bağlı birimlerinde mutlak aktüer filament seviyelerini nicel hale getirebilir (Şekil 2A-B, 3A, 4A-B; ayrıca bkz.

Bununla birlikte, F-akrin seviyelerini değerlendirmek için phalloidin uygulamasının, hem tahlil protokolümüz hem de mikroskopi tabanlı protokoller için sabit hücreler ve örneklerle sınırlı olduğu belirtilmelidir. Bunun nedeni, phalloidin'in esasen özellikle yüksek benzeşimli F-actin alt biraları arasındaki arayüze bağlanan ve bu aktüer filamentleri stabilize eden, depolimerize edilemez hale getiren ve aslında G-actin'in net dönüşümünü F-actin 40,53,54'eartıran toksik bir bisiklik heptapeptid olmasıdır. Bu nedenle, phalloidin in vivo ve in vitroactin filamentleri stabilize eder ve se başınaactin denge durumunda önemli değişikliklere neden olabilir47,55. Floresan phalloidin aracılı aktiin polimerizasyon durumunun bu şekilde değerlendirilmesi, tutuklanan filament yapılara dayanmaktadır. Ayrıca, lipid bilayer yoluyla düşük geçirgenliği nedeniyle, phalloidin bazlı metodolojiler hücrelerin veya biyolojik örneklerin permeabilizasyonuna dayanır. Bir zaman kursu canlı hücre tahlilinin mümkünluğu, bu nedenle phalloidin kullanan immünosistimya bazlı yöntemlerde olduğu gibi protokolün önemli bir sınırlamasıdır.

Canlı düzeltilmemiş hücrelerdeki aktüan filamentlerindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için phalloidin bazlı yöntemlerin imkansızlığı, bunu yapmak için alternatif prosedürler olup olmadığı sorusunu akla getiriyor. Nitekim, fotobleaching (FRAP)38 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET)39gibi protokoller kullanılarak video mikrografi36 , 56,floresan kurtarma gibi protokollerkullanılarak analizden önce floresan-akrin analoglarının eksojen ekspresyonu ile bu konuda ilerlemeler yapılmıştır. Canlı hücrelerde aktin dinamiklerini incelemek için floresan etiketli peptitlerin ve aktin filamentlerini bağlayan proteinlerin heterolog ifadesi de kullanılır; bununla birlikte, floresan etiketli actin47 , 49,57'nin heterolog ifadesiyle olduğu kadar, bunlarla ilgili dezavantajlar ve sınırlamalar da vardır. Örneğin, çoğu hücredeki toplam aktin% 50-70'ini oluşturan G-actin, sitozolde çözünür ve serbestçe difüze edilebilir, bu da daha yüksek bir arka planla sonuçlanır ve özellikle aktin filamentlerinden sinyalleri ayırt etmede zorluklara neden olur57.

Testte kritik bir faktör, Şekil 2 ve Şekil 3'tegösterildiği gibi ; test edilen protein miktarları boyunca doğrusal değildir. Bu nedenle, önce teste uygun optimal miktarda protein belirlenmeli veya phalloidin analog miktarı artık sınırlayıcı olmayacak şekilde (daha yüksek miktarlarda proteinlerde) ayarlanmalıdır. Protokolün bir diğer kritik yönü, fiksatif, permeabilizasyon ajanı ve ilişkisiz phalloidinin uzaklaştırılması için çoklu santrifüj bazlı adımların, özellikle daha düşük miktarlarda numune kullanıldığında, numunelerden çeşitli protein kaybına (ve F-aksin bağlı phalloidin) yol açabileceğidir. Bu nedenle, 540 nm'de ışık saçılımını izleyerek tutulan numune miktarını normalleştirmek önemlidir. Son olarak, actin F ve G formları arasında dinamik bir interkonversiyon durumunda olduğundan, sabitleme hızlı olmalıdır. Tahlil ile ilgili küçük bir eleştirel yönü, farmakolojik aksin polimerizasyonunu değerlendirirken verimliliğini değerlendirememiş olmamızdır. Latrunculin A tarafından farmakolojik aktin depolymerizasyonunun aksine, jasplakinolid (güvenilir ve yaygın olarak kullanılan bir aktin polimerizasyon ajanı) phalloidin ile çakışan bağlama bölgelerine sahiptir ve aktin filamentlerine bağlanmasını rekabetçi bir şekilde engeller58,59. Bununla birlikte, KCl uyarılmış sinaptik terminallerin artan aksin polimerizasyonu için bir ex vivo model olarak istihdam edilmesi, testimizin F-actin seviyelerindeki artışları da tespit edebildiğine işaret eder.

Sonuç olarak, 96 kuyu plakası formatına uygun fizyolojik ve patofizyolojik durumlarda akrin filamentlerinin (F-actin) ve alternatiflerinin analizi için sağlam bir zaman verimli ve yüksek verimli test açıklıyoruz. Sabit ve düzeltilmemiş örneklerde F-actin'in değerlendirilmesi için mevcut diğer yöntemlerle birlikte, protokol nörobilim alanındaki aksin ile ilgili çalışmalarda ve biyolojik bilim araştırmalarının diğer alanlarında önemli bir araç olduğunu kanıtlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Yeni Zelanda Nörolojik Vakfı (1835-PG), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi (#16-597) ve Yeni Zelanda Otago Üniversitesi Anatomi Bölümü tarafından desteklendi. İnsan beyin dokuları için HCB-IDIBAPS BioBank (İspanya) Nörolojik Doku Bankası'na borçluyuz. Jiaxian Zhang'a videonun kaydedilip düzenlenmesindeki yardımı için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Tags

Geri çekme Sayı 172 sinaptozomlar sinaptoneurozomlar F-aktin sitoskeleton depolarizasyon latrunculin A phalloidin floresan
Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient… More

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter