Summary
我们报告了一种简单、省时和高通量荧光光谱分析，用于从啮齿动物和人类受试者脑组织 中对 活体细丝进行定量。
Abstract
Actin 是细胞骨骼的主要成分，在维持神经元结构和功能方面起着至关重要的作用。在生理状态下，行为素以两种形式以平衡形式发生：单体球状（G-actin）和聚合丝（F-actin）。在突触终端，作用细胞细胞细胞形成关键突触前和突触后功能的基础。此外，作用素聚合状态的动态变化（球状和细丝形式的作用之间的转换）与突触结构和功能的可塑性相关变化密切相关。我们在这里报告一种基于荧光的修改方法，以评估 前体内 环境中作用素的聚合状态。该检测采用荧光标签的法洛丁，一种法洛托辛，专门结合到作用丝（F-actin），提供聚合丝活性蛋白的直接测量。作为原则的证明，我们为在啮齿动物和死后人类脑组织同质化中进行检测的适用性提供了证据。使用拉特伦库林A（一种使肌细丝脱聚的药物），我们确认该检测在监测F-actin水平变化方面的作用。此外，我们扩展检测到分离突触终端的生化部分，其中我们确认通过高细胞外 K+去极化刺激刺激时增加作用素聚合。
Introduction
细胞骨质蛋白作用素涉及多种细胞功能，包括结构支持、细胞传输、细胞动力和分裂。Actin 以两种形式以均衡形式发生：单体球状作用素 （G-actin） 和聚合丝作用素 （F-actin）。actin的聚合状态（其G-和F-形式之间的互通）的快速变化导致快速的丝组装和拆卸，并成为其细胞生理学调控作用的基础。Actin是神经元细胞骨结构的主要组成部分，影响广泛的神经元功能1，2。值得注意的是，细胞球菌的作用是突触终端结构平台的组成部分。因此，它是突触形态形成和生理学的主要决定因素，在控制突触3、4、5的大小、数量和形态方面起着基础性作用。特别是，动态作用聚合-去聚合是与记忆和学习过程背后的突触可塑性相关的突触重塑的关键决定因素。事实上，前突性（如神经递质释放6，7，8，9，10）和后突体功能（可塑性相关的动态改造11，12，13，14）都严重依赖于在细胞细胞细胞顿的聚合状态的动态变化。
在生理条件下，F-actin水平通过多式联运途径进行动态和严格调节，包括后翻译修饰4、15、16以及活性结合蛋白（ABPs）4、17。ABP 可以影响多个级别的活性动力学（如启动或抑制聚合、诱导丝分枝、将细丝分离到较小的碎片、促进去聚合和防止脱聚），并依次在对各种细胞外信号敏感的严格调制控制下18、19、20。这种多层次的监管检查要求对突触细胞细胞细胞的活性动力学进行严格监管，在基础和活动诱发状态下对神经元生理学的前期和后突触方面进行微调。
鉴于行为素在神经元生理学中的重要作用，一些研究提供了证据，证明行为动力学的改变与各种神经系统疾病有关，包括神经退化、心理疾病以及神经发育疾病3、21、22、23、24、25、26、27等。然而，尽管大量的研究数据表明作用在神经元生理学和病理生理学中的关键作用，但在对行为动力学的理解上，特别是在突触细胞细胞细胞学方面，仍然存在着重大差距。需要更多的研究来更好地了解神经元作用及其在病理条件下的改变。在这方面，一个主要的重点领域是评估作用物聚合状态。有西方印迹为基础的商业套件（G-Actin/F-Actin在体内测定生化套件;赛托斯凯尔顿SKO BK03728，29）和自制的检测评估F-actin水平6。然而，由于这些需要F-actin和G-actin的生化分离，并且由于它们随后的定量基于免疫凝固协议，因此它们可能非常耗时。我们这里报告一个荧光光谱为基础的检测，改编自先前的研究30与修改，可用于评估F-actin的基础水平，以及其组装拆解的动态变化。值得注意的是，我们已经有效地修改了原来的协议，要求样品适合1 mL的cuvette到目前的96井板格式。因此，修改后的方案显著减少了检测所需的组织/样本量。此外，我们提供证据表明，该协议不仅适用于脑组织同质化，还适用于细胞下部分，如分离突触终端（突触体和突触体）。最后，该检测可用于刚解剖的啮齿动物脑组织和长期储存的死后人类大脑样本。值得注意的是，虽然测定是在神经元环境中呈现的，但它可以适当地扩展到与之相关的其他细胞类型和生理过程。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验程序均按照奥塔哥大学保护和使用实验室动物道德委员会的规定进行（道德议定书第1号）AUP95/18 和 AUP80/17）和新西兰立法机构。人脑组织是从西班牙巴塞罗那的Clénic-IDIBAPS生物库的神经组织库获得的。所有组织收集协议均得到巴塞罗那克莱尼奇医院道德委员会的批准，并征得家属的知情同意。
1. 准备缓冲器和试剂
- 为脑组织的同质化和合成终端的丰富部分的准备下列缓冲器：
同质化缓冲：5米高，pH 7.4，辅以0.32米蔗糖
悬念缓冲：5米三轮车，pH 7.4补充0.32米蔗糖
洗涤缓冲区：5米三轮车，pH 8.1
1.2 米蔗糖
1.0 米蔗糖
0.85 米蔗糖 - 添加蛋白酶和磷酸盐抑制剂的自制或商业组合。
注意：我们使用了EDTA免费版本的全蛋白酶抑制剂混合（每10毫升缓冲器1片）和磷酸盐抑制剂鸡尾酒IV（1：100;体积：体积）。 - 准备以下缓冲器和试剂，用于修复、渗透和结合法洛丁：
克雷布斯缓冲区： 118.5 m NaCl， 4.7 mM KCl， 1.2 mM MgCl2，2 mM 卡Cl2，0.1 mM KH2PO4，5 m 纳米纳赫科3，10 mM 葡萄糖， 20 mM HEPES， pH 7.4
1 M 千克
25% 谷氨酸醛（库存溶液）
包含 0.1% 特里顿 X-100 和 1 毫克/mL 纳布4的克雷布斯缓冲区
400x 亚历克萨氟 647 法洛丁在 DMSO
含有 0.32 M 蔗糖的克雷布斯缓冲区
DMSO 中的 50μM 拉特伦库林 A （库存解决方案）
1 M KCl（库存解决方案）
注意：法罗丁是有毒的（LD50 = 2 毫克/千克），必须小心处理。吸入谷氨酸是有毒的，应该用烟灰罩处理。 - 将缓冲区存储在 4 °C 和法勒丁和拉特伦库林 A 在 -20 °C 进行长期存储。
注：不建议长期存储缓冲区。协议可在此处暂停。
2. 脑组织同质化
- 在波特-埃尔韦杰姆 玻璃管中，将冷冻保存或刚解剖的老鼠脑组织同质化，在10卷同质化缓冲器中，并在冰上缠虫。
注：最佳均质化是通过手动15-20次脑组织毛刺达到的。通过玻璃管悬架的平稳流动可以确认成功同质化。协议可在此处暂停。 - 使用布拉德福德检测31确定同质体中的蛋白质浓度。
注意：也可以使用替代自制或商业检测蛋白质估计。 - 在 Krebs 缓冲区中稀释同质样品，浓度为 2-3 毫克蛋白质/mL，体积为 50 μL。
注意：在我们的一些实验中，我们用2μM拉特伦库林A或DMSO（控制）在37°C的1小时孵育同质物。为此，在 48 μL 的 Krebs 缓冲器中恢复同质化，并添加 2 μL 的 50 μM 拉特伦库林 A 或 2 μL DMSO。此外，为了进行免疫凝血，在孵化后收集少量样本（10微克）。 - 修复同质样本（第 5 节）。
3. 准备孤立的神经末梢
- 合成体的准备
注：也可以使用突触体的替代协议32，33。- 离心机大脑在 1，200 x g 中均质，在 4 °C 下 10 分钟。
- 丢弃颗粒，这是粗糙的核分数。
- 进一步离心超自然 （S1） 获得步骤 3.1.1 在 12，000 x g 15 分钟在 4 °C.
- 去除超自然（S2），这是可溶性细胞质分数。
- 重新悬念步骤 3.1.3 获得的颗粒 （P2），这是悬念缓冲中的粗突触体分数。
注：悬念缓冲器的体积取决于启动组织的数量和获得的颗粒量。例如，当从150-300毫克脑组织开始时，获得的颗粒可以在200μL的悬念缓冲中恢复。 - 将再悬储的原油突触体装载到等量为 0.85-1.0-1.2 M 蔗糖的不连续蔗糖梯度上。
注意：我们通常使用1mL每个蔗糖溶液（150-300毫克组织）。这可以根据较大的组织量进行更改。使用25G注射器压在超中量管内壁和蔗糖层的温和分层，可以进行不连续的梯度。 - 离心机在 85，000 x g 2 小时在 4 °C。
注：由于离心速度高，需要一种能够制造真空以减少加热的超中心燃料。 - 使用 200 μL 管道尖端收集界面上 1.0 至 1.2 M 蔗糖的突触体分数。
- 用离心机在 18，000 x g 的冰冷洗涤缓冲器中清洗突触体部分，在 4 °C 下 10 分钟。
注意：对于洗涤，在 1.0 和 1.2 M 蔗糖接口获得的突触体分数收集在一个新的 1.5 mL 管中，并添加等量的洗涤缓冲，确保从介质中去除高蔗糖。 - 再次用冰冷的同质化缓冲器在 12，000 克下清洗突触体颗粒，在 4 °C 下 10 分钟。
- 在冰上同质化缓冲器中补充突触体。
注：协议可在此处短暂暂停。 - 使用布拉德福德检测确定蛋白质浓度。
- 在 Krebs 缓冲器中以 2-3 毫克蛋白质/mL 的浓度在 50 μL 的体积中补充突触体（如果突触体要被 KCl 去极化，则为 47.5 μL;见第 4 节）。
注意：对于悬念，突触体分数在 4 °C 下以 12，000 x g 首次旋转 5 分钟，并去除超自然（缓冲区）。然后，通过使用 200 μL 管道尖端轻轻吹管，在 Krebs 缓冲器中重新填充突触体颗粒。 - 继续去极化（第4节）。
- 合成子神经体的制备
注：也可以使用突触体的替代协议34，35。- 使用 1 mL 注射器在滤芯支架中通过 100μm 孔径大小的预湿网过滤器将大脑均质化。
注意：所有过滤器的预润湿对于避免样品丢失非常重要，应使用均质化缓冲区进行。为此，使用 1 mL 注射器通过滤镜支架中的滤镜，实现均质化缓冲，直到缓冲器流出。 - 在冰上预冷的 1.5 mL 管中收集滤滤片 （F1）。
- 重复流程（步骤 3.2.1 和 3.2.2）为 F1 分数获得第二个滤滤 （F2）。
- 通过 5μm 孔径大小的净滤镜传递 F2 过滤。
- 在冰上预冷的 1.5 mL 管中收集滤滤（F3）。
- 离心机过滤 F3 在 1，500 x g 10 分钟在 4 °C。
- 在冰上以浓度为2-3毫克蛋白质/mL的克雷布斯缓冲区中补充颗粒（突触体），体积为50微升（如果突触体被KCl去极化，为47.5微升;见第4节）。
注：协议可在此处短暂暂停。 - 使用布拉德福德检测来估计蛋白质浓度。
- 继续去极化（第4节）。
- 使用 1 mL 注射器在滤芯支架中通过 100μm 孔径大小的预湿网过滤器将大脑均质化。
4. KCl 调解的分离突触终端的去极化
- 平衡突触体/突触体在37°C 5-10分钟。
- 通过添加 KCl 将细胞外 K+ 增加到 50 mM，在 37 °C 时将 30 s 的突触体/突触体体位增加，并将等量的 Krebs 缓冲器添加到各自未刺激的控制集中。
注意：例如，在 47.5 μL 的克雷布斯缓冲区中，将 2.5μL 的 1 M KCl 添加到突触体中：并将 2.5 μL 的 Krebs 缓冲区添加到各自未刺激的控制突触体中。对于涉及大量样品的实验，每次不超过2个样本，使去极化时间不超过30s。 - 通过添加谷氨酸终止刺激（第5节）。
5. 样品的固定和法乐丁染色
- 在室温下将谷氨酰醛添加到同质化/突触体/突触样本中，最终浓度为2.5%，为2-3分钟。
注：我们添加了6微升25%的谷氨酸醛溶液，使50微L样品中谷胱甘肽的最终浓度（同源物/突触体/突触体）为2.5%。固定是至关重要的，应该快速，因此在添加谷胱甘肽后，样品应立即大力漩涡。 - 沉积样品在20，000 x g 5分钟。
- 去除超自然。
注意：将超物质丢弃在烟灰罩中，因为谷胱甘肽是有毒的。 - 在 100 μL 的 Krebs 缓冲器中通过悬念使颗粒渗透，其中含有 0.1% Triton X-100 和 1 毫克/mL NaHB4， 在室温下为 2-3 分钟。
- 沉积样品在20，000 x g 5分钟。
- 取下渗透缓冲区。
- 用200μL的克雷布斯缓冲器在离心机下用20，000 x 克清洗颗粒5分钟。
- 在室温下，在 100 μL 的 Krebs 缓冲器中，用 1x Alexa 氟 647 法洛丁（对应 500 μU） 重新填充和弄脏颗粒，在黑暗中 10 分钟。
注：其他品种的荧光法洛丁类比是商业上可用的，可以替代的检测。法乐蛋白的浓度和总的孵化量可能需要根据所测试的组织/样品的数量和类型进行修改，并相应地标准化最佳条件。 - 将染色样品在20，000 x g中分化5分钟。
- 去除未绑定的法勒丁（超自然）。
- 通过离心处理200μL的克雷布斯缓冲器，在20，000 x 克下清洗样品5分钟。
- 在含有0.32M蔗糖的克雷布斯缓冲液的200μL中重新喷出。
注：协议可在此处短暂暂停。
6. 荧光分析和光散射
- 在黑色 96 井板中分配亚历克萨氟 647 法洛丁染色样品。
- 在室温下，在板读卡器中测量激发波长为 645 nm 和发射波长为 670 nm 的荧光强度。
- 使用 200 μL 管道尖端将样品从黑色 96 井板转移到透明 96 井板。
- 测量在 540 nm 下散射的光，以纠正在固定、渗透和染色前几步可能发生的任何损失。
注意：对于少量起始材料，污渍样品中保留的生物材料的变化可能更为突出（参见讨论）。 - 包括一套亚历克萨氟647法洛丁在克雷布斯缓冲区在不同浓度（0.05倍， 每批检测为标准曲线的 0.1 倍、0.25 倍、0.35 倍、0.75 倍、0.5 倍和 1 倍，相当于 25、50、125、175、250、375 和 500μU）。
注意：这是一个可选的步骤，不会影响检测结果，特别是当 F-actin 水平以相对方式表示时（第 7 节）。协议可在此处暂停。
7. 数据分析
- 样品中的F-actin量与绑定法洛丁的荧光强度成正比。用标记的法勒丁标准的线性曲线计算的法勒丁绑定单位的绝对值表示。
注：例如，请参阅图 2A-B、3A、4A-B和补充图 2。 - 将 F-actin 水平作为控制样本的一小部分。
注：例如，请参阅图 5A-B。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F-actin 水平评估的检测的线性
首先，确定了亚历克萨荧光647法洛丁荧光线性增加的标准曲线，并重复了每组实验（图1）。为了调查检测的线性范围，处理了不同数量的大脑同质性，从啮齿动物（图2A和2B）和死后人类受试者（图3A和3B）。检测结果发现，该检测在50-200微克蛋白质范围内是线性的，通过保留的标记法洛丁量进行评估。在540纳米处散射的光用于确认不同数量的样品（图2C和图3C）。
拉特伦库林， 一种行为脱聚剂， 减少标签法利丁的绑定
拉特伦库林A是众所周知的去聚合行为丝和减少F-actin36，37，38，39的水平。来自啮齿动物或人类脑组织的同质物在37°C下用2μM拉特伦库林A孵育1小时，以去聚肌细丝。在 37 °C 的相同持续时间内，使用 DMSO 孵育了相应的未经处理的控制集。 该检测有力地测量了对照样本中F-actin水平的损失，从对照样本中的95.7±6.6（平均±SEM）到3.2（平均 ±±SEM）μU在鼠脑同质性（图4A）中受约束的phalloidin。当人类脑组织中的同质素受到拉修剪素A治疗时，也观察到在保留标记的巴霍丁方面，保留标记的巴霍丁的降幅（从83.7 ±±3.9降至66.9（图4B）。值得注意的是，通过免疫凝血评估，总作用素水平在治疗大鼠（补充图1A-B）和人（补充图1C-D）大脑均质后没有变化。
分离突触终端的去极化刺激作用聚合和细丝形成
分离突触终端的外活脱极化已被证明导致活性聚合6，30，40的快速刺激，这种现象被用作进一步确认此处报告的检测结果。在突触终端中浓缩的生化分数以两种不同的方式准备：基于梯度的超中心化方法，以获得"突触体"41，42，43，44和顺序过滤为基础的协议，以获得"突触体"43，45，46。由于后者的产量较高，我们将其用于人体死后脑组织，其中组织数量经常受到限制。另一方面，我们更倾向于使用突触体与更高程度的突触片段41的丰富度用于我们的大鼠脑组织实验。
突触体或突触体的去极化和作用素聚合的刺激是通过细胞外K+ 到50m的短暂（30秒）爆发实现的。与各自的模拟刺激对照组（图5A：另见 补充图2A）相比，KCl暴露导致啮齿类脑突触体中的巴洛丁结合增加近40%。较小的（约20%）但在接受KCl治疗的人类突触体中也观察到持续增加（图5B：另见 补充图2A）。这些实验验证了我们检测的稳健性，以确定脑组织样本（包括分离突触终端）中F-actin水平的变化。
图1。亚历克萨荧光647法洛丁荧光的标准曲线。 荧光光谱仪在激发645纳米和670 nm（R 2 = 0.9942）时确认了不同量（25-500 μU）的荧光发射的线性。数据表示为平均± SEM （n=3）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。与大鼠脑组织中的全细胞同质素结合的巴霍林的线性。 （A） 评估了巴霍林与不同数量的同质物质（50-300μg蛋白质）的结合。（B） 结合在 50-200 μg 蛋白质 （R2 = 0.9602） 范围内是线性的。（C） 散射在 540 nm 用于确认不同数量的样品 （R2 = 0.8319）。数据表示为平均± SEM （n=4）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。法罗丁与死后人类脑组织产生的全细胞同质素结合。 （A） 评估了一系列同质物质（50-300μg蛋白质）中的法乐蛋白保留量。（B） 发现法罗丁结合在 50-200 μg 蛋白质 （R2 = 0.8832） 范围内是线性的。（C） 散射在 540 nm 确认样本的不同数量 （R2 = 0.9730）。数据表示为平均± SEM （n=4）。请单击此处查看此图的较大版本。
图4。拉特伦库林 A 对 F - actin 水平的影响。 与通过在啮齿动物中保留标记的法乐素（p = 0.0034） 相比，使用行为脱聚剂拉特伦库林 A （2 μM， 1 h 在 37°C） 进行的大脑同质化治疗导致行为素细丝的量显著减少： 配对双尾学生 t测试（A）和验尸人体组织 （p = 0.0011; 配对双尾学生 t测试）（B）。数据表示为平均± SEM（n=6 对）。请单击此处查看此图的较大版本。
图5。KCl 介导去极化对孤立突触终端中 F-actin 量的影响。 （A） 在 37°C 时，用 50 mM KCl 从大鼠大脑中孵化出 30s 的突触体刺激作用素聚合，从而导致巴洛丁结合增加（p = 0.0014;配对双尾学生 t测试）。（B） 在死后人类脑组织的突触分子分数中也观察到较小的增加（p = 0.014;配对双尾学生 t测试）。数据表示为平均± SEM（n=6 对）。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1。拉特伦库林 A 对总作用水平的影响。 大脑同质化与拉特伦库林A（2μM，1小时在37°C）或等量的DMSO（1小时在37°C）孵育。在固定之前收集了每个样本10微克蛋白质（拉伦库林A处理和DMSO模拟处理控制）。通过免疫凝血评估了行为素水平的总水平。代表斑点显示为大鼠（A）和人类（C）大脑同质化。拉特伦库林A没有改变两只大鼠（B;p=0.40;配对双尾学生t测试）和人（D;p=0.42;配对双尾学生t测试）大脑均质的总作用水平。数据表示为平均± SEM（n=3 对）。请单击此处下载此文件。
补充图2。KCl介导的去极化对大鼠突触体和人类突触体的F-actin水平的影响。 （A） 从大鼠大脑中用 50 mM KCl （30 s 在 37 °C） 中孵化突触体，刺激了作用素聚合，并随之增加了巴洛丁结合（p = 0.0019;配对双尾学生 t测试）。（B） 与各自的未刺激控制（p = 0.015;配对双尾学生 t测试）相比，KCl去极化的人类突触神经分量中也观察到巴洛丁保留率的增加。数据表示为平均± SEM（n=6 对）。请单击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的检测，基本上改编自先前的研究30与修改，采用了一种法洛托辛，法洛丁标签与荧光标签。荧光法洛丁类比被认为是固定组织47、48、49染色蛋白丝的黄金标准。事实上，它们是专门识别行为细丝50的最古老的工具，并且仍然是检测行为细丝的最广泛使用的工具，特别是用于随后的荧光显微镜分析。重要的是，法洛丁已被证明染色甚至松散，不规则的网状短行为细丝51，表明法洛丁结合不依赖于丝长。另一方面，我们的协议依赖于荧光光谱来分析外活体生物样本中的活性动力学，例如来自啮齿动物和人类的脑组织。
该协议的主要优点是，它大大减少了现有协议所花的时间，这些协议首先要求高速离心生化分离F-actin（根据某些洗涤剂（如Triton X-100）中不溶性而与G-actin分离），以及随后使用西方印迹6、28、29对免疫活性水平进行分析。我们的检测时间效率也是基于phalloidin的免疫细胞化学技术的一个优势40，52，虽然可能有一些其他的好处与后者有关。另一个优点是，它可以应用于冷冻保存的死后人体脑组织，其采购总是与一些验尸延迟有关。此外，关于修改此方法的原始协议30，我们已大大降低了组织量的要求，从 1 mL cuvette 减少到 96 井板的单口井。此外，由于在每组实验中都包含一个巴勒丁标准曲线，我们的协议可以量化法乐丁绑定单位中行为素细丝的绝对水平（图2A-B，3A，4A-B：另见补充图2），以及相对于对照样本的水平（图5A-B）。
应当指出，应用法洛丁来评估F-actin水平，但仅限于固定细胞和样品，无论是我们的检测协议，以及显微镜为基础的协议。这是因为phalloidin本质上是一种有毒的双环六肽，它特别结合在具有高度亲和力的F-actin亚单位之间的界面上，并稳定这些作用的细丝，使它们无法去聚合，实际上增加了G-actin的净转化到F-actin40，53，54。因此，法罗丁稳定体内和体外肌素的丝，并可能导致行为本身47，55的平衡状态发生重大变化。由于这种对由荧光法洛丁介导的 actin 聚合状态的评估是基于被捕的细丝结构。此外，由于其通过脂质双层的渗透性低，基于巴洛丁的方法依赖于细胞或生物样本的渗透。因此，时间课程活细胞检测的不可行性是协议的主要限制，因为使用法洛丁的免疫细胞化学方法。
基于巴状霉素的方法无法评估活体未修复细胞中活体纤维的动态变化，这就引出了这样一个问题：是否有替代程序可以做到这一点。事实上，在使用视频显微图36、56、光漂白（FRAP）38或荧光共振能量转移（FRET）39等协议进行分析之前，荧光-行为类比的外源表达在这方面已经取得了进展。荧光标记肽和结合肌细丝的蛋白质的异质表达也用于研究活细胞中的活体动力学：然而，有缺点和局限性与他们以及荧光标记的行为在47，49，57的异质表达。例如，占大多数细胞中总作用素50-70%的G-actin在细胞溶胶中是可溶性和自由扩散的，导致较高的背景导致区分信号与作用素丝（特别是57）的信号的挑战。
测定中的一个关键因素是图2和图3中所示： 它不是线性的，在整个蛋白质量测试范围。因此，应首先确定适合检测的最佳蛋白质量，或者调整phalloidin模拟的量，使其不再受到限制（在较高数量的蛋白质中）。协议的另一个关键方面是，基于离心的多个步骤去除固定性、渗透剂和未绑定的巴洛丁可能导致样品中蛋白质（和F-actin绑定法洛丁）的不同损失，尤其是在使用少量样品时。因此，通过监测在 540 nm 下散射的光来使保留的样本量正常化非常重要。最后，由于 Actin 处于 F 形和 G 形之间相互转换的动态状态，修复速度应该很快。检测的一个次要相关关键方面是，我们无法评估其在药理作用聚合评估方面的效率。与拉特伦库林A的药理作用去聚合相反，jasplakinolide（一种可靠且广泛使用的阿普林聚合剂）与法洛丁具有重叠的结合位点，具有竞争力地抑制其与作用细丝58，59的结合。然而，将KCl刺激突触终端作为增加活性聚合的前活体模型表明，我们的检测还可以检测F-actin水平的增加。
最后，我们描述了一个强大的延时和高通量检测分析行为素细丝（F-actin）及其在生理和病理生理状态的交替适合96井板格式。结合其他现有方法，在固定和未固定的样品中评估F-actin，该协议将被证明是神经科学领域以及生物科学研究其他领域与行为相关研究的重要工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了新西兰神经学基金会（1835-PG）、新西兰健康研究理事会（#16-597）和新西兰奥塔哥大学解剖学系的支持。我们感谢HCB-IDIBAPS生物库（西班牙）的神经组织库用于人体脑组织。我们感谢张嘉贤在录制和编辑视频方面所做的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
References
- Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
- Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
- Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
- Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
- Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
- Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
- Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
- Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
- Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
- Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
- Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
- Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
- Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
- Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
- Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
- Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
- Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
- Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
- Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
- Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
- Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
- Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
- Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
- Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
- Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
- Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
- Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
- Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
- Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
- Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
- Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
- Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
- Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
- Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
- Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
- Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
- Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
- Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
- Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
- Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
- Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
- Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
- Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
- Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
- Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
- Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).
