Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

Abstract

أكتين, المكون الرئيسي للهيكل الخلوي, يلعب دورا حاسما في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية ووظيفة. في ظل الدول الفسيولوجية، actin يحدث في التوازن في شكليها: كروي أحادي (G-أكتين) وخيوط بلمرة (F- أكتين). في المحطات متشابك, actin الهيكل الخلوي يشكل الأساس لوظائف حاسمة قبل وبعد متشابك. وعلاوة على ذلك، ترتبط التغيرات الديناميكية في حالة البلمرة أكتين (الانعكاس بين الأشكال الكروية والخيوط من أكتين) ارتباطا وثيقا التعديلات المتعلقة اللدونة في هيكل متشابك ووظيفة. نحن نبلغ هنا عن منهجية معدلة قائمة على الفلورسينس لتقييم حالة البلمرة من أكتين في ظروف الجسم الحي السابق. يستخدم المقايسة phalloidin المسمى فلوريا ، وهو فهولوتوكين يرتبط على وجه التحديد بخيوط أكتين (F-actin) ، مما يوفر مقياسا مباشرا للactin الخيطي البلمرة. كدليل على المبدأ ، نقدم أدلة على ملاءمة المقايسة في كل من القوارض وتجانس أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. باستخدام latrunculin A (دواء أن depolymerizes خيوط أكتين)، ونحن نؤكد فائدة من المقايسة في رصد التعديلات في مستويات F-actin. علاوة على ذلك، فإننا نوسع المقايسة إلى الكسور الكيميائية الحيوية من المحطات المتشابكة المعزولة حيث نؤكد زيادة البلمرة أكتين على التحفيز عن طريق إزالة الاستقطاب مع K خارج الخلية عالية+.

Introduction

وتشارك أكتين البروتين الهيكل الخلوي في وظائف الخلوية متعددة, بما في ذلك الدعم الهيكلي, النقل الخلوي, حركية الخلية والانقسام. Actin يحدث في توازن في شكلين: أكتين كروي أحادي (G-أكتين) والاكتين الخيطي البلمرة (F-actin). التغيرات السريعة في حالة البلمرة من أكتين (بين أشكال G- و F- يؤدي إلى تجميع خيوط سريعة وتفكيكها و تكمن وراء أدوارها التنظيمية في علم وظائف الأعضاء الخلوية. Actin يشكل العنصر الرئيسي للهيكل الخلوي العصبي ويؤثر على مجموعة واسعة من وظائف الخلايا العصبية1,2. وتجدر الإشارة إلى أن الهيكل الخلوي actin يشكل جزءا لا يتجزأ من المنصة الهيكلية للمحطات متشابك. على هذا النحو، هو محدد رئيسي للمورفوجينيسيس متشابك وعلم وظائف الأعضاء ويلعب دورا أساسيا في السيطرة على حجم وعدد ومورفولوجيا نقاط الاشتباك العصبي3،4،5. على وجه الخصوص ، فإن التكبر الديناميكي للبوليمرات - إزالة البوليمرات هو محدد رئيسي لإعادة عرض متشابك المرتبطة اللدونة متشابك الكامنة وراء الذاكرة وعمليات التعلم. في الواقع، كل من presynaptic (مثل إطلاق الناقل العصبي6،7،8،9،10)وظائف postsynaptic (اللدونة ذات الصلة إعادة عرضديناميكية 11،12،13،14)تعتمد بشكل حاسم على التغيرات الديناميكية في حالة البلمرة من الهيكل الخلوي actin.

في ظل الظروف الفسيولوجية، يتم تنظيم مستويات F-actin بشكل ديناميكي وبإحكام من خلال مسار متعدد الوسائط يتضمن تعديل ما بعد النقل4،15،16 وكذلك البروتينات الملزمة للactin (ABPs)4،17. ABPs يمكن أن تؤثر على ديناميات أكتين على مستويات متعددة (مثل بدء أو تثبيط البلمرة، مما يؤدي إلى تفريع خيوط، وقطع خيوط إلى قطع أصغر، وتعزيز إزالة البلمرة، وحماية ضد إزالة البلمرة)، وبدورها تحت رقابة تحوير صارمة حساسة لمختلف الإشارات خارج وداخل الخلايا18،19،20. مثل هذه الشيكات التنظيمية على مستويات متعددة تملي تنظيما صارما لديناميات أكتين في الهيكل الخلوي متشابك، صقل الجوانب قبل وما بعد متشابك من فسيولوجيا الخلايا العصبية على حد سواء في الدول القاعدية والنشاط الناجمة.

ونظرا للأدوار الهامة من أكتين في فسيولوجيا الخلايا العصبية, ليس من المستغرب أن العديد من الدراسات قدمت أدلة على التعديلات في ديناميات أكتين والأحداث المسببة للأمراض الحرجة المرتبطة مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية بما في ذلك التنكس العصبي, الأمراض النفسية وكذلك الأمراض العصبية النمائية3,21,22,23,24,25,26,27. على الرغم من ثروة من البيانات البحثية التي تشير إلى الأدوار الرئيسية للactin في فسيولوجيا الخلايا العصبية والفيزيولوجيا المرضية، ومع ذلك، لا تزال هناك فجوات كبيرة في فهم ديناميات أكتين، لا سيما في الهيكل الخلوي متشابك. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات البحثية للحصول على فهم أفضل للactin العصبية وتعديلاتها في ظل الظروف المرضية. ومن مجالات التركيز الرئيسية في هذا السياق تقييم حالة البلمرة في أكتين. وهناك مجموعات تجارية غربية قائمة على النشاف (G-Actin/F-Actin في مجموعة البيوكيميائية المقايسة الحية؛ الهيكل الخلوي SKU BK03728،29) والمقاايسات المصنوعة منزليا لتقييم مستويات F-actin6. ومع ذلك ، لأن هذه تتطلب العزل الكيميائي الحيوي من F -actin و G-actin ولأن القياس الكمي اللاحق يستند إلى بروتوكولات الانتفاخ المناعي ، فإنها يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. نحن هنا تقرير مطياف مضان القائم على المقايسة مقتبسة من دراسة سابقة30 مع التعديلات التي يمكن استخدامها لتقييم كل من المستويات القاعدية من F-actin، فضلا عن التغيرات الديناميكية في تجميعها تفكيكها. وتجدر الإشارة إلى أننا قمنا بتعديل البروتوكول الأصلي بكفاءة يتطلب عينات مناسبة ل cuvette 1 مل إلى الشكل الحالي لوحة 96 جيدا. وبالتالي فإن البروتوكول المعدل قد قلل بشكل كبير من كمية الأنسجة /العينة المطلوبة للمقص. علاوة على ذلك، نقدم أدلة على أن البروتوكول مناسب ليس فقط لتجانسات أنسجة الدماغ، ولكن أيضا الكسور دون الخلوية مثل المحطات المتشابكة المعزولة (السنابتوسومات والسنابتونوروسومات). وأخيرا، يمكن استخدام المقايسة لأنسجة دماغ القوارض التي تم تشريحها حديثا وعينات الدماغ البشري المخزنة على المدى الطويل بعد الوفاة. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين يتم تقديم المقايسة في سياق الخلايا العصبية ، يمكن تمديدها بشكل مناسب إلى أنواع الخلايا الأخرى والعمليات الفسيولوجية المرتبطة بها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد نفذت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات في جامعة أوتاغو في رعاية واستخدام المختبر (البروتوكول الأخلاقي رقم 1000/1999). AUP95/18 و AUP80/17) والهيئة التشريعية في نيوزيلندا. تم الحصول على أنسجة الدماغ البشري من بنك الأنسجة العصبية في مستشفى كلينيك-IDIBAPS BioBank في برشلونة، إسبانيا. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى كلينيتش، برشلونة، على جميع بروتوكولات جمع الأنسجة، وحصلت الأسر على موافقة مستنيرة.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. إعداد المخازن المؤقتة التالية لتجانس أنسجة الدماغ وإعداد جزء المخصب من المحطات متشابك:
    العازلة التجانس: 5 MM HEPES، حمى الحموضة 7.4 تكملها مع السكروز 0.32 M
    احتياطي إعادة الإنفاق: 5 mM Tris, pH 7.4 مكمل ب 0.32 M سكروز
    العازلة الغسيل: 5 متر تريس، رقم الحموضة 8.1
    1.2 م السكروز
    1.0 م السكروز
    0.85 م السكروز
  2. إضافة مزيج محلية الصنع أو تجارية من مثبطات البروتيز والفوسفاتاز.
    ملاحظة: لقد استخدمنا نسخة خالية من EDTA من مزيج مثبطات Protease الكامل (قرص واحد لكل 10 مل عازل) وكوكتيل مثبط فوسفاتاز IV (1:100؛ الحجم: الحجم).
  3. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف التالية لتثبيت و permeabilization و الربط phalloidin:
    كريبس العازلة: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM الجلوكوز, 20 mM HEPES, pH 7.4
    1 م كلكل
    25٪ غلوتارارالدهيد (حل المخزون)
    كريبس العازلة التي تحتوي على 0.1 ٪ تريتون X - 100 و 1 ملغ / مل NaBH4
    400x اليكسا فلور 647 فالويدين في DMSO
    كريبس العازلة التي تحتوي على 0.32 M السكروز
    50 ميكرومتر لاتورونكولين A في DMSO (حل المخزون)
    1 M KCl (حل المخزون)
    تنبيه: فالويدين سام (LD50 = 2 ملغم/كغ) ويجب التعامل معه بعناية. استنشاق الجلوتارارالدهيد سام ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.
  4. تخزين المخازن المؤقتة في 4 درجة مئوية وphalloidin وlatrunculin A في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: لا ينصح تخزين المخازن المؤقتة على المدى الطويل. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. تجانس أنسجة الدماغ

  1. تجانس أنسجة دماغ الفئران المبردة أو التي تم تشريحها حديثا في 10 مجلدات من عازل التجانس في أنبوب زجاجيبوتر- إلفيهم والحشرات على الجليد.
    ملاحظة: يتم تحقيق التجانس الأمثل عن طريق 15-20 السكتات الدماغية من الحشرات باليد لأنسجة الدماغ. يمكن تأكيد التجانس الناجح من خلال التدفق السلس للتعليق من خلال الأنبوب الزجاجي. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. تحديد تركيز البروتين في المتجانسة باستخدام برادفورد المقايسة31.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المقايسات محلية الصنع أو التجارية البديلة لتقدير البروتين.
  3. تمييع عينات متجانسة في العازلة كريبس بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر.
    ملاحظة: في بعض تجاربنا، نحتضن متجانسات مع 2 ميكرومتر لاتورونكولين A أو DMSO (عناصر التحكم) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لهذا، يتم إعادة إنفاق التجانسات في 48 ميكرولتر من العازلة كريبس، ويتم إضافة 2 ميكرولتر من 50 ميكرومتر لاتورونكولين A أو 2 ميكرولتر من DMSO. كذلك بالنسبة للمناعة ، يتم جمع كمية صغيرة من العينة (10 ميكروغرام) بعد الحضانة.
  4. إصلاح عينات متجانسة (المقطع 5).

3. إعداد محطات الأعصاب المعزولة

  1. إعداد السنابتوسومات
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البروتوكولات البديلة32،33 للسينابتوسومات.
    1. تجانس دماغ الطرد المركزي عند 1200 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل بيليه، وهو كسر النووية الخام.
    3. مزيد من الطرد المركزي الفائق (S1) التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.1 في 12000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. إزالة supernatant (S2) ، وهو كسر السيتوسوليك القابلة للذوبان.
    5. إعادة إنفاق بيليه (P2) التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.3، وهو كسر السيبتوسوم الخام في احتياطي إعادة الإنفاق.
      ملاحظة: يعتمد حجم احتياطي إعادة الإنفاق على كمية الأنسجة التي تبدأ وكمية الكريات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، عند البدء مع 150-300 ملغ من أنسجة الدماغ، يمكن إعادة إنفاق بيليه التي تم الحصول عليها في 200 ميكرولتر من العازلة إعادة الإنفاق.
    6. تحميل synaptosomes الخام إعادة الإنفاق على تدرج السكروز متقطعة مصنوعة من أحجام متساوية من 0.85-1.0-1.2 M السكروز.
      ملاحظة: نحن عادة ما تستخدم 1 مل كل من محلول السكروز (ل150-300 ملغ الأنسجة). ويمكن تغيير هذا وفقا لكميات أكبر من الأنسجة. يمكن إجراء تدرجات متقطعة باستخدام حقنة 25G مضغوطة على الجدار الداخلي للأنبوب الطرد الفائق والطبقات اللطيفة من طبقات السكروز.
    7. جهاز طرد مركزي عند 85,000 x g لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بسبب السرعة العالية للطرد المركزي، هناك حاجة إلى جهاز طرد مركزي فائق قادر على خلق فراغ للحد من التدفئة.
    8. جمع كسر synaptosomal في واجهة بين 1.0 و 1.2 M السكروز باستخدام تلميح ماصة 200 ميكرولتر.
    9. اغسل الكسر السينابتوسومي بحاجز الغسيل البارد بالثلج عن طريق الطرد المركزي عند 18000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: للغسيل، يتم جمع كسر السينابوسومات التي تم الحصول عليها في واجهة 1.0 و 1.2 M السكروز في أنبوب 1.5 مل الطازجة، ويتم إضافة حجم متساو من العازلة الغسيل، وضمان إزالة السكروز عالية من المتوسط.
    10. غسل بيليه synaptosomal مرة أخرى مع الجليد الباردة تجانس العازلة في 12،000 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
    11. إعادة إنفاق السنابتوسومات في عازل التجانس على الجليد.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.
    12. تحديد تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد.
    13. إعادة إنفاق السنابتوسومات في العازلة كريبس بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر (47.5 ميكرولتر إذا كان synaptosomes هي أن تكون إزالة الاستقطاب من قبل KCl; انظر القسم 4).
      ملاحظة: لإعادة الإنفاق، يتم نسج الكسر السينابتوسومي أولا عند 12,000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ويتم إزالة الناموست الفائق (العازل). ثم يتم إعادة إنفاق بيليه synaptosomal في العازلة كريبس عن طريق pipetting لطيف باستخدام تلميح أنبوب 200 ميكرولتر.
    14. 10 - المضي قدما في إزالة الاستقطاب (الباب 4).
  2. إعداد السينابتونوسومات
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البروتوكولات البديلة34،35 للسينابتونوروسومات.
    1. تمرير الدماغ المتجانسة من خلال مرشح صافي مبللة مسبقا من حجم المسام 100 ميكرومتر في حامل مرشح باستخدام حقنة 1 مل.
      ملاحظة: قبل التبول من كافة عوامل التصفية المهم لتجنب فقدان العينة وينبغي القيام به باستخدام المخزن المؤقت التجانس. لهذا، يتم تمرير المخزن المؤقت التجانس من خلال المرشحات في حامل التصفية باستخدام حقنة 1 مل حتى تدفق المخزن المؤقت.
    2. جمع filtrate (F1) في أنبوب 1.5 مل المبردة مسبقا على الجليد.
    3. كرر العملية (الخطوتين 3.2.1 و 3.2.2) للكسر F1 للحصول على الشعيرات الثانية (F2).
    4. تمرير F2 filtrate من خلال مرشح صافي من حجم المسام 5 ميكرومتر.
    5. جمع filtrate (F3) في أنبوب 1.5 مل المبردة مسبقا على الجليد.
    6. جهاز الطرد المركزي filtrate F3 في 1500 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
    7. Resuspend بيليه (synaptoneurosomes) في كريبس العازلة على الجليد بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر (47.5 ميكرولتر إذا كان synaptosomes هي أن تكون إزالة القطب من قبل KCl؛ انظر القسم 4).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.
    8. تقدير تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد.
    9. 10 - المضي قدما في إزالة الاستقطاب (الباب 4).

4. KCl بوساطة إزالة الاستقطاب من المحطات متشابك معزولة

  1. السنابتوسومات/السينابتونوسومات متساوية المستويات عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  2. تحفيز synaptosomes / synaptoneurosomes بإضافة KCl لزيادة K خارج الخلية+ إلى 50 mM لمدة 30 ثانية في 37 درجة مئوية وإضافة حجم متساو من العازلة كريبس إلى مجموعة التحكم غير المحفزة المعنية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 2.5 ميكرولتر من 1 M KCl إلى synaptosomes resuspended في 47.5 ميكرولتر من العازلة كريبس; وإضافة 2.5 ميكرولتر من العازلة كريبس إلى كل منهما غير المحفزة التحكم synaptosome. بالنسبة للتجارب التي يتضمنها عدد كبير من العينات، قم بإجراء ما لا يزيد عن عينتين في كل مرة بحيث لا يتجاوز وقت إزالة الاستقطاب 30 ثانية.
  3. إنهاء التحفيز بإضافة الغلوتارارالدهيدي (القسم 5).

5. تثبيت وphalloidin تلطيخ العينات

  1. إضافة الجلوتارالدهيد إلى عينات متجانسة / synaptosomal / synaptoneurosomal إلى تركيز نهائي من 2.5٪ لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: أضفنا 6 ميكرولتر من محلول الغلوتارالدهيد بنسبة 25٪ بحيث كان التركيز النهائي للجلوتارانديهيد في عينات 50 ميكرولتر (متجانسات / سينابتوسومات / synaptoneurosomes) هو 2.5٪. التثبيت أمر بالغ الأهمية ، وينبغي أن يكون سريعا ، وبالتالي مباشرة بعد إضافة الجلوتارالدهيد ، يجب أن تكون العينة دوامة بقوة.
  2. ترسيب العينات في 20،000 × غرام لمدة 5 دقائق.
  3. أزل الناتنات الفائق.
    ملاحظة: تجاهل supernatant في غطاء محرك السيارة الدخان كما glutaraldehyde سامة.
  4. Permeabilize بيليه عن طريق إعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر من العازلة كريبس تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 1 ملغ / مل NaHB4 لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ترسيب العينات في 20،000 × غرام لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة المخزن المؤقت permeabilization.
  7. غسل بيليه مع 200 ميكرولتر من العازلة كريبس عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق.
  8. Resuspend وصمة عار بيليه مع 1x اليكسا فلور 647 Phalloidin (المقابلة ل500 ميكرون) في 100 ميكرولتر من العازلة كريبس لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: أنواع أخرى من النظير phalloidin الفلورسنت متاحة تجاريا ويمكن استبدالها للمقاايسة. قد يكون تركيز phalloidin وحجم العينة الكلية من الحضانة إلى تعديل وفقا لكمية ونوع الأنسجة / عينة يجري اختبارها وينبغي توحيد الظروف المثلى وفقا لذلك.
  9. الطرد المركزي عينات ملطخة في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة phalloidin غير منضم (فائقة).
  11. اغسل العينة ب 200 ميكرولتر من عازل كريبس عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × غرام لمدة 5 دقائق.
  12. Resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة كريبس التي تحتوي على 0.32 M السكروز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.

6. تحليل الفلورومترية وتشتت الضوء

  1. الاستغناء عن اليكسا فلور 647 عينات ملطخة Phalloidin في لوحة سوداء 96 جيدا.
  2. قياس كثافة الفلورسينس في الطول الموجي للإثارة من 645 نانومتر وطول موجي انبعاث 670 نانومتر في قارئ لوحة في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل العينات من لوحة 96-جيدا الأسود إلى لوحة شفافة 96 جيدا باستخدام نصائح 200 ميكرولتر pipet.
  4. قياس تشتت الضوء عند 540 نانومتر لتصحيح أي خسائر قد تكون حدثت خلال الخطوات السابقة من التثبيت والبيرمابيلينج والتلوين.
    ملاحظة: قد تكون الاختلافات في المواد البيولوجية المحتفظ بها في العينات الملطخة أكثر بروزا بالنسبة لكميات أصغر من مواد البدء (انظر المناقشة).
  5. وتشمل مجموعة من اليكسا فلور 647 Phalloidin في كريبس العازلة بتركيزات مختلفة (0.05x، 0.1x و0.25x و0.35x و0.75x و0.5x و1x المقابلة ل25 و 50 و 125 و 175 و 250 و 375 و 500 وحدة ميكرونيون) لكل دفعة من المقايسة كمنحنى قياسي.
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية ولا يؤثر على نتائج الفحص خاصة عند التعبير عن مستويات F-actin بطريقة نسبية (القسم 7). يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

7. تحليل البيانات

  1. كمية F-actin في العينات يتناسب مباشرة مع كثافة الفلورية من phalloidin ملزمة. التعبير بالقيمة المطلقة لوحدات phalloidin منضم محسوبة من منحنى خطي من معيار phalloidin الموسومة.
    ملاحظة: كمثال، راجع الأرقام 2A-B، 3A، 4A-B والشكل التكميلي 2.
  2. التعبير عن مستويات F-actin كسر من عينات التحكم.
    ملاحظة: كمثال، راجع الشكل 5A-B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خطية المقايسة لتقييم مستويات F-actin
أولا، تم التأكد من منحنى قياسي للزيادة الخطية في الفلور من اليكسا فلور 647 Phalloidin وتكررت لكل مجموعة من التجارب(الشكل 1). للتحقيق في النطاق الخطي للمقاسة ، تم معالجة كميات مختلفة من تجانسات الدماغ من القوارض(الشكلان 2A و 2B)و الأشخاص بعد الوفاة (الشكل 3A و 3B). تم العثور على المقايسة لتكون خطية في حدود 50-200 ميكروغرام من البروتين كما تم تقييمها من قبل كميات من phalloidin المسمى الاحتفاظ بها. تم استخدام تشتت الضوء عند 540 نانومتر لتأكيد الكميات المختلفة للعينات(الشكل 2C والشكل 3C).

Latrunculin، وكيل depolymerizing actin يقلل من ربط phalloidin المسمى
ومن المعروف Latrunculin A لتبويل خيوط أكتين وخفض مستويات F-actin36,37,38,39. تم احتضان التجانسات من القوارض أو أنسجة الدماغ البشرية مع 2 ميكرومتر لاتورونكولين A لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لإزالة خيوط أكتين. تم احتضان مجموعات التحكم غير المعالجة المعنية مع DMSO لنفس المدة من ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. المقايسة بقوة قياس فقدان مستويات F-أكتين من 95.7 ± 6.6 (متوسط ± SEM) في عينات التحكم إلى 72.0 ± 3.2 (متوسط ± SEM) وحدة نقدية من phalloidin ملزمة في latrunculin A-تعامل العينات في متجانسات الدماغ القوارض(الشكل 4A). ولوحظ أيضا انخفاض مماثل (من 83.7 ± 3.9 إلى 66.9 ± 4.2 ميكرون) في الاحتفاظ بالفلويدين المسمى عندما تعرضت متجانسات من أنسجة الدماغ البشري لعلاج اللاترونكولين A(الشكل 4ب). الجدير بالذكر, مجموع مستويات أكتين, كما تم تقييمها من قبل immunoblotting, لم يغير على العلاج مع latrunculin A في كل الفئران (الشكل التكميلي 1A-B) والبشرية (الشكل التكميلي 1C-D) متجانسات الدماغ.

إزالة الاستقطاب من المحطات متشابك معزولةيحفز البلمرة actin وتشكيل خيوط
وقد ثبت ex vivo depolarization من المحطات متشابك معزولة أن يؤدي إلى التحفيز السريع للactin البلمرة6،30،40، واستخدمت هذه الظاهرة كبأكيد آخر على المقايسة الواردة هنا. تم إعداد الكسور الكيميائية الحيوية المخصبة في المحطات المتشابكة بطريقتين مختلفتين؛ طريقة الطرد الفائق القائمة على التدرج للحصول على "synaptosomes"41،42،43،44 وبروتوكول تسلسلي قائم على الترشيح للحصول على "synaptoneurosomes"43،45،46. لأن العائد لهذا الأخير هو أعلى، استخدمناه لأنسجة الدماغ بعد الوفاة البشرية حيث كميات الأنسجة غالبا ما تكون محددة. من ناحية أخرى، فضلنا استخدام النايبوسومات مع درجة أعلى من إثراء شظايا متشابك41 لتجارب أنسجة الدماغ الفئران لدينا.

تم تحقيق إزالة الاستقطاب من synaptosomes أو synaptoneurosomes وتحفيز البلمرة أكتين من قبل قصيرة (30 ثانية) انفجار من الزيادة في K خارج الخلية+ إلى 50 mM. أدى التعرض KCl في زيادة ربط phalloidin بنسبة 40٪ تقريبا في synaptosomes الدماغ القوارض مقارنة مع الضوابط الوهمية حفز كل منها (الشكل 5A؛ انظر أيضا الشكل التكميلي 2A). وهناك أصغر حجما (حوالي 20 في المائة) ولكن لوحظت أيضا زيادة متسقة في synaptoneurosomes الإنسان تعامل مع KCl (الشكل 5B; انظر أيضا الشكل التكميلي 2A). هذه التجارب التحقق من صحة قوة المقايسة لدينا في تحديد التعديلات في مستويات F-actin في عينات أنسجة الدماغ, بما في ذلك محطات متشابك معزولة.

Figure 1
الشكل 1. منحنى قياسي للفلورسين من اليكسا فلور 647 Phalloidin.  تم تأكيد خطية انبعاث الفلورية من كميات مختلفة (25-500 ميكرون) من phalloidin المسمى عن طريق التحليل الطيفي الفلوري في إثارة 645 نانومتر وانبعاث 670 نانومتر (R2 = 0.9942). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. الخطية من ربط phalloidin لتجانسات الخلايا الكاملة من أنسجة الدماغ الفئران.  (أ)تم تقييم ربط phalloidin لكميات مختلفة من التجانسات (50-300 ميكروجرام بروتين). (ب)كان الربط خطيا في نطاق بروتين 50-200 ميكروغرام (R2 = 0.9602). (ج)تم استخدام التشتت عند 540 نانومتر لتأكيد كميات مختلفة من العينات (R2 = 0.8319). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. فالويدين ملزمة لتجانسات الخلايا الكاملة من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة.  (أ) تم تقييم احتباس Phalloidin في مجموعة من كميات من التجانسات (50-300 ميكروجرام بروتين). (ب) تم العثور على ربط Phalloidin لتكون خطية في نطاق البروتين 50-200 ميكروغرام (R2 = 0.8832). (ج)التشتت عند 540 نانومتر أكد الكميات المختلفة للعينات (R2 = 0.9730). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. آثار latrunculin A على مستويات F-أكتين.  أدى علاج متجانسات الدماغ مع عامل إزالة البلمرة أكتين لاتورونكولين A (2 ميكرومتر، 1 ساعة في 37 درجة مئوية) في انخفاض كبير في كميات خيوط أكتين مقارنة مع عينات التحكم ذات الصلة وهمية المعالجة كما تم تقييمها عن طريق الاحتفاظ phalloidin المسمى على حد سواء في القوارض (ع = 0.0034؛ يقترن اثنين من الذيل الطالب راختبار) (أ) والأنسجة البشرية بعد الوفاة (ع = 0.0011; يقترن اثنين الذيل الطالب ر-اختبار) (B). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 6 أزواج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. آثار إزالة الاستقطاب بوساطة KCl على كميات F-actin في المحطات المتشابكة المعزولة.  (أ)حضانة synaptosomes من دماغ الفئران مع 50 MM KCl لمدة 30 s في 37°C حفز البلمرة أكتين مما أدى إلى زيادة في ربط phalloidin (ع = 0.0014; يقترن اثنين الذيل الطالب ر-اختبار). (ب)لوحظت زيادة أقل أيضا في جزء متشابك من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة (ع = 0.014؛ يقترن الطالب ذيلين تياختبار). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 6 أزواج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1 - الأرقام التكميلية 1- الأرقام التكميلية 1 آثار latrunculin A على مستويات أكتين الكلي.  تم احتضان متجانسات الدماغ مع latrunculin A (2 ميكرومتر، 1 ساعة في 37 درجة مئوية) أو حجم متساو من DMSO (1 ساعة في 37 درجة مئوية). تم جمع 10 ميكروغرام بروتين لكل عينة (latrunculin A المعالجة وDMSO الضوابط وهمية المعالجة) قبل التثبيت. تم تقييم مستويات أكتين الإجمالية عن طريق الانتفاخ المناعي. وتظهر بقع تمثيلية للفئران (أ) والإنسان (ج) تجانس الدماغ. Latrunculin A لم يغير من مستويات أكتين مجموع في كل من الفئران (B; p = 0.40; يقترن اثنين الذيل الطالب راختبار) والإنسان(D; p = 0.42; يقترن اثنين الذيل الطالب راختبار) تجانس الدماغ. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 3 أزواج). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2 - الأرقام التكميلية 2- الأرقام التكميلية 2- ال آثار إزالة الاستقطاب بوساطة KCl على مستويات F-actin في synaptosomes الفئران وsynaptoneurosomes الإنسان.  (أ)حضانة السينابتوسومات من دماغ الفئران مع 50 mM KCl (30 s في 37 درجة مئوية) حفز البلمرة actin وما يترتب على ذلك من زيادة في ربط phalloidin (ع = 0.0019؛ يقترن اثنين الذيل الطالب تياختبار). (ب)لوحظت أيضا زيادة في الاحتفاظ phalloidin في كسر المشبك البشرية التي تم إزالة الاستقطاب من قبل KCl مقارنة مع الضوابط غير المحفزة المعنية (ع = 0.015؛ يقترن اثنين الذيل الطالب ر-اختبار). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 6 أزواج). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المقايسة الموصوفة هنا ، مقتبسة أساسا من دراسة سابقة30 مع تعديلات ، ويستخدم phallotoxin ، phalloidin الموسومة مع تسمية الفلورسنت. تعتبر النظير phalloidin الفلورسنت لتكون المعيار الذهبي لتلطيخ خيوط أكتين في الأنسجة الثابتة47,48,49. في الواقع، فهي أقدم الأدوات لتحديد خيوط أكتين50 على وجه التحديد، ولا تزال الأجهزة الأكثر استخداما للكشف عن خيوط أكتين وخاصة بالنسبة للتحليلات اللاحقة القائمة على المجهر الفلوري. الأهم من ذلك، وقد ثبت phalloidin وصمة عار حتى فضفاضة، وشبكة غير منتظمة من خيوط أكتين قصيرة51،مما يدل على أن ربط phalloidin لا يعتمد على طول خيوط. بروتوكولنا، من ناحية أخرى، يعتمد على التحليل الطيفي الفلوري لتحليل ديناميات أكتين في العينات البيولوجية في الجسم الحي السابق، على سبيل المثال أنسجة الدماغ من القوارض والبشر.

الميزة الرئيسية للبروتوكول هو أنه يقلل إلى حد كبير من الوقت المستغرق فيما يتعلق بالبروتوكولات القائمة التي تتطلب أولا عزلا كيميائيا بيوكيميائية عالية السرعة تعتمد على الطرد المركزي ل F-actin (الانفصال عن G-actin استنادا إلى قابلية خيط أكتين في بعض المنظفات مثل Triton X-100) والتحليل اللاحق لمستويات المناعة باستخدام النشاف الغربي6و28و29. كفاءة الوقت من المقايسة لدينا هو أيضا ميزة فيما يتعلق تقنيات الكيمياء المناعية المستندة إلى phalloidin40,52, على الرغم من أنه قد يكون هناك بعض الفوائد الأخرى المرتبطة بهذا الأخير. ميزة أخرى هي أنه يمكن تطبيقها على أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة المبردة ، والتي يرتبط شراءها دائما ببعض التأخير بعد الوفاة. وعلاوة على ذلك، فيما يتعلق بالبروتوكول الأصلي30 الذي عدلت منه هذه المنهجية، فقد خفضنا إلى حد كبير الاحتياجات من كمية الأنسجة من 1 مل من الكوفيت إلى بئر واحد من طبق من 96 بئرا. وعلاوة على ذلك، بسبب إدراج منحنى معيار phalloidin في كل مجموعة من التجارب، بروتوكولنا يمكن أن كمية المستويات المطلقة من خيوط أكتين في وحدات من phalloidin ملزمة (الأرقام 2A-B، 3A، 4A-B؛ انظر أيضا الشكل التكميلي 2)، وكذلك المستويات بالنسبة لعينات التحكم (الشكل 5A-B).

وتجدر الإشارة إلى أن تطبيق phalloidin لتقييم مستويات F-actin ومع ذلك يقتصر على الخلايا الثابتة والعينات، سواء بالنسبة لبروتوكولنا المقايسة وكذلك البروتوكولات القائمة على المجهر. وذلك لأن phalloidin هو أساسا هيبتاببتيد ثنائي الحلقات السامة التي تربط على وجه التحديد في واجهة بين الوحدات الفرعية F-actin مع تقارب عالية ويستقر هذه خيوط أكتين, مما يجعلها غير قادرة على depolymerize وفي الواقع زيادة التحويل الصافي من G-actin إلى F-actin40,53,54. وبالتالي، phalloidin يستقر خيوط أكتين في الجسم الحي وفي المختبر،ويمكن أن يؤدي إلى تغييرات كبيرة في حالة التوازن من أكتين في حد ذاتها47،55. على هذا النحو التقييم لحالة البلمرة actin بوساطة phalloidin الفلورسنت يستند إلى هياكل خيوط القبض. وعلاوة على ذلك، بسبب نفاذية منخفضة من خلال طبقة ثنائية الدهون، والمنهجيات القائمة على phalloidin تعتمد على permeabilization من الخلايا أو العينات البيولوجية. عدم جدوى من الوقت بالطبع اختبار الخلايا الحية ومن ثم قيد كبير على البروتوكول كما هو الحال مع الأساليب القائمة على الكيمياء المناعية التي تستخدم phalloidin.

عدم جدوى الأساليب القائمة على phalloidin لتقييم التغيرات الديناميكية في خيوط أكتين في الخلايا الحية غير المثبتة يطرح السؤال عما إذا كانت هناك إجراءات بديلة للقيام بذلك. في الواقع ، تم إحراز تقدم في هذا الصدد مع التعبير الخارجي عن نظائر الفلورسنت أكتين قبل التحليل باستخدام بروتوكولات مثل تصوير الفيديوالدقيق 36،56، الفلورسينس يتعافى بعد photobleaching (FRAP)38 أو نقل الطاقة الرنين الفلوري (FRET)39. وتستخدم أيضا تعبير Heterologous من الببتيدات الموسومة الفلورية والبروتينات التي تربط خيوط أكتين لدراسة ديناميات أكتين في الخلايا الحية; ومع ذلك هناك عيوب والقيود المرتبطة بها وكذلك مع التعبير heterologous من actin الموسومةفلوريا 47،49،57. على سبيل المثال، G-actin التي تضم 50-70٪ من إجمالي أكتين في معظم الخلايا قابلة للذوبان ونشرها بحرية في السيتوسول، مما أدى إلى خلفية أعلى مما تسبب في تحديات في التفريق بين الإشارات من خيوط أكتين على وجه التحديد57.

ومن العوامل الحاسمة في المقايسة أن الشكل 2 والشكل 3كما هو مبين في هذا الصدد؛ أنها ليست خطية في جميع أنحاء مجموعة من كميات البروتين اختبارها. وبالتالي، ينبغي تحديد كمية مثالية من البروتين مناسبة للمقايسة أولا أو ينبغي تعديل كمية التناظرية phalloidin بحيث أنها لم تعد تحد (بكميات أعلى من البروتينات). وثمة جانب آخر حاسم من البروتوكول هو أن الخطوات المتعددة القائمة على الطرد المركزي لإزالة عامل التثبيت والبيرمابيلية والفلويدين غير المنضم يمكن أن تؤدي إلى فقدان متفاوت للبروتينات (والفلويدين المقيد F-actin) من العينات، لا سيما عندما تستخدم كميات أقل من العينات. ومن ثم فمن المهم تطبيع كمية العينة التي يحتفظ بها عن طريق رصد تشتت الضوء عند 540 نانومتر. وأخيرا، بما أن أكتين في حالة ديناميكية من التداخل بين أشكالها F-و G، فإن الإصلاح يجب أن يكون سريعا. الجانب الحاسم البسيط ذو الصلة من المقايسة هو أننا لم نتمكن من تقييم كفاءتها في تقييم البلمرة actin الدوائية. بدلا من depolymerization actin الدوائية من قبل latrunculin A، jasplakinolide (وكيل البلمرة أكتين موثوق بها وتستخدم على نطاق واسع) لديها مواقع الربط المتداخلة مع phalloidin ويمنع تنافسيا ملزمة لها لخيوط أكتين58،59. ومع ذلك، فإن توظيف محطات متشابك محفزة من KCl كنموذج للحيوية الخارجية لزيادة البلمرة أكتين يشير إلى أن المقايسة لدينا يمكن أن تكشف أيضا عن زيادات في مستويات F-actin.

في الختام، نحن نصف قوية كفاءة الوقت وارتفاع الإنتاجية المقايسة لتحليل خيوط أكتين (F-actin) والتناوب في الدول الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية مناسبة لشكل لوحة 96 جيدا. وإلى جانب الأساليب القائمة الأخرى لتقييم ال F-actin في عينات ثابتة وغير مثبتة، سيثبت البروتوكول أنه أداة أساسية في الدراسات المتعلقة بال أكتين في مجال علم الأعصاب، فضلا عن مجالات أخرى من بحوث العلوم البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مؤسسة الأعصاب في نيوزيلندا (1835-PG)، ومجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا (#16-597)، وقسم التشريح، جامعة أوتاجو، نيوزيلندا. نحن مدينون لبنك الأنسجة العصبية من بنك HCB-IDIBAPS الحيوي (إسبانيا) لأنسجة الدماغ البشري. نشكر جياشيان تشانغ على مساعدتها في تسجيل وتحرير الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Tags

التراجع، العدد 172، السيبتوسومات، السونابتونوروسومات، F-actin، الهيكل الخلوي، إزالة الاستقطاب، لاتورونكولين A، phalloidin، الفلوري
مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient… More

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter