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Neuroscience

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.

Abstract

Actin, der Hauptbestandteil des Zytoskeletts, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Struktur und Funktion. Unter physiologischen Zuständen tritt Aktin im Gleichgewicht in seinen zwei Formen auf: monomeres kugelförmiges (G-Aktin) und polymerisiertes Filament (F-Aktin). An den synaptischen Terminals bildet das Aktin-Zytoskelett die Grundlage für kritische prä- und postsynaptische Funktionen. Darüber hinaus sind dynamische Veränderungen des Aktinpolymerisationsstatus (Interkonversion zwischen kugelförmigen und filamentösen Formen von Aktin) eng mit plastizitätsbedingten Veränderungen der synaptischen Struktur und Funktion verbunden. Wir berichten hier über eine modifizierte fluoreszenzbasierte Methodik zur Beurteilung des Polymerisationsstatus von Aktin unter Ex-vivo-Bedingungen. Der Assay verwendet fluoreszierend markiertes Phalloidin, ein Phallotoxin, das spezifisch an Aktinfilamente (F-Actin) bindet und ein direktes Maß für polymerisiertes filamentöses Aktin liefert. Als Proof of Principle liefern wir den Nachweis für die Eignung des Assays sowohl in Nagetier- als auch in postmortalen menschlichen Hirngewebehomogenaten. Mit Latrunculin A (einem Medikament, das Aktinfilamente depolymerisiert) bestätigen wir den Nutzen des Assays bei der Überwachung von Veränderungen der F-Aktinspiegel. Darüber hinaus erweitern wir den Assay auf biochemische Fraktionen isolierter synaptischer Terminals, wobei wir eine erhöhte Aktinpolymerisation bei Stimulation durch Depolarisation mit hohem extrazellulärem K+bestätigen.

Introduction

Cytoskelettprotein Aktin ist an mehreren zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich struktureller Unterstützung, zellulärem Transport, Zellmotilität und -teilung. Aktin kommt im Gleichgewicht in zwei Formen vor: monomeres kugelförmiges Aktin (G-Aktin) und polymerisiertes filamentöses Aktin (F-Aktin). Schnelle Veränderungen im Polymerisationsstatus von Aktin (Interkonversion zwischen seinen G- und F-Formen) führen zu einem schnellen Auf- und Abbau von Filamenten und liegen seiner regulatorischen Rolle in der Zellphysiologie zugrunde. Aktin bildet den Hauptbestandteil der neuronalen Zytoskelettstruktur und beeinflusst ein breites Spektrum neuronaler Funktionen1,2. Bemerkenswert ist, dass das Aktin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil der strukturellen Plattform der synaptischen Terminals ist. Als solches ist es eine wichtige Determinante der synaptischen Morphogenese und Physiologie und spielt eine grundlegende Rolle bei der Kontrolle der Größe, Anzahl und Morphologie der Synapsen3,4,5. Insbesondere die dynamische Aktinpolymerisation-Depolymerisation ist eine Schlüsseldeterminante des synaptischen Umbaus, der mit der synaptischen Plastizität verbunden ist, die den Gedächtnis- und Lernprozessen zugrunde liegt. Tatsächlich hängen sowohl präsynaptische (wie Neurotransmitterfreisetzung6,7,8,9,10) als auch postsynaptische Funktionen (plastizitätsbezogene dynamische Umgestaltung11,12,13,14) kritisch von dynamischen Veränderungen des Polymerisationsstatus des Aktin-Zytoskeletts ab.

Unter physiologischen Bedingungen werden die F-Aktinspiegel dynamisch und eng durch einen multimodalen Weg reguliert, der posttranslationale Modifikation4,15,16 sowie Aktin-bindende Proteine (ABPs)4,17umfasst . ABPs können die Aktindynamik auf mehreren Ebenen beeinflussen (z. B. Initiierung oder Hemmung der Polymerisation, Induktion von Filamentverzweigungen, Durchtrennen von Filamenten in kleinere Stücke, Förderung der Depolymerisation und Schutz vor Depolymerisation) und stehen wiederum unter einer strengen modulatorischen Kontrolle, die empfindlich auf verschiedene extra- und intrazelluläre Signalereagiert 18,19,20. Solche regulatorischen Kontrollen auf mehreren Ebenen diktieren eine strenge Regulierung der Aktindynamik am synaptischen Zytoskelett und verfeinern prä- und postsynaptische Aspekte der neuronalen Physiologie sowohl im basalen als auch im aktivitätsinduzierten Zustand.

Angesichts der wichtigen Rolle von Aktin in der neuronalen Physiologie ist es nicht verwunderlich, dass mehrere Studien Hinweise auf Veränderungen der Aktindynamik als kritische pathogene Ereignisse im Zusammenhang mit einer Vielzahl von neurologischen Störungen wie Neurodegeneration, psychischen Erkrankungen sowie neurologischen Entwicklungsbeschwerden erbracht haben3,21,22,23,24,25,26,27. Trotz der Fülle von Forschungsdaten, die auf eine Schlüsselrolle von Aktin in der neuronalen Physiologie und Pathophysiologie hinweisen, bestehen jedoch noch erhebliche Lücken im Verständnis der Aktindynamik, insbesondere am synaptischen Zytoskelett. Weitere Forschungsstudien sind erforderlich, um ein besseres Verständnis von neuronalem Aktin und seinen Veränderungen unter pathologischen Bedingungen zu haben. Ein Schwerpunkt in diesem Zusammenhang ist die Beurteilung des Aktinpolymerisationsstatus. Es gibt kommerzielle Kits auf Basis von Western Blotting (G-Actin / F-Actin in vivo Assay biochemisches Kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) und hausgemachte Assays zur Beurteilung der F-Aktin-Spiegel6. Da diese jedoch eine biochemische Isolierung von F-Aktin und G-Aktin erfordern und ihre anschließende Quantifizierung auf Immunblotting-Protokollen basiert, können sie zeitaufwändig sein. Wir berichten hier über einen auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Assay, der aus einer früheren Studie30 mit Modifikationen angepasst wurde, die verwendet werden können, um sowohl den basalen Gehalt an F-Aktin als auch dynamische Veränderungen in seiner Montage-Demontage zu bewerten. Insbesondere haben wir das ursprüngliche Protokoll, das Proben erfordert, die für eine 1-ml-Küvette geeignet sind, effizient auf das aktuelle 96-Well-Plattenformat modifiziert. Das modifizierte Protokoll hat daher die für den Assay erforderliche Gewebe-/Probenmenge deutlich reduziert. Darüber hinaus liefern wir den Nachweis, dass das Protokoll nicht nur für Hirngewebehomogenate, sondern auch für subzelluläre Fraktionen wie isolierte synaptische Terminals (Synaptosomen und Synaptoneurosomen) geeignet ist. Schließlich kann der Assay für frisch seziertes Nagetier-Hirngewebe und langfristig gelagerte postmortale menschliche Gehirnproben eingesetzt werden. Bemerkenswert ist, dass der Assay zwar in einem neuronalen Kontext präsentiert wird, aber in geeigneter Weise auf andere Zelltypen und damit verbundene physiologische Prozesse ausgedehnt werden kann.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des University of Otago Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (Ethics Protocol No. AUP95/18 und AUP80/17) und neuseeländischer Gesetzgeber. Menschliches Hirngewebe wurde aus der Neurologischen Gewebebank des Krankenhauses Clínic-IDIBAPS BioBank in Barcelona, Spanien, gewonnen. Alle Gewebeentnahmeprotokolle wurden von der Ethikkommission des Krankenhauses Clínic, Barcelona, genehmigt und die Einwilligung der Familien nach Aufklärung eingeholt.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Bereiten Sie die folgenden Puffer für die Homogenisierung von Hirngewebe und die Herstellung einer angereicherten Fraktion synaptischer Terminals vor:
    Homogenisierungspuffer: 5 mM HEPES, pH 7,4 ergänzt mit 0,32 M Saccharose
    Resuspensionspuffer: 5 mM Tris, pH 7,4 ergänzt mit 0,32 M Saccharose
    Waschpuffer: 5 mM Tris, pH 8,1
    1,2 M Saccharose
    1,0 M Saccharose
    0,85 M Saccharose
  2. Fügen Sie hausgemachte oder kommerzielle Mischung aus Protease- und Phosphatasehemmern hinzu.
    HINWEIS: Wir haben die EDTA-freie Version der Complete Protease Inhibitor Mix (1 Tablette pro 10 ml Puffer) und des Phosphatase-Inhibitor-Cocktails IV (1:100; Volumen: Volumen) verwendet.
  3. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Reagenzien für die Fixierung, Permeabilisierung und Bindung von Phalloidin vor:
    Krebspuffer: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM Glukose, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% Glutaraldehyd (Stammlösung)
    Krebspuffer mit 0,1 % Triton X-100 und 1 mg/ml NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO
    Krebspuffer mit 0,32 M Saccharose
    50 μM Latrunculin A in DMSO (Standardlösung)
    1 M KCl (Lagerlösung)
    ACHTUNG: Phalloidin ist giftig (LD50 = 2 mg/kg) und muss mit Vorsicht behandelt werden. Das Einatmen von Glutaraldehyd ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
  4. Lagern Sie die Puffer bei 4 °C und Phalloidin und Latrunculin A bei -20 °C zur Langzeitlagerung.
    HINWEIS: Die langfristige Lagerung von Puffern wird nicht empfohlen. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

2. Homogenisierung des Hirngewebes

  1. Homogenisieren Sie das kryokonservierte oder frisch sezierte Rattenhirngewebe in 10 Volumina Homogenisierungspuffer in einemPotter-Elvehjem-Glasrohr und Stößel auf Eis.
    HINWEIS: Eine optimale Homogenisierung wird durch 15-20 Schläge des Stößels von Hand für Hirngewebe erreicht. Eine erfolgreiche Homogenisierung kann durch einen reibungslosen Fluss der Suspension durch das Glasrohr bestätigt werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration im Homogenat mit einem Bradford-Assay31.
    HINWEIS: Alternative hausgemachte oder kommerzielle Assays zur Proteinschätzung können ebenfalls verwendet werden.
  3. Homogenatproben in Krebspuffer in einer Konzentration von 2-3 mg Protein/ml in einem Volumen von 50 μL verdünnen.
    HINWEIS: In einigen unserer Experimente inkubieren wir Homogenate mit 2 μM Latrunculin A oder DMSO (Kontrollen) bei 37 °C für 1 h. Dazu werden Homogenate in 48 μL Krebspuffer resuspendiert und 2 μL 50 μM Latrunculin A oder 2 μL DMSO zugegeben. Weiterhin wird für das Immunoblotting nach der Inkubation eine kleine Menge der Probe (10 μg) gesammelt.
  4. Fixieren Sie die Homogenatproben (Abschnitt 5).

3. Vorbereitung isolierter Nervenbahnen

  1. Herstellung von Synaptosomen
    HINWEIS: Alternative Protokolle32,33 für Synaptosomen können ebenfalls verwendet werden.
    1. Zentrifugenhirnhomogenat bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C.
    2. Entsorgen Sie das Pellet, das die rohe Kernfraktion ist.
    3. Weitere Zentrifuge des in Schritt 3.1.1 erhaltenen Überstandes (S1) bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
    4. Entfernen Sie den Überstand (S2), der die lösliche zytosolische Fraktion ist.
    5. Resuspend das in Schritt 3.1.3 erhaltene Pellet (P2), das die rohe synaptosomale Fraktion im Resuspensionspuffer ist.
      HINWEIS: Das Volumen des Resuspensionspuffers hängt von der Menge des Ausgangsgewebes und der Menge des erhaltenen Pellets ab. Zum Beispiel, wenn mit 150-300 mg Hirngewebe begonnen wird, kann das erhaltene Pellet in 200 μL Resuspensionspuffer resuspendiert werden.
    6. Laden Sie die resuspendierten rohen Synaptosomen auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten aus gleichen Volumina von 0,85-1,0-1,2 M Saccharose.
      HINWEIS: Wir verwenden typischerweise jeweils 1 ml saccharoselösung (für 150-300 mg Gewebe). Dies kann bei größeren Gewebemengen entsprechend geändert werden. Diskontinuierliche Gradienten können mit einer 25G-Spritze, die gegen die Innenwand des Ultrazentrifugenröhrchens gedrückt wird, und einer sanften Schichtung der Saccharoseschichten hergestellt werden.
    7. Zentrifuge bei 85.000 x g für 2 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Aufgrund der hohen Zentrifugationsgeschwindigkeit ist eine Ultrazentrifuge erforderlich, die in der Lage ist, ein Vakuum zu erzeugen, um die Erwärmung zu reduzieren.
    8. Sammeln Sie die synaptosomale Fraktion an der Grenzfläche zwischen 1,0 und 1,2 M Saccharose mit einer 200 μL Pipettspitze.
    9. Die synaptosomale Fraktion mit eiskaltem Waschpuffer durch Zentrifugation bei 18.000 x g 10 Minuten bei 4 °C waschen.
      HINWEIS: Zum Waschen wird die synaptosomale Fraktion, die an der Grenzfläche von 1,0 und 1,2 M Saccharose erhalten wird, in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen gesammelt und ein gleiches Volumen Waschpuffer hinzugefügt, um die Entfernung von hoher Saccharose aus dem Medium sicherzustellen.
    10. Waschen Sie das synaptosomale Pellet erneut mit eiskaltem Homogenisierungspuffer bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4 °C.
    11. Resuspend die Synaptosomen im Homogenisierungspuffer auf Eis.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier kurz pausiert werden.
    12. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay.
    13. Die Synaptosomen im Krebspuffer werden in einer Konzentration von 2-3 mg Protein/ml in einem Volumen von 50 μL (47,5 μL, wenn Synaptomsomen durch KCl depolarisiert werden sollen; siehe Abschnitt 4) wieder aufgewendet.
      HINWEIS: Zur Resuspension wird die synaptosomale Fraktion zunächst bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C gesponnen und der Überstand (Puffer) entfernt. Das synaptosomale Pellet wird dann durch sanftes Pipettieren mit einer 200 μL Pipettspitze im Krebspuffer resuspendiert.
    14. Fahren Sie mit der Depolarisation fort (Abschnitt 4).
  2. Herstellung von Synaptoneurosomen
    HINWEIS: Alternative Protokolle34,35 für Synaptoneurosomen können ebenfalls verwendet werden.
    1. Das Gehirn homogenisieren Sie durch einen vorbenetzten Netzfilter von 100 μm Porengröße in einem Filterhalter mit einer 1-ml-Spritze.
      HINWEIS: Die Vorbenetzung aller Filter ist wichtig, um Probenverlust zu vermeiden, und sollte mit einem Homogenisierungspuffer erfolgen. Dazu wird der Homogenisierungspuffer mit einer 1 mL Spritze durch die Filter im Filterhalter geleitet, bis der Puffer ausströmt.
    2. Sammeln Sie das Filtrat (F1) in einem vorgekühlten 1,5 ml Röhrchen auf Eis.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.2.1 und 3.2.2) für die F1-Fraktion, um das zweite Filtrat (F2) zu erhalten.
    4. F2-Filtrat durch einen Nettofilter von 5 μm Porengröße leiten.
    5. Sammeln Sie das Filtrat (F3) in einem vorgekühlten 1,5 ml Röhrchen auf Eis.
    6. Zentrifugenfiltrat F3 bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C.
    7. Das Pellet (Synaptoneurosomen) im Krebspuffer auf Eis in einer Konzentration von 2-3 mg Protein/ml in einem Volumen von 50 μL (47,5 μL, wenn Synapptosomen durch KCl depolarisiert werden sollen; siehe Abschnitt 4) wird wieder aufgewendet.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier kurz pausiert werden.
    8. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay.
    9. Fahren Sie mit der Depolarisation fort (Abschnitt 4).

4. KCl-vermittelte Depolarisation isolierter synaptischer Klemmen

  1. Synaptosomen/Synaptoneurosomen bei 37 °C für 5-10 min ausgleichen.
  2. Stimulieren Sie Synaptosomen/Synaptoneurosomen durch Zugabe von KCl, um extrazelluläres K+ auf 50 mM für 30 s bei 37 °C zu erhöhen und dem jeweiligen unstimulierten Kontrollsatz das gleiche Volumen an Krebspuffer hinzuzufügen.
    HINWEIS: Fügen Sie beispielsweise 2,5 μL 1 M KCl zu Synaptosomen hinzu, die in 47,5 μL Krebspuffer resuspendiert wurden; und fügen Sie 2,5 μL Krebspuffer zum jeweiligen unstimulierten Kontrollsynaptom hinzu. Bei Experimenten, bei denen eine große Anzahl von Proben beteiligt ist, gehen Sie mit nicht mehr als 2 Proben gleichzeitig vor, so dass die Depolarisationszeit 30 s nicht überschreitet.
  3. Beenden Sie die Stimulation durch Zugabe von Glutaraldehyd (Abschnitt 5).

5. Fixierung und Phalloidinfärbung von Proben

  1. Glutaraldehyd wird zu homogenaten/synaptosomalen/synaptoneurosomalen Proben in einer Endkonzentration von 2,5% für 2-3 min bei Raumtemperatur hinzugefügt.
    HINWEIS: Wir haben 6 μL 25% ige Glutaraldehydlösung zugegeben, so dass die Endkonzentration von Glutaraldehyd in den 50 μL-Proben (Homogenate/Synaptosomen/Synaptoneurosomen) ca. 2,5% betrug. Die Fixierung ist kritisch und sollte schnell sein und daher sollte die Probe unmittelbar nach Zugabe von Glutaraldehyd kräftig vortexiert werden.
  2. Sedimentieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 5 min.
  3. Entfernen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Verwerfen Sie den Überstand in einem Abzug, da Glutaraldehyd giftig ist.
  4. Permeabilisieren Sie das Pellet durch Resuspension in 100 μL Krebspuffer mit 0,1% Triton X-100 und 1 mg/ml NaHB4 für 2-3 min bei Raumtemperatur.
  5. Sedimentieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 5 min.
  6. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer.
  7. Das Pellet mit 200 μL Krebspuffer durch Zentrifugation bei 20.000 x g 5 min waschen.
  8. Das Pellet mit 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (entsprechend 500 μU) in 100 μL Krebspuffer für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur wieder aufbereiten und einfärben.
    HINWEIS: Andere Arten von fluoreszierenden Phalloidin-Analoga sind im Handel erhältlich und können für den Assay ersetzt werden. Die Konzentration von Phalloidin und das Gesamtprobenvolumen der Inkubation müssen möglicherweise entsprechend der Menge und Art des zu testenden Gewebes/ der Probe geändert werden, und die optimalen Bedingungen sollten entsprechend standardisiert werden.
  9. Zentrifuge die gefärbten Proben bei 20.000 x g für 5 min.
  10. Entfernen Sie das ungebundene Phalloidin (Überstand).
  11. Waschen Sie die Probe mit 200 μL Krebspuffer durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 5 min.
  12. Resuspend in 200 μL Krebspuffer mit 0,32 M Saccharose.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier kurz pausiert werden.

6. Fluorometrische Analyse und Lichtstreuung

  1. Verteilen Sie Alexa Fluor 647 Phalloidin-gefärbte Proben in einer schwarzen 96-Well-Platte.
  2. Messen Sie die Fluoreszenzintensität bei einer Anregungswellenlänge von 645 nm und einer Emissionswellenlänge von 670 nm in einem Plattenleser bei Raumtemperatur.
  3. Übertragen Sie die Proben von der schwarzen 96-Well-Platte auf die transparente 96-Well-Platte mit 200 μL-Pipetenspitzen.
  4. Messen Sie die Lichtstreuung bei 540 nm, um Verluste zu korrigieren, die während der vorherigen Schritte der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung aufgetreten sein könnten.
    HINWEIS: Variationen des biologischen Materials, das in den gefärbten Proben zurückgehalten wird, können bei kleineren Mengen an Ausgangsmaterial stärker ausgeprägt sein (siehe Diskussion).
  5. Fügen Sie einen Satz Alexa Fluor 647 Phalloidin in Krebspuffer in verschiedenen Konzentrationen (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x und 1x entsprechend 25, 50, 125, 175, 250, 375 und 500 μU) für jede Charge des Assays als Standardkurve ein.
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse des Assays, insbesondere wenn die F-Actin-Spiegel relativ ausgedrückt werden (Abschnitt 7). Das Protokoll kann hier pausiert werden.

7. Datenanalyse

  1. Die Menge an F-Aktin in den Proben ist direkt proportional zur Fluoreszenzintensität von gebundenem Phalloidin. Ausgedrückt in absoluten Zahlen der Einheiten von Phalloidin gebunden, berechnet aus der linearen Kurve des markierten Phalloidin-Standards.
    HINWEIS: Als Beispiel siehe Abbildungen 2A-B, 3A, 4A-B und ergänzende Abbildung 2.
  2. Drücken Sie den F-Aktingehalt als Bruchteil der Kontrollproben aus.
    HINWEIS: Als Beispiel siehe Abbildungen 5A-B.

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Representative Results

Linearität des Assays zur Bewertung der F-Aktin-Spiegel
Zunächst wurde eine Standardkurve für den linearen Anstieg der Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 Phalloidin ermittelt und für jede Reihe von Experimenten wiederholt(Abbildung 1). Um den linearen Bereich des Assays zu untersuchen, wurden unterschiedliche Mengen an Hirnhomogenaten von Nagetieren (Abbildungen 2A und 2B) und postmortalen menschlichen Probanden (Abbildung 3A und 3B) verarbeitet. Der Assay erwies sich als linear im Bereich von 50-200 μg Protein, bewertet anhand der Mengen an markiertem Phalloidin, die zurückgehalten wurden. Zur Bestätigung der unterschiedlichen Probenmengen wurde eine Lichtstreuung bei 540 nm verwendet (Abbildung 2C und Abbildung 3C).

Latrunculin, ein Aktin-Depolymerisationsmittel, reduziert die Bindung von markiertem Phalloidin
Latrunculin A ist dafür bekannt, Aktinfilamente zu depolymerisieren und den Gehalt an F-Actin36,37,38,39zu reduzieren . Homogenate aus Nagetier- oder menschlichem Hirngewebe wurden mit 2 μM Latrunculin A für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, um Aktinfilamente zu depolymerisieren. Entsprechende unbehandelte Regelsätze wurden mit DMSO für die gleiche Dauer von 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der Assay maß robust den Verlust der F-Actin-Spiegel von 95,7 ± 6,6 (mittlere ± REM) in Kontrollproben auf 72,0 ± 3,2 (mittlere ± REM) μU gebundenes Phalloidin in Latrunculin A-behandelten Proben in Nagetier-Hirnhomogenaten(Abbildung 4A). Eine ähnliche Abnahme (von 83,7 ± 3,9 auf 66,9 ± 4,2 μU) bei der Retention von markiertem Phalloidin wurde auch beobachtet, wenn Homogenate aus menschlichem Hirngewebe einer Latrunculin-A-Behandlung unterzogen wurden (Abbildung 4B). Bemerkenswert ist, dass sich die Gesamtaktinspiegel, wie sie durch Immunblotting beurteilt wurden, bei der Behandlung mit Latrunculin A sowohl bei Ratten (Ergänzende Abbildung 1A-B) als auch bei menschlichen (Ergänzende Abbildung 1C-D) Gehirnhomogenaten nicht veränderten.

Depolarisation isolierter synaptischer Terminalsstimuliert Aktinpolymerisation und Filamentbildung
Es wurde gezeigt, dass die Ex-vivo-Depolarisation isolierter synaptischer Terminals zu einer schnellen Stimulation der Aktinpolymerisation6,30,40führt, und dieses Phänomen wurde als weitere Bestätigung des hier berichteten Assays verwendet. Biochemische Fraktionen, die in synaptischen Terminals angereichert waren, wurden auf zwei verschiedene Arten hergestellt; ein gradientenbasiertes Ultrazentrifugationsverfahren zur Gewinnung von "Synaptosomen"41,42,43,44 und ein sequenzielles filtrationsbasiertes Protokoll zur Gewinnung von "Synaptoneurosomen"43,45,46. Da der Ertrag für Letzteres höher ist, haben wir es für menschliches postmortales Hirngewebe verwendet, wobei die Gewebemengen oft limitierend sind. Auf der anderen Seite bevorzugten wir Synaptosomen mit einem höheren Anreicherungsgrad von synaptischen Fragmenten41 für unsere Ratten-Hirngewebe-Experimente.

Die Depolarisation von Synaptosomen oder Synaptoneurosomen und die Stimulation der Aktinpolymerisation wurden durch einen kurzen (30 Sekunden) Anstieg des extrazellulären K+ auf 50 mM erreicht. Die KCl-Exposition führte zu einer um fast 40% erhöhten Phalloidinbindung in Nagetier-Hirnsynaptomen im Vergleich zu den jeweiligen mock-stimulierten Kontrollen (Abbildung 5A; siehe auch ergänzende Abbildung 2A). Eine kleinere (ca. 20%) ein konstanter Anstieg wurde jedoch auch bei humanen Synaptoneurosomen beobachtet, die mit KCl behandelt wurden (Abbildung 5B; siehe auch Ergänzende Abbildung 2A). Diese Experimente bestätigen die Robustheit unseres Assays bei der Bestimmung von Veränderungen des F-Aktinspiegels in Hirngewebeproben, einschließlich isolierter synaptischer Terminals.

Figure 1
Abbildung 1. Standardkurve für die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 Phalloidin.  Die Linearität der Fluoreszenzemission unterschiedlicher Mengen (25-500 μU) von markiertem Phalloidin wurde durch Fluoreszenzspektroskopie bei einer Anregung von 645 nm und einer Emission von 670 nm(R2 = 0,9942) bestätigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n=3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Linearität der Phalloidinbindung an Ganzzellhomogenate aus Rattengehirngewebe.  (A) Die Bindung von Phalloidin an unterschiedliche Mengen an Homogenaten (50-300 μg Protein) wurde bewertet. (B) Die Bindung war linear im Bereich von 50-200 μg Protein(R2 = 0,9602). (C) Streuung bei 540 nm wurde verwendet, um unterschiedliche Mengen der Proben zu bestätigen (R2 = 0,8319). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n=4) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Phalloidin bindet an Ganzzellhomogenate aus postmortalem menschlichem Hirngewebe.  (A) Die Phalloidinretention in einer Reihe von Homogenatmengen (50-300 μg Protein) wurde bewertet. (B) Die Phalloidinbindung wurde als linear im Bereich von 50-200 μg Protein(R2 = 0,8832) gefunden. (C) Streuung bei 540 nm bestätigte die unterschiedlichen Mengen der Proben(R2 = 0,9730). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n=4) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Auswirkungen von Latrunculin A auf den F-Aktinspiegel.  Die Behandlung von Gehirnhomogenaten mit dem Aktin-Depolymerisationsmittel Latrunculin A (2 μM, 1 h bei 37 °C) führte zu einer signifikanten Abnahme der Mengen an Aktinfilamenten im Vergleich zu den jeweiligen nachbehandelten Kontrollproben, die durch Retention von markiertem Phalloidin sowohl bei Nagetieren (p = 0,0034; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test)(A) als auch bei postmortalem menschlichem Gewebe (p = 0,0011; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test)(B) beurteilt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt (n=6 Paare). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5. Auswirkungen der KCl-vermittelten Depolarisation auf F-Aktinmengen in isolierten synaptischen Terminals.  (A) Inkubation von Synaptosomen aus dem Rattengehirn mit 50 mM KCl für 30 s bei 37°C stimulierte Die Aktinpolymerisation, die folglich zu einer Erhöhung der Phalloidinbindung führte (p = 0,0014; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test). (B) Ein geringerer Anstieg wurde auch bei der synaptoneurosomalen Fraktion aus postmortalem menschlichem Hirngewebe beobachtet (p = 0,014; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt (n=6 Paare). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1. Auswirkungen von Latrunculin A auf den Gesamtaktinspiegel.  Gehirnhomogenate wurden mit Latrunculin A (2 μM, 1 h bei 37 °C) oder gleichem DMSO-Volumen (1 h bei 37 °C) inkubiert. 10 μg Protein pro Probe (Latrunculin A behandelt und DMSO Mock-behandelte Kontrollen) wurden vor der Fixierung gesammelt. Die Gesamtaktinspiegel wurden durch Immunblotting beurteilt. Repräsentative Blots werden für Ratten (A) und menschliche (C) Gehirnhomogenate gezeigt. Latrunculin A veränderte nicht die Gesamtaktinspiegel sowohl bei Ratten (B; p = 0,40; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test)als auch bei Menschlichen (D; p = 0,42; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test) Gehirnhomogenaten. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n=3 Paare) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Auswirkungen der KCl-vermittelten Depolarisation auf den F-Aktinspiegel in Rattensynptosomen und menschlichen Synaptoneurosomen.  (A) Inkubation von Synaptosomen aus dem Rattengehirn mit 50 mM KCl (30 s bei 37 °C) stimulierte die Aktinpolymerisation und eine daraus resultierende Erhöhung der Phalloidinbindung (p = 0,0019; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test). (B) Ein Anstieg der Phalloidinretention wurde auch bei der durch KCl depolarisierten menschlichen synaptoneurosomalen Fraktion im Vergleich zu den jeweiligen unstimulierten Kontrollen beobachtet (p = 0,015; gepaarter zweiseitiger Student's t-Test). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt (n=6 Paare). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Der hier beschriebene Assay, der im Wesentlichen aus einer früheren Studie30 mit Modifikationen adaptiert wurde, verwendet ein Phallotoxin, Phalloidin, das mit einem fluoreszierenden Etikett gekennzeichnet ist. Fluoreszierende Phalloidin-Analoga gelten als Goldstandard für die Färbung von Aktinfilamenten in festen Geweben47,48,49. Tatsächlich sind sie die ältesten Werkzeuge zur spezifischen Identifizierung von Aktinfilamenten50 und sind nach wie vor die am weitesten verbreiteten Instrumente zum Nachweis von Aktinfilamenten, insbesondere für nachfolgende fluoreszenzmikroskopische Analysen. Wichtig ist, dass Phalloidin nachweislich sogar lose, unregelmäßige Geflechte von kurzen Aktinfilamenten51färbt, was darauf hindeutet, dass die Phalloidinbindung nicht von der Filamentlänge abhängt. Unser Protokoll hingegen stützt sich auf Fluoreszenzspektroskopie, um die Aktindynamik in ex vivo biologischen Proben zu analysieren, zum Beispiel Hirngewebe von Nagetieren und Menschen.

Der Hauptvorteil des Protokolls besteht darin, dass es die Zeit in Bezug auf die bestehenden Protokolle erheblich reduziert, die zunächst eine hochgeschwindigkeitszentrifugationsbasierte biochemische Isolierung von F-Actin (Trennung von G-Aktin basierend auf der Unlöslichkeit von Aktinfilamenten in bestimmten Detergenzien wie Triton X-100) und anschließende Analyse der immunreaktiven Konzentrationen mit Western Blottingerfordern 6,28,29. Die Zeiteffizienz unseres Assays ist auch ein Vorteil in Bezug auf Phalloidin-basierte immunzytochemische Techniken40,52, obwohl es einige andere Vorteile geben könnte, die mit letzterem verbunden sein könnten. Ein weiterer Vorteil ist, dass es auf kryokonserviertes postmortales menschliches Hirngewebe angewendet werden kann, dessen Beschaffung immer mit einer postmortalen Verzögerung verbunden ist. Darüber hinaus haben wir in Bezug auf das ursprüngliche Protokoll30, von dem diese Methodik modifiziert wurde, den Bedarf an der Gewebemenge von 1 ml Küvette auf eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte erheblich reduziert. Darüber hinaus kann unser Protokoll aufgrund der Einbeziehung einer Phalloidin-Standardkurve in jedem Experiment die absoluten Konzentrationen von Aktinfilamenten in Einheiten von Phalloidin gebunden quantifizieren (Abbildungen 2A-B, 3A, 4A-B; siehe auch Ergänzende Abbildung 2) sowie die Gehalte relativ zu Kontrollproben (Abbildung 5A-B).

Es sei darauf hingewiesen, dass die Anwendung von Phalloidin zur Beurteilung des F-Aktinspiegels jedoch auf feste Zellen und Proben beschränkt ist, sowohl für unser Assay-Protokoll als auch für mikroskopiebasierte Protokolle. Dies liegt daran, dass Phalloidin im Wesentlichen ein toxisches bicyclisches Heptapeptid ist, das spezifisch an der Grenzfläche zwischen F-Aktin-Untereinheiten mit hoher Affinität bindet und diese Aktinfilamente stabilisiert, wodurch sie nicht depolymerisiert werden können und tatsächlich die Nettoumwandlung von G-Aktin in F-Aktin40,53,54erhöht wird. Daher stabilisiert Phalloidin Aktinfilamente in vivo und in vitround kann zu signifikanten Veränderungen des Gleichgewichtsstatus von Aktin an sichführen47,55. Daher basiert die Bewertung des Durch fluoreszierendes Phalloidin vermittelten Aktinpolymerisationsstatus auf arrestn Filamentstrukturen. Darüber hinaus beruhen Phalloidin-basierte Methoden aufgrund ihrer geringen Permeabilität durch die Lipiddoppelschicht auf der Permeabilisierung der Zellen oder biologischen Proben. Die Undurchführbarkeit eines Zeitverlaufs-Lebendzellassays ist daher eine wesentliche Einschränkung des Protokolls, wie bei immunzytochemischen Methoden, die Phalloidin verwenden.

Die Undurchführbarkeit von Phalloidin-basierten Methoden zur Bewertung dynamischer Veränderungen von Aktinfilamenten in lebenden unfixierten Zellen wirft die Frage auf, ob es alternative Verfahren dazu gibt. Tatsächlich wurden in dieser Hinsicht Fortschritte bei der exogenen Expression von Fluoreszenz-Aktin-Analoga vor der Analyse unter Verwendung von Protokollen wie Videomikrographie36,56, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleaching (FRAP)38 oder Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)39erzielt . Die heterologe Expression von fluoreszierend markierten Peptiden und Proteinen, die Aktinfilamente binden, wird auch verwendet, um die Aktindynamik in lebenden Zellen zu untersuchen. es gibt jedoch Nachteile und Einschränkungen, die mit ihnen sowie mit der heterologen Expression von fluoreszierend markiertem Aktin47,49,57verbunden sind. Zum Beispiel ist G-Aktin, das 50-70% des gesamten Aktins in den meisten Zellen ausmacht, im Zytosol löslich und frei diffusibel, was zu einem höheren Hintergrund führt, der Herausforderungen bei der Unterscheidung von Signalen von Aktinfilamenten verursacht, insbesondere57.

Ein kritischer Faktor im Assay ist, wie in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt; es ist nicht linear über den gesamten Bereich der getesteten Proteinmengen. Daher sollte zuerst eine optimale Menge an Protein bestimmt werden, die für den Assay geeignet ist, oder die Menge an Phalloidin-Analogon sollte so angepasst werden, dass sie nicht mehr limitierend ist (bei höheren Mengen an Proteinen). Ein weiterer kritischer Aspekt des Protokolls ist, dass die multiplen zentrifugationsbasierten Schritte zur Entfernung von fixativem Permeabilisierungsmittel und ungebundenem Phalloidin zu einem unterschiedlichen Verlust von Proteinen (und F-Actin-gebundenem Phalloidin) aus den Proben führen können, insbesondere wenn geringere Mengen an Proben verwendet werden. Daher ist es wichtig, die Menge der zurückgehaltenen Probe durch Überwachung der Lichtstreuung bei 540 nm zu normalisieren. Da sich Aktin in einem dynamischen Zustand der Interkonversion zwischen seinen F- und G-Formen befindet, sollte die Fixierung schnell erfolgen. Ein kleiner kritischer Aspekt des Assays ist, dass wir seine Effizienz bei der Beurteilung der pharmakologischen Aktinpolymerisation nicht bewerten konnten. Im Gegensatz zur pharmakologischen Aktindepolymerisation durch Latrunculin A hat Jasplakinolid (ein zuverlässiges und weit verbreitetes Aktinpolymerisationsmittel) überlappende Bindungsstellen mit Phalloidin und hemmt kompetitiv seine Bindung an Aktinfilamente58,59. Nichtsdestotrotz deutet die Nutzung von KCl-stimulierten synaptischen Terminals als Ex-vivo-Modell für eine erhöhte Aktinpolymerisation darauf hin, dass unser Assay auch einen Anstieg des F-Aktinspiegels nachweisen kann.

Abschließend beschreiben wir einen robusten zeiteffizienten und hochdurchsatzreichen Assay zur Analyse von Aktinfilamenten (F-Actin) und deren Wechsel in physiologischen und pathophysiologischen Zuständen, die für ein 96-Well-Plattenformat geeignet sind. In Kombination mit anderen bestehenden Methoden zur Bewertung von F-Aktin in fixierten und unfixierten Proben wird sich das Protokoll als wesentliches Werkzeug in Aktin-bezogenen Studien im bereich der Neurowissenschaften sowie in anderen Bereichen der biologischen Forschung erweisen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), dem New Zealand Health Research Council (#16-597) und dem Department of Anatomy der University of Otago, Neuseeland, unterstützt. Wir sind der Neurologischen Gewebebank der HCB-IDIBAPS BioBank (Spanien) für menschliches Hirngewebe zu Dank verpflichtet. Wir danken Jiaxian Zhang für ihre Hilfe bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

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Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

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