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Neuroscience

आनुवंशिक रूप से लक्षित रेटिना सेल आबादी के विरल एडेनो-एसोसिएटेड वायरस लेबलिंग का उपयोग करके न्यूरोनल आर्बराइजेशन का टाइम-लैप्स इमेजिंग

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62308
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

यहां, हम प्रसवोत्तर माउस रेटिना में न्यूराइट मॉर्फोजेनेसिस की जांच के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो समय-अंतराल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पष्टीकरण देता है। हम रेटिना सेल प्रकारों के विरल लेबलिंग और अधिग्रहण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं और पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस वैक्टर का उपयोग करके उनकी ठीक प्रक्रियाएं जो झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को क्रे-निर्भर तरीके से व्यक्त करती हैं।

Abstract

तंत्र की खोज करना जो डेंड्राइटिक आर्बर्स को पैटर्न करता है, विकास के दौरान डेंड्राइट्स को विज़ुअलाइज़ करने, छवि बनाने और विश्लेषण करने के तरीकों की आवश्यकता होती है। माउस रेटिना न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस और कनेक्टिविटी के सेल प्रकार-विशिष्ट तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। रेटिना उपप्रकारों का संगठन और संरचना अच्छी तरह से परिभाषित है, और विकास के दौरान विशिष्ट प्रकारों तक पहुंचने के लिए आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं। कई रेटिना सेल प्रकार भी अपने डेंड्राइट्स और / या अक्षतंतुओं को संकीर्ण परतों तक सीमित करते हैं, जो समय-अंतराल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। माउस रेटिना स्पष्टीकरण संस्कृतियों को confocal या multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लाइव सेल इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन अस्थायी और संरचनात्मक संकल्प के साथ इमेजिंग डेंड्राइट गतिशीलता के लिए अनुकूलित तरीकों की कमी है। यहां प्रस्तुत किया गया क्रे-लोक्स सिस्टम द्वारा चिह्नित विशिष्ट रेटिना आबादी के विकास को विरल रूप से लेबल और छवि बनाने की एक विधि है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) यहां उपयोग किए जाते हैं, जो झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को क्रे-निर्भर तरीके से व्यक्त करते हैं। नवजात चूहों में एएवी की इंट्राओकुलर डिलीवरी 4-5 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) द्वारा लक्षित सेल प्रकारों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उत्पादन करती है। झिल्ली फ्लोरोसेंट सिग्नल confocal इमेजिंग द्वारा पता लगाने योग्य हैं और ठीक शाखा संरचनाओं और गतिशीलता को हल करते हैं। 2-4 घंटे तक फैले उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो को इमेजिंग रेटिना फ्लैट-माउंट से प्राप्त किया जाता है जो ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) के साथ फैलता है। इसके अलावा प्रदान की गई deconvolution और तीन आयामी (3 डी) बहाव सुधार के लिए एक छवि postprocessing पाइपलाइन है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग बरकरार रेटिना में कई सेलुलर व्यवहारों को कैप्चर करने और न्यूराइट मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले उपन्यास कारकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। रेटिना में सीखी गई कई विकासात्मक रणनीतियां केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कहीं और तंत्रिका सर्किट के गठन को समझने के लिए प्रासंगिक होंगी।

Introduction

रेटिना न्यूरॉन्स के डेंड्राइट्स जटिल, अभी तक विशिष्ट, पैटर्न बनाते हैं जो तंत्रिका सर्किट के भीतर उनके कार्य को प्रभावित करते हैं। कशेरुक रेटिना में, रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) और एमेक्राइन सेल इंटरन्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार अद्वितीय डेंड्राइटिक आकारिकी होते हैं जो आर्बर आकार, स्थान, शाखा की लंबाई और घनत्व 1 में भिन्न होते हैं। प्रसवोत्तर विकास के दौरान, आरजीसी और एमेक्राइन कोशिकाएं एक न्यूरोपिल में विपुल डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं का विस्तार करती हैं, जिसे आंतरिक प्लेक्सिफॉर्म परत (आईपीएल) कहा जाता है, जहां वे फोटोरिसेप्टर सिग्नल 2 को प्रसारित करने वाले द्विध्रुवी सेल इनपुट प्राप्त करते हैं। जैसा कि चिक या ज़ेब्राफ़िश लार्वा में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले रेटिना आबादी के समय-अंतराल इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया गया है, डेंड्राइट मॉर्फोजेनेसिस अत्यधिक गतिशील 3,4,5 है। कुछ दिनों के भीतर, डेंड्राइटिक आर्बर्स का विस्तार, पुनर्निर्माण, और आईपीएल के संकीर्ण उपपरतों तक पहुंचता है, जहां वे चुनिंदा भागीदारों के साथ सिनैप्स करते हैं। arbors विकास पर विभिन्न संरचनात्मक गतिशीलता का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें शाखा के अलावा, पीछे हटने और स्थिरीकरण की सापेक्ष दरों में परिवर्तन होता है। Amacrine और RGC डेंड्राइट्स भी विभिन्न outgrowth और remodeling व्यवहार है कि प्रकार विशिष्ट arborization को प्रतिबिंबित कर सकते हैं प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, इन अध्ययनों ने व्यापक एमेक्राइन या आरजीसी आबादी को ट्रैक किया और लैमिनर लक्ष्यीकरण पर ध्यान केंद्रित किया, जो आकृति विज्ञान का सिर्फ एक पहलू है।

रेटिना उपप्रकारों में देखी गई विशाल रूपात्मक विविधता का उत्पादन करने वाले तंत्रों को खराब तरीके से समझा जाता है। इस समूह का उद्देश्य डेंड्राइट गतिशीलता और चूहों में परिभाषित रेटिना उपप्रकारों के आर्बर रीमॉडलिंग को कैप्चर करने के लिए एक विधि विकसित करना था। डेंड्राइट पैटर्निंग के सेल प्रकार-विशिष्ट तंत्र की पहचान करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं के डेंड्राइट व्यवहारों को देखने और मापने के तरीकों की आवश्यकता होती है। माउस रेटिना की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियां कॉन्फोकल या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग अध्ययनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। विकासशील रेटिना को विच्छेदित किया जाता है और एक फ्लैट स्पष्टीकरण में लगाया जाता है जिसे रिकॉर्डिंग चैंबर में कई घंटों के लिए चित्रित किया जा सकता है या सर्किटरी 6,7 पर सीमित प्रभावों के साथ कुछ दिनों में सुसंस्कृत किया जा सकता है। लाइव रेटिना न्यूरॉन्स को विभिन्न तकनीकों द्वारा लेबल किया जा सकता है, जिसमें इलेक्ट्रोड द्वारा डाई-फिलिंग, इलेक्ट्रोपोरेशन, लिपोफिलिक रंजक या प्लास्मिड के साथ लेपित कणों की बायोलिस्टिक डिलीवरी शामिल है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, जीन गन) को एन्कोडिंग करते हैं, साथ ही आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेल लेबल 7,8,9,10 . हालांकि, ये दृष्टिकोण विशिष्ट रेटिना उपप्रकारों की डेंड्राइट गतिशीलता इमेजिंग के लिए अक्षम हैं। उदाहरण के लिए, डाई-भरने के तरीके कम-थ्रूपुट हैं और ब्याज की कोशिकाओं को मज़बूती से लक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तंत्र और अतिरिक्त आनुवंशिक लेबल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सोमा में मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत पास के डेंड्राइट्स को अस्पष्ट कर सकते हैं।

बायोलिस्टिक जीन वितरण विधियां एक साथ दर्जनों कोशिकाओं को लेबल कर सकती हैं, लेकिन उच्च दबाव वाले कण वितरण और अलग-थलग रेटिना के रातोंरात इनक्यूबेशन से जुड़े कदम सेल फिजियोलॉजी और डेंड्रिटिक आउटग्रोथ से समझौता कर सकते हैं। यह पेपर प्रस्तावित करता है कि हाल के आनुवंशिक उपकरणों को सेल प्रकार और संरचनात्मक संकल्प के साथ प्रारंभिक डेंड्राइट गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, निम्नलिखित प्रयोगात्मक मानदंडों को देखते हुए। सबसे पहले, ठीक शाखाओं और फिलोपोडिया को हल करने के लिए जो विकासशील आर्बर्स पर हावी हैं, विधि को उज्ज्वल, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ न्यूरॉन्स को लेबल करना चाहिए जो पूरे आर्बर में प्रक्रियाओं को भरते हैं। प्रतिदीप्ति लेबलिंग इमेजिंग अवधि के दौरान photobleaching के कारण फीका नहीं होना चाहिए। फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट की एक किस्म उत्पन्न की गई है और चमक और photostability के आधार पर vivo / पूर्व vivo इमेजिंग 11 में उपयुक्तता के लिए तुलना की गई है। दूसरा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एक्सएफपी) को डेंड्राइट मॉर्फोजेनेसिस के शुरुआती चरण द्वारा पर्याप्त रूप से उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाना चाहिए, ताकि संकीर्ण विकास खिड़की को याद न किया जा सके। माउस रेटिना में स्थैतिक टाइमपॉइंट्स के विश्लेषण में, डेंड्राइट विकास पहले प्रसवोत्तर सप्ताह के दौरान होता है और इसमें आउटग्रोथ, रीमॉडलिंग और स्थिरीकरण के चरण शामिल होते हैं10,12,13,14,15। तीसरा, विधि को चयनात्मक लेबलिंग या ब्याज की न्यूरोनल उप-आबादी के लेबलिंग की बढ़ती संभावना का कारण बनना चाहिए। चौथा, लक्ष्य उप-जनसंख्या का लेबलिंग पर्याप्त रूप से विरल होना चाहिए ताकि पूरे न्यूरोनल आर्बर की पहचान की जा सके और पता लगाया जा सके। यद्यपि आरजीसी और एमेक्राइन उपप्रकारों को उनकी परिपक्व रूपात्मक विशेषताओं और आईपीएल स्तरीकरण पैटर्न 16,17,18,19,20 द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है, चुनौती अपरिपक्व संरचनाओं के आधार पर विकास के दौरान उपप्रकारों की पहचान करना है। इस कार्य को विकास के दौरान विशिष्ट रेटिना सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए ट्रांसजेनिक उपकरणों के विस्तार द्वारा सुविधाजनक बनाया गया है।

ट्रांसजेनिक और नॉक-इन माउस लाइनों जिसमें फ्लोरोसेंट प्रोटीन या क्रे की सेलुलर और अस्थायी अभिव्यक्ति जीन नियामक तत्वों द्वारा निर्धारित की जाती है, का व्यापक रूप से रेटिना सेल प्रकार13,21,22,23 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। डेंड्राइट विकास के उपप्रकार-विशिष्ट पैटर्न पर प्रमुख टिप्पणियां स्थिर टाइमपॉइंट्स 10,14,24,25 पर ट्रांसजेनिक माउस रेटिना के अध्ययन से आई हैं। Cre-Lox प्रणाली, विशेष रूप से, उत्कृष्ट जीन हेरफेर और विभिन्न प्रकार के पुनर्संयोजन-निर्भर पत्रकारों, सेंसर, और ऑप्टोजेनेटिक एक्टिवेटर का उपयोग करके उपप्रकारों की निगरानी को सक्षम बनाता है। इन उपकरणों ने उपप्रकार-विशिष्ट आणविक कार्यक्रमों और कार्यात्मक गुणों की खोजों को जन्म दिया है जो रेटिना सर्किट असेंबली 26,27,28,29,30 को रेखांकित करते हैं। हालांकि, उन्हें माउस रेटिना में उपप्रकार-विशिष्ट डेंड्राइट गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अभी तक लाभ उठाया जाना है। कम घनत्व लेबलिंग electroporation द्वारा या पुनः संयोजक AAVs द्वारा शुरू किए गए transgenes के साथ Cre माउस लाइनों के संयोजन से प्राप्त किया जा सकता है। यदि उपलब्ध हो, तो टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे लाइनों या प्रतिच्छेदन आनुवंशिक रणनीतियों का भी उपयोग किया जा सकता है। अंत में, सेल को न्यूनतम इनवेसिव तरीके से लेबल किया जाना चाहिए और अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग करके चित्रित किया जाना चाहिए ताकि ऊतक से समझौता न किया जा सके या डेंड्राइट मॉर्फोजेनेसिस के लिए आवश्यक सेलुलर फ़ंक्शन में हस्तक्षेप न किया जा सके।

यहाँ प्रस्तुत एक विधि के लिए ट्रांसजेनिक उपकरण और confocal माइक्रोस्कोपी लागू करने के लिए लाइव माउस रेटिना स्पष्टीकरण में डेंड्राइट गतिशीलता की जांच करने के लिए है. क्रे ट्रांसजेनिक माउस लाइनों को एएवी वैक्टर के साथ जोड़ा गया है जो क्रे पुनर्संयोजन पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, जो ब्याज की रेटिना कोशिकाओं के विरल लेबलिंग की अनुमति देता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एएवी को इंट्राविट्रियल इंजेक्शन द्वारा नवजात रेटिना में वितरित किया जाता है। यह पेपर दर्शाता है कि एएवी 4 डीपीआई द्वारा काफी उच्च और सेल प्रकार-विशिष्ट फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति का उत्पादन करते हैं, जिससे प्रसवोत्तर समय बिंदुओं तक पहुंच की अनुमति मिलती है। इस दृष्टिकोण को स्पष्ट करने के लिए, कोलीनर्जिक "स्टारबर्स्ट" एमेक्राइन इंटरन्यूरॉन को नवजात चूहों में ब्रेनबो एएवी वितरित करके लेबल किया गया था, जो कोलीन एसिटाइलट्रांसफरेज़ (CHAT) -आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट (आईआरईएस) -क्रे ट्रांसजीन को व्यक्त करता है, जो प्रारंभिक प्रसवोत्तर रेटिना 31,32 में सक्रिय है। Starburst amacrine कोशिकाओं एक रूढ़िवादी और रेडियल आर्बर आकृति विज्ञान है कि डेंड्राइट आत्म-परिहार संकुल protocadherins33,34 द्वारा मध्यस्थता द्वारा आकार दिया जाता है विकसित करते हैं। इस पेपर से पता चलता है कि स्टारबर्स्ट डेंड्राइट्स और फिलोपोडिया के रिज़ॉल्यूशन को एक्सएफपी द्वारा प्लाज्मा झिल्ली में सीएएएक्स मोटिफ के अलावा काफी सुधार किया गया है, जो कि ब्रेनबो एएवी 31 के लिए उपयोग किया जाता है। अंत में, टाइम-लैप्स इमेजिंग और पोस्ट-प्रोसेसिंग प्रोटोकॉल निर्धारित किए गए हैं जो डेंड्राइट पुनर्निर्माण और मॉर्फोमेट्रिक परिमाणीकरण के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग डेंड्राइट मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले कारकों की पहचान करने और बरकरार रेटिना में कई सेलुलर व्यवहारों को पकड़ने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक दिनों (चित्रा 1A) के बीच वायरल ट्रांसडक्शन के लिए 4-5 दिनों की न्यूनतम अवधि के साथ 2 दिनों तक फैला हुआ है। पशु प्रयोगों को बीमार बच्चों के लिए अस्पताल (टोरंटो, कनाडा) में पशु सेवाओं पशु उपयोग और देखभाल समिति की प्रयोगशाला द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान और प्रयोगशाला पशु देखभाल में जानवरों के उपयोग के लिए पशु देखभाल दिशानिर्देशों पर कनाडाई परिषद के अनुसार किया जाता है।

1. नवजात AAV इंजेक्शन और इमेजिंग प्रयोगों के लिए तैयारी

  1. ब्याज की रेटिना सेल आबादी लेबल करने के लिए एक क्रे माउस लाइन का चयन करें। एक क्रे ट्रांसजेनिक रिपोर्टर को पार करके या एक क्रे एंटीबॉडी के साथ immunostaining के माध्यम से एएवी इंजेक्शन के समय क्रे recombinase अभिव्यक्ति की पुष्टि करें।
  2. नस्ल ट्रांसजेनिक क्रे चूहों (8-16 सप्ताह पुराने) क्रे-पॉजिटिव नवजात जानवरों को उत्पन्न करने के लिए।
    नोट: इस प्रदर्शन के लिए, CHAT-IRES-Cre नॉक-इन चूहों का उपयोग कोलिनर्जिक स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए किया गया था।
  3. recombinase-निर्भर AAV वायरस एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओं) प्राप्त करें। ठीक प्रक्रियाओं के इष्टतम लेबलिंग के लिए, वेक्टर का चयन करें जो प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करने वाले संशोधित XFPs को व्यक्त करते हैं।
    नोट: इस अध्ययन ने ब्रेनबो वायरस (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY और AAV9-EF1a-BbChT (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया, जो बहुरंगी लेबलिंग (चित्रा 1B) के लिए विकल्प प्रदान करते हैं। Farnesylated बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eYFP) और मोनोमेरिक चेरी (mCherry) अभिव्यक्ति लाइव इमेजिंग के लिए सबसे मजबूत फ्लोरोसेंट संकेतों का उत्पादन किया। एक एकल बीबीवी का उपयोग व्यक्तिगत आर्बर्स की छवि के लिए किया जा सकता है, जबकि बीबीवी के सह-इंजेक्शन का उपयोग अलग-अलग फ्लोरोफोर के साथ अधिक कोशिकाओं या पड़ोसी आर्बर्स को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। यदि कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर रहे हैं, तो न्यूनतम उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ओवरलैप सुनिश्चित करें (चित्रा 1 सी)। माइक्रोस्कोप अधिग्रहण पैरामीटर को अलग-अलग XFP संकेतों को कैप्चर करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से बचने के लिए एकल-उपयोग स्टॉक के लिए व्यक्तिगत कम-बाध्यकारी ट्यूबों में एएवी के ~3-5 μL ऐलीकोट तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके बहुत ही महीन युक्तियों के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोपिट्स तैयार करें।
    नोट: पुलर सेटिंग्स फिलामेंट और पुलर का उपयोग किया जा रहा है के आधार पर भिन्न होते हैं; अंतिम टिप आकार और आकार के लिए चित्रा 2A देखें। विशिष्ट बूंद व्यास 600 μm हैं।
  6. एक microinjection प्रणाली और संबद्ध टयूबिंग प्राप्त करें। माइक्रोइंजेक्टर को दबाव वाले एयर पोर्ट से कनेक्ट करें।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक अवलोकन( A) यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक दिनों के बीच न्यूनतम 4-5-दिन की संक्रमण अवधि के साथ प्रयोगों के 2 दिनों तक फैला हुआ है। इंट्राओकुलर इंजेक्शन नवजात चूहों पर किए जाते हैं जो प्रसवोत्तर दिन 3 से अधिक नहीं होते हैं। रेटिना को तब विच्छेदित, फ्लैट-माउंटेड, और वांछित विकास खिड़की पर कब्जा करने के लिए लाइव-इमेज किया जाता है। वायरल अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक 4-5 दिनों के बाद लेबल की गई कोशिकाओं को किसी भी समय चित्रित किया जा सकता है, क्योंकि डेंड्राइट आकृति विज्ञान पर लंबे समय तक एएवी अभिव्यक्ति का कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं है। (बी) क्रे-निर्भर ब्रेनबो एएवी वैक्टर (बीबीवी) को क्रे 31 को व्यक्त करने वाले जानवरों में इंजेक्ट किया जाता है। इस अध्ययन में, CHAT-Cre नॉक-इन चूहों का उपयोग स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं में क्रे पुनर्संयोजन को चलाने के लिए किया गया था। दो BBVs संशोधित eYFP या tagBFP, या mCherry और mTFP को एन्कोड करते हैं, जो एक CAAX आकृति में समाप्त होते हैं जो झिल्ली स्थानीयकरण के लिए अनुक्रमिक रूप से farnesylated है। Lox साइटों को त्रिभुज के साथ चित्रित किया गया है। वैक्टर या तो farnesylated XFPs को एक स्टोकेस्टिक और मिश्रित तरीके से व्यक्त करते हैं जो क्रे पुनर्संयोजन पर निर्भर करता है। EF1α प्रमोटर में दीर्घीकरण कारक 1α जीन से नियामक तत्व शामिल हैं। डब्ल्यू वुडचक हेपेटाइटिस वायरस पोस्टट्रांसक्रिप्शनल नियामक तत्व से तत्वों का प्रतिनिधित्व करता है, और पीए पॉलीएडेनिलेशन अनुक्रम को इंगित करता है। (सी) mCherry और eYFP के उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, इस अध्ययन में चित्रित BBV fluorophores। जब लाइव-इमेजिंग एकाधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, पता लगाने के मापदंडों को उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को अलग-अलग चैनलों में पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए व्यवस्थित किया जाना चाहिए। संक्षेप: AAV = एडेनो-संबद्ध वायरस; BBV = Brainbow AAV; CHAT = choline acetyltransferase; iRES = आंतरिक राइबोसोम प्रवेश साइट; eYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; iTR = उलटा टर्मिनल दोहराने; tagBP = टैग-ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन; mCherry = मोनोमेरिक चेरी; mTFP = टील फ्लोरोसेंट प्रोटीन; XFP = किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EF1α = बढ़ाव कारक 1 अल्फा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. नवजात चूहों में AAVs के Intravitreal इंजेक्शन

  1. बर्फ पर एक एएवी एलीकोट को पिघलाएं। बाँझ खारा या फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा का उपयोग करके एक ~ 1: 4 एएवी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। तैयार ~ 0.5 μL प्रति जानवर AAV कमजोर पड़ने के (~ 0.25 μL प्रति आंख) मामले में माइक्रोपिपेट टूट जाता है, और एक नया पिपेट भरने की जरूरत है. शेष undiluted AAV को 4 °C पर स्टोर करें, और 2 सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
    नोट: इस प्रयोग में, आपूर्तिकर्ता AAV एकाग्रता ~ 1-2 × 1013 जीनोम सामग्री (जीसी)/ एमएल थी और 4 × 1012 जीसी / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतली थी। वांछित लेबलिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए वायरल एकाग्रता का अनुकूलन करें।
  2. इंजेक्शन की कल्पना करने के लिए, समाधान को नीला रंग देने के लिए एएवी कमजोर पड़ने के प्रत्येक 15 μL के लिए 0.02% फास्ट ग्रीन एफसीएफ डाई समाधान के लगभग 1 μL जोड़ें।
  3. बांध और नवजात कूड़े (प्रसवोत्तर दिन (पी) 0.5-3) के साथ एक माउस पिंजरे को माइक्रोइंजेक्शन उपकरण ों के साथ एक प्रक्रिया कक्ष में स्थानांतरित करें। मातृ तनाव और पिल्लों की अस्वीकृति को कम करने के लिए जानवरों को घोंसले और बिस्तर के साथ एक ही पिंजरे में रखें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन क्षेत्र को निष्फल करें, और बेंच सतहों पर बाँझ डायपर पैड रखें। हाइपोथर्मिया-प्रेरित संज्ञाहरण से वसूली के लिए एक गर्म मंच (जैसे, एक हीटिंग पैड) तैयार करें।
  5. एक माइक्रोसिरिंज का उपयोग करके एएवी कमजोर पड़ने के साथ माइक्रोपिपेट को बैकफिल करें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, टिप को अनसील करने के लिए 30 जी सुई के साथ माइक्रोपिपेट टिप को तोड़ दें।
    नोट: चित्रा 2A backfilled टिप दिखाता है- दोनों सील (शीर्ष) और unsealed (मध्य).
  6. बर्फ पर 1-2 जानवरों को रखकर हाइपोथर्मिया द्वारा नवजात चूहों को एनेस्थेटिक करें। बर्फ के साथ सीधे संपर्क से त्वचा की रक्षा करने के लिए एक लेटेक्स दस्ताने पर जानवरों को रखें। एक बार जब जानवर अब पंजा चुटकी (~ 2 मिनट) के जवाब में नहीं चलता है, तो जानवर को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें। यदि वांछित हो, तो टैटू स्याही और 30 जी सुई के साथ टैटू पंजा पैड, और जीनोटाइपिंग द्वारा जानवरों की पहचान करने के लिए डीएनए अलगाव के लिए पूंछ कतरन एकत्र करें।
    नोट: संज्ञाहरण की गहराई की उचित निगरानी पूरी प्रक्रिया के दौरान होनी चाहिए।
  7. 70% इथेनॉल के साथ आंखों को ओवरलाइंग त्वचा को स्वाब करें। फ्यूज्ड पलक को खोलने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)। आंख खोलने के लिए उंगलियों के साथ प्रकाश दबाव लागू करें, और कॉर्निया-स्क्लेरा जंक्शन (चित्रा 2 सी) पर कॉर्निया के माध्यम से एक छोटे से छेद को प्रहार करें।
  8. छेद में ग्लास माइक्रोपिपेट डालें, और इंट्राविट्रल स्पेस में एएवी को इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर फुट पेडल को 2-4 बार दबाएं। धीरे-धीरे माइक्रोपिपेट को हटा दें, और पुतली के माध्यम से नीले रंग की डाई की कल्पना करके एएवी इंजेक्शन की पुष्टि करें (चित्रा 2 डी)।
    नोट: 6-8 साई के इजेक्शन दबाव और 600-800 एमएस के पल्स समय के साथ, एक 600 μm व्यास की बूंद को बाहर निकाला जाता है (चित्रा 2 ए, नीचे)। लगभग 0.23-0.45 μL AAV समाधान प्रति आंख इंजेक्ट किया जाता है। आंख के बाहर नीला समाधान इंगित करता है कि एएवी को आंख में इंजेक्ट नहीं किया गया था। इंजेक्शन साइट से लीक होने वाला नीला समाधान इंगित करता है कि एएवी लीक हो सकता है, जिससे अभिकर्मक दक्षता कम हो सकती है।
  9. पलकों को फिर से सील करने के लिए धीरे से दबाएं, और पिल्ला को गर्म पैड पर रखें। एक बार जब जानवर एक गुलाबी रंग को ठीक कर लेते हैं और उत्तरदायी होते हैं, तो धीरे से उन्हें आवास पिंजरे में वापस स्थानांतरित कर देते हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पिल्लों के बहुत तेजी से फिर से वार्मिंग से बचने के लिए उचित सावधानी बरती जाती है।
  10. कूड़े में शेष जानवरों के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराएं। रेटिना इमेजिंग से पहले वायरल ट्रांसडक्शन के लिए कम से कम 4-5 दिनों की अनुमति दें।

Figure 2
चित्रा 2: नवजात इंट्राओकुलर इंजेक्शन( ए) बैकफिल्ड माइक्रोपिपेट सील होने पर पिपेट टिप के आकार को दिखाता है जब सील किया जाता है (शीर्ष) और टिप को अनसील करने के बाद (नीचे, बाएं)। 6-8 साई का पिको-इंजेक्शन दबाव और 600-800 एमएस का पल्स समय 600 μm व्यास की बूंद (नीचे, दाएं) का उत्पादन करता है। स्केल बार = 1 मिमी(बी) 16x आवर्धन के तहत एनेस्थेटिक पी0 पिल्ला। फ्यूज्ड पलक जंक्शन (सफेद) एक तेज 30 जी सुई का उपयोग करके खुला है। स्केल बार = 2 मिमी (सी) आंख पर लागू प्रकाश दबाव कॉर्निया को उजागर करता है; स्केल बार = 2 मिमी। ज़ूम किया गया अनुभाग (लाल) कॉर्निया-स्क्लेरा जंक्शन (पीला) पर एक 30 जी सुई के साथ बनाया गया छोटा छेद दिखाता है; स्केल बार = 0.5 मिमी (डी) इंजेक्शन (बाएं) के बाद पिपेट टिप की वापसी। एएवी समाधान में फास्ट ग्रीन डाई पुतली (मध्य) के माध्यम से नीले-भूरे रंग के रूप में दिखाई देता है, इंजेक्शन (दाएं) से पहले हल्के पुतली रंग की तुलना में। स्केल बार = 1 मिमी (ई) 4 दिनों के बाद, पलक ठीक हो गई है और बंद हो गई है (बाएं); स्केल बार = 2 मिमी। enucleation पर, चंगा इंजेक्शन साइट दिखाई देती है (पीला); स्केल बार = 1 मिमी। कॉर्निया और स्क्लेरा के बीच की सीमा पर इंजेक्शन साइट के स्थान को नोट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. इमेजिंग प्रयोग के लिए रेटिना विच्छेदन

  1. रेटिना aCSF (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2·6H2O, 2.5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM ग्लूकोज, और 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES free acid)35 तैयार करें। यदि वांछित हो, तो 10x समाधान तैयार करें और फ्रीज करें; पिघलना और आवश्यकतानुसार 1x तक पतला करें।
  2. कम से कम 15 मिनट के लिए कार्बोजन (95% O2, 5% CO2) के साथ bubbling द्वारा रेटिना aCSF को ऑक्सीजनीकृत करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। एक सील कंटेनर में रखें जब तक कि यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग न किया जाए कि एसीएसएफ ऑक्सीजन युक्त रहता है।
    नोट: रेटिना को O2 की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। पूरे प्रयोग के दौरान एसीएसएफ को ऑक्सीजन युक्त रखना महत्वपूर्ण है।
  3. एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश को एक आइस ट्रे में एम्बेड करें (लैब प्लास्टिक से बाहर एक आइस ट्रे फैशन करें, उदाहरण के लिए, एक पिपेट बॉक्स ढक्कन), और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें। ऑक्सीजनयुक्त रेटिना एसीएसएफ के साथ पेट्री डिश भरें।
  4. Euthanize चूहों P9 और decapitation द्वारा छोटे. Euthanize चूहों P10 और isoflurane प्रेरण, या पशु प्रोटोकॉल के तहत अनुमोदित एक वैकल्पिक विधि द्वारा पुराने, decapitation द्वारा पीछा किया.
  5. यदि पलकों को सील कर दिया जाता है, तो आंख को उजागर करने के लिए पलक फ्लैप को काट लें। आंखों को न्यूक्लिएट करने के लिए संदंश का उपयोग करें, और उन्हें चरण 3.3 से ठंडे रेटिना एसीएसएफ में स्थानांतरित करें।
  6. रेटिना कप को विच्छेदित करने के लिए, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (आवर्धन 25x) के तहत, एक ड्यूमोंट # 5 संदंश (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़कर आंख को स्थिर करें।
  7. एक 30 जी सुई के साथ कॉर्निया के केंद्र में एक छेद प्रहार करें, और फिर छेद से कॉर्निया के अंत तक एक चीरा बनाने के लिए छेद में माइक्रोसिस्सर्स की एक नोक डालें। कार्डिनल दिशाओं में 4 स्लाइस बनाने के लिए दोहराएं, जिससे 4 "फ्लैप" (चित्रा 3 ए) का निर्माण हो सके।
  8. दो ड्यूमोंट # 5 संदंश के साथ, दो आसन्न फ्लैप को अलग-अलग समझें और खींचें, धीरे से रेटिना से स्क्लेरा को छीलते हुए। शेष कॉर्निया फ्लैप के साथ दोहराएं, और रेटिना से स्क्लेरा को हटा दें (चित्रा 3 बी)।
  9. संदंश का उपयोग करके रेटिना कप से लेंस को हटा दें। माइक्रोसिस्सर के साथ, रेटिना के किनारे से ऑप्टिक तंत्रिका की ओर 4 रेडियल चीरों को बनाएं, जिससे 4 बराबर पंखुड़ियां बनती हैं (चित्रा 3 बी)। दूसरी आंख के लिए चरण 3.4-3.7 दोहराएँ।

4. रेटिना फ्लैट माउंट तैयारी

  1. बढ़ते के लिए ग्रे मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर (एमसीई) झिल्ली फ़िल्टर डिस्क तैयार करें। यदि बड़े व्यास के एमसीई झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर रहे हैं, तो डिस्क को चतुर्भुज (लगभग 1 सेमी भर में) में काट लें। MCE डिस्क को एक बड़े सफेद फ़िल्टर पेपर (चित्रा 3D) के केंद्र पर रखें.
    नोट:: MCE फ़िल्टर भी 1 सेमी व्यास डिस्क में उपलब्ध हैं। एमसीई फ़िल्टर डिस्क 1-2 रेटिना फिट करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए, लेकिन इमेजिंग चैंबर में फिट होने के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए। जैसा कि एमसीई झिल्ली एक स्थिर चार्ज रखती है, एमसीई झिल्ली के संपर्क और हैंडलिंग को कम करती है।
  2. दो आकार 3/0 पेंट ब्रश का उपयोग करके रेटिना को संभालना, रेटिना गैंग्लियन सेल साइड के साथ पेंटब्रश पर एक रेटिना कप फ्लिप करें। धीरे से रेटिना को एसीएसएफ से बाहर निकालें, यह सुनिश्चित करें कि पानी का तनाव रेटिना को फाड़ नहीं देता है (चित्रा 3 सी)।
  3. जबकि अभी भी रेटिना के साथ पेंटब्रश को पकड़ते हुए, एमसीई फिल्टर पेपर (चित्रा 3 सी, दाएं) के केंद्र में एसीएसएफ की एक बूंद रखने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। रेटिना को सतह के तनाव द्वारा बनाए गए एसीएसएफ की बूंद में फ्लोट करें। रेटिना आरजीसी पक्ष को बूंद के भीतर और चार पंखुड़ियों को उजागर करने के लिए पेंट ब्रश का उपयोग करें।
  4. एक बार तैनात होने के बाद, बूंद की सतह के तनाव को तोड़ने के लिए पेंटब्रश और सफेद फिल्टर पेपर के बीच एक पानी का पुल बनाएं।
    नोट: जब ACSF दूर दुष्ट है, रेटिना MCE फ़िल्टर पेपर (चित्रा 3D, E) का पालन करेगा। फ्लैट-माउंटेड रेटिना को संदंश के साथ एमसीई डिस्क को पकड़कर संभाला जा सकता है। यदि एसीएसएफ ड्रॉपलेट पानी के पुल बनाने से पहले जल्दी से दूर हो जाती है, तो यह संकेत दे सकता है कि एमसीई झिल्ली चार्ज नहीं की गई है। एक ताजा एमसीई झिल्ली का उपयोग करें, और इमेजिंग चैंबर में रेटिना को स्थानांतरित करने से तुरंत पहले विच्छेदन और फ्लैट-माउंटिंग रेटिना को विच्छेदन करके न्यूक्लिएशन और इमेजिंग के बीच के समय को कम करें।

Figure 3
चित्र 3: रेटिना विच्छेदन और मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर फिल्टर झिल्ली पर फ्लैट-माउंटिंग। (ए) बाएं, ड्यूमोंट # 5 संदंश (बाएं) के साथ ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़कर एक न्यूक्लिएटेड आंख को स्थिर किया जाता है। कॉर्निया के केंद्र में 30 जी सुई (केंद्र) का उपयोग करके एक छोटा छेद बनाया जाता है। सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग कॉर्निया को 4 बराबर फ्लैप (दाएं) में काटने के लिए किया जाता है। स्केल बार = 1 मिमी (बी) दो ड्यूमोंट # 5 संदंश (बाएं) का उपयोग करके और लेंस को हटा दिया गया (केंद्र) के साथ स्क्लेरा के साथ विच्छेदित रेटिना। रेटिना में 4 बराबर कटौती के साथ रेटिना (दाएं)। स्केल बार = 1 मिमी (सी) दो ठीक पेंटब्रश (आकार 3/0, बाएं) के साथ रेटिना की हैंडलिंग। रेटिना रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के साथ एक पेंटब्रश (केंद्र) पर नीचे की ओर फ़्लिप किया जाता है और एसीएसएफ से बाहर निकल जाता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि पानी का तनाव रेटिना (दाएं) को फाड़ नहीं देता है। स्केल बार = 2 मिमी (डी) ग्रे एमसीई झिल्ली डिस्क एक सफेद फिल्टर पेपर (बाएं) पर रखा जाता है। MCE डिस्क (दाएँ) पर ACSF की एक बूंद. स्केल बार = 1 सेमी (ई) रेटिना को बूंद में तैरने और उन्हें स्थिति में रखने के बाद, एसीएसएफ को बाती करने के लिए सफेद फिल्टर पेपर के साथ एक पानी का पुल बनाएं, रेटिना को चार्ज किए गए एमसीई पेपर (बाएं) पर खींचें; स्केल बार = 1 सेमी. एमसीई झिल्ली (लाल) की ज़ूम की गई छवि रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के पक्ष में (दाएं) के साथ घुड़सवार 2 रेटिना दिखाती है; स्केल बार = 2 मिमी। एक रेटिना को सफेद रंग में रेखांकित किया गया है। संक्षेप: MCE = मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर; एसीएसएफ = कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. लाइव पूरे माउंट रेटिना तैयारी के समय चूक confocal इमेजिंग

  1. एक ईमानदार confocal माइक्रोस्कोप के लिए लाइव-इमेजिंग इनक्यूबेशन कक्ष को इकट्ठा करें जैसा कि चित्र 4 में देखा गया है।
    नोट: उल्टे confocal प्रणालियों के लिए, फ्लैट-mounts RGC पक्ष नीचे सीधे इनक्यूबेशन कक्ष के कांच के नीचे coverslip पर रखा जाता है। एक बार जब रेटिना कवरस्लिप के साथ संपर्क करते हैं, तो उन्हें स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है।
  2. कक्ष को ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ के साथ भरें, और पंप और तापमान नियंत्रक (तापमान 32-34 डिग्री सेल्सियस, प्रवाह दर 1 एमएल / मिनट) को चालू करें। तापमान को 34 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न बढ़ने दें।
  3. रेटिना फ्लैट-माउंट को परफ्यूजन चैंबर में स्थानांतरित करने के लिए, पंप को रोकें, और कक्ष में मौजूद एसीएसएफ को हटा दें। रेटिना फ्लैट-माउंट के साथ एमसीई डिस्क को (खाली) इनक्यूबेशन कक्ष में रखें।
  4. फ्लैट-माउंट पर एक नमूना वजन रखें; सतह तनाव को तोड़ने के लिए वजन को पूर्व गीला करें। गर्म aCSF के साथ कक्ष को फिर से भरें, और ~ 1 mL / मिनट पर aCSF परिचालित करें।
  5. इमेजिंग कक्ष में 25x पानी डुबकी उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 0.95) के साथ nosepiece की स्थिति। एपिफ्लोरोसेंट प्रकाश (चित्रा 4 सी) का उपयोग करके ब्याज की लेबल कोशिकाओं के लिए स्क्रीन।
  6. ब्याज की डेंड्राइटिक विशेषताओं को कैप्चर करने के लिए इमेजिंग वॉल्यूम को समायोजित करें।
    नोट: इस अध्ययन ने 1024 x 1024 पिक्सेल प्रति फ्रेम, z-चरण 1 μm, और प्रत्येक z-स्टैक के बीच 2 मिनट की फ्रेम दर पर पूर्ण डेंड्राइटिक आर्बर पर कब्जा कर लिया। अंतिम छवि आकार ~ 100 μm x 100 μm x 20 μm हैं।
  7. लेजर पावर को इष्टतम सेटिंग में समायोजित करने के लिए, एक लुक-अप टेबल का उपयोग करें जो ओवरसैचुरेटेड और अंडरसैचुरेटेड पिक्सेल दोनों की पहचान करता है। स्कैनिंग करते समय, लेजर पावर को इस तरह से समायोजित करें कि कोई पिक्सेल ओवरसैचुरेटेड न हो (यानी, 255 या उससे अधिक की तीव्रता पर)। जब तक आवश्यक हो, तब तक इमेजिंग जारी रखें, या जब तक फ्लोरोसेंट सिग्नल में एक महत्वपूर्ण और पता लगाने योग्य गिरावट न हो और शोर में वृद्धि न हो (आमतौर पर 2-4 घंटे)।
    नोट:: कम लेजर पावर की सिफारिश की जाती है क्योंकि पिक्सेल पूर्ण गतिशील श्रेणी पर वितरित किए जाने पर deconvolution एल्गोरिदम बेहतर ढंग से काम करते हैं। पिक्सेल तीव्रता 254 से अधिक नहीं होनी चाहिए; न्यूराइट्स के अनुभवजन्य विश्लेषण से पता चला है कि 170 से नीचे पिक्सेल मान डीकंवोल्यूशन के लिए आदर्श हैं। लाइन औसत (2-3) के साथ तेजी से स्कैन गति (400-600 हर्ट्ज) एक ही कुल पिक्सेल रहने के समय के एकल, धीमी स्कैन के लिए बेहतर हैं। लंबे समय तक इमेजिंग का क्षेत्र अक्सर फोटोब्लेच होता है, लेकिन अन्य स्पष्टीकरण अनुभाग व्यवहार्य रहते हैं। एक फ्लैट-माउंट में कई क्षेत्रों को चित्रित किया जा सकता है, प्रत्येक को 2-4 घंटे के लिए, 6 घंटे के कुल इनक्यूबेशन समय के साथ। 6 ज से परे इमेजिंग सत्रों को व्यवस्थित रूप से परीक्षण नहीं किया गया है। न्यूराइट गिरावट और blebbing संकेत है कि स्पष्टीकरण व्यवहार्यता में गिरावट आ रही है.
  8. इमेजिंग के बाद, रेटिना फ्लैट-माउंट और झिल्ली फिल्टर को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए ठंडे 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ ठीक करें। आगे के विश्लेषण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा निश्चित रेटिना में फ्लोरोसेंट लेबल को बढ़ाएं।
    नोट:: पोस्ट-इमेजिंग निर्धारण एक उलटा confocal का उपयोग करते समय संभव नहीं है; रेटिना ऊतक को नष्ट किए बिना हटाने योग्य नहीं हैं।

Figure 4
चित्र4: लाइव-सेल इमेजिंग इनक्यूबेशन चैंबर सेटअप. (A) लाइव-इमेजिंग इनक्यूबेशन उपकरण हीटिंग, समाधान और इमेजिंग घटकों को दर्शाता है. दोहरी हीटर में एक गर्म इनक्यूबेशन चैंबर प्लेटफ़ॉर्म (नीले कनेक्टर इलेक्ट्रोड के साथ बैक सर्कल) और एक इन-लाइन समाधान हीटर शामिल है। (b) 4A का योजनाबद्ध आरेख। एमसीई झिल्ली (ग्रे) पर रेटिना फ्लैट-माउंट (लाल) को इनक्यूबेशन कक्ष में रखा जाता है। इन-लाइन समाधान हीटर एक समाधान पंप से जुड़ा हुआ है ( 4 ए में चित्रित नहीं किया गया है)। इमेजिंग कक्ष आयाम डुबकी उद्देश्य नाक के लिए एक अच्छा कार्य क्षेत्र की अनुमति देते हैं। (C) 25x एक रेटिना स्पष्टीकरण को 0.23-0.45 μL के साथ इंजेक्ट किया गया है, जो 4 × 1012 GC/ mL AAV कमजोर पड़ने के 1012 GC/mL के साथ इंजेक्ट किया गया है; स्केल बार = 100 μm. कोशिकाओं का घना लेबलिंग अक्सर ऑप्टिक तंत्रिका सिर (धराशायी रेखा, नीचे दाईं ओर) को घेरता है; स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: MCE = मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर; जीसी = जीनोम प्रतियां; mCherry = मोनोमेरिक चेरी; eYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. छवि deconvolution और छवि जे में पोस्ट प्रसंस्करण

  1. छवि श्रृंखला आयात करें, श्रृंखला को समय से विभाजित करें, और यदि यह एक बहु-रंग छवि है तो रंग। सुनिश्चित करें कि एक रंग के लिए सभी समय बिंदु एक ही फ़ोल्डर में निहित हैं।
    नोट:: आयात Bio-स्वरूपों ImageJ का उपयोग कर रहे हैं, तो (जैव स्वरूप स्वचालित रूप से FIJI में शामिल है)।
  2. ImageJ प्लगइन, विवर्तन PSF 3D का उपयोग कर एक सैद्धांतिक बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन ( PSF) बनाएँ।
    नोट: प्रत्येक इमेजिंग चैनल को अपने स्वयं के पीएसएफ की आवश्यकता होती है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पीएसएफ को प्रभावित करता है।
  3. प्लगइन्स | का उपयोग करें मैक्रोज़ | प्रदान किए गए मैक्रो (अनुपूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर सभी टाइमपॉइंट्स के लिए बैच समानांतर पुनरावर्ती Deconvolution निष्पादित करने के लिए चलाएँ।
    नोट:: इस मैक्रो Wiener फ़िल्टर पूर्वशर्त Landweber (WPL) पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म के 25 पुनरावृत्तियों चलाता है। प्रत्येक रंग चैनल को अलग से deconvolved किया जाना चाहिए।
  4. रंग चैनलों को मर्ज करें, और सभी समय बिंदुओं को हाइपरस्टैक में संकलित करें (छवि | हाइपरस्टैक्स | हाइपरस्टैक के लिए स्टैक)। प्लगइन्स | का उपयोग करके 3 डी बहाव को सही करें पंजीकरण | सही 3 डी बहाव.
  5. छवि को किसी नियमित स्टैक पर वापस करें (छवि | हाइपरस्टैक्स | स्टैक करने के लिए हाइपरस्टैक), और समय बिंदुओं को विभाजित करें (छवि | स्टैक्स | उपकरण | स्टैक स्प्लिटर)। सभी समय बिंदुओं के लिए अधिकतम प्रक्षेपण बनाने के लिए बैच प्रोसेसिंग का उपयोग करें (प्रक्रिया | बैच | मैक्रो | रन ("जेड प्रोजेक्ट...", "प्रक्षेपण = [अधिकतम तीव्रता]");
  6. समय-अंतराल छवि अनुक्रम आयात करें (फ़ाइल | | आयात करें छवि अनुक्रम)। deconvolved और पोस्ट संसाधित दो आयामी (2 डी) वीडियो के वांछित विश्लेषण के लिए पारंपरिक ImageJ उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: चार आयामी (3 डी + समय) deconvolved और बहाव-सही वीडियो एक hyperstack के रूप में देखा जा सकता है। 3D समय बिंदुओं को बनाए रखने के लिए पिछले चरण को छोड़ दें।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, स्टारबर्स्ट सेल डेंड्राइट्स के विकास का एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी वीडियो अधिग्रहित किया गया था, विघटित किया गया था, और 3 डी बहाव के लिए सही किया गया था। Z-plane अधिकतम अनुमानों का उत्पादन विश्लेषण के लिए 2 D वीडियो बनाने के लिए किया गया था (पूरक वीडियो 1, चित्रा 5A)। प्रत्येक समय बिंदु के 3 डी deconvolution ठीक filopodia अनुमानों के संकल्प में वृद्धि हुई (चित्रा 5B, सी). ठीक filopodia protrusions रेटिना डेंड्राइट्स 36 विकसित करने की एक विशेषता है और इमेजिंग के दौरान दिखाई देना चाहिए। एएवी अभिकर्मक सेल लेबलिंग घनत्व और प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तनशीलता का उत्पादन करेगा। इस प्रकार, इमेजिंग और उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो का उत्पादन करने के लिए उच्च फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ कोशिकाओं का चयन करने के लिए लेबल किए गए ऊतक को स्क्रीन करें। मंद लेबल वाली कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लेजर शक्ति को बढ़ाने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि यह तेजी से फोटोब्लीचिंग का कारण बन सकता है और सिग्नल की तुलना में उच्च शोर पेश कर सकता है। पर्याप्त रूप से उज्ज्वल कोशिकाएं 5 डीपीआई के भीतर दिखाई देती हैं। 12 डीपीआई और उससे आगे, लंबे समय तक एएवी संक्रमण की अवधि आवश्यक रूप से लेबल कोशिकाओं (चित्रा 5 डी) की प्रतिदीप्ति में वृद्धि का कारण नहीं बनती है।

घने सेल लेबलिंग से अत्यधिक प्रतिदीप्ति और न्यूराइट भीड़ छवि की गुणवत्ता को प्रभावित करती है और एकल-सेल पुनर्निर्माण में बाधा डाल सकती है। एएवी कमजोर पड़ने और मात्रा का अनुकूलन अलग-थलग और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले आर्बर्स की वांछित डिग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यक है जो लक्ष्य सेल आबादी के बाकी हिस्सों से अलग हैं। यहां, 9.2 × 108-1.8 × 109 वायरल जीसी को स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए प्रति आंख इंजेक्ट किया गया था (0.23-0.45 μL एएवी के 4 × 1012 जीसी / एमएल टिटर के साथ)। एक फ्लोरोसेंट सिग्नल की अनुपस्थिति एक अक्षम इंजेक्शन तकनीक को प्रतिबिंबित कर सकती है। इंजेक्शन लगाते समय, इंजेक्शन साइट से नीले एएवी समाधान का रिसाव इंगित करता है कि वायरस रेटिना को वितरित नहीं किया गया है, या इंजेक्शन की मात्रा या दबाव बहुत अधिक है। अतिरिक्त इंजेक्शन की मात्रा या दबाव रेटिना टुकड़ी और / या ओकुलर दबाव के नुकसान का कारण बन सकता है, रेटिना कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और सेल-लेबलिंग दक्षता को कम कर सकता है। दोनों मुद्दों को इंजेक्शन तकनीक के अभ्यास और अनुकूलन के साथ हल किया जा सकता है। सिग्नल की कमी के अन्य संभावित कारणों में अनुचित भंडारण या अपर्याप्त क्रे अभिव्यक्ति से एएवी का क्षरण शामिल है क्योंकि एएवी अभिकर्मक की अवधि के दौरान क्रे ट्रांसजीन सक्रिय नहीं है।

एक बार वीडियो deconvolved कर रहे हैं, गतिशील विश्लेषण, जैसे शाखा के अलावा की दर की गणना, वापसी, या स्थिरीकरण, प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, पारंपरिक स्थैतिक विश्लेषण प्रत्येक समय सीमा पर किया जा सकता है, जिसमें न्यूरॉन पुनर्निर्माण और मॉर्फोमेट्रिक परिमाणीकरण जैसे कुल शाखा लंबाई, शाखा कोण, शाखा क्रम, या टर्मिनल शाखा बिंदुओं की संख्या शामिल है। इस प्रोटोकॉल का परिणाम उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी छवि स्टैक की एक समय श्रृंखला है। अधिकांश 3 डी न्यूराइट गतिशील वीडियो को मैन्युअल रूप से एक ओपन-सोर्स इमेज विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर जैसे ImageJ37 का उपयोग करके अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में परिमाणित किया जाता है। एक अन्य ओपन-सोर्स टूल, Vaa3D38, विशेष रूप से बड़े संस्करणों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विकसित किया गया है। यदि वीडियो का विश्लेषण 3 डी में किया जाना है, तो Vaa3D जैसे 3D + टाइम विज़ुअलाइज़र के उपयोग की सिफारिश की जाती है। ImageJ और Vaa3D छवि में पिक्सेल या voxels तक सीधी पहुंच की अनुमति देते हैं, लेकिन अक्सर न्यूरॉन पुनर्निर्माण पिक्सेल डेटा को कंकालीकृत पेड़ पुनर्निर्माण में परिवर्तित करके बनाए जाते हैं। एकल समय बिंदुओं के लिए स्वचालित या अर्ध-स्वचालित न्यूरॉन पुनर्निर्माण को ओपन-सोर्स 39,40,41 और मालिकाना सॉफ़्टवेयर के साथ किया जा सकता है। समय-अंतराल पुनर्निर्माण का विश्लेषण करने के लिए, पुनर्निर्माण पर प्रत्येक बिंदु को पिछले और बाद के समय बिंदुओं से जोड़ा जाना चाहिए। समय के साथ जटिल डेंड्रिटिक आकारिकी को संरेखित करना, जिसे 500 डेटा बिंदुओं के ऊपर से एन्कोडेड किया जा सकता है, एक चुनौतीपूर्ण समस्या बनी हुई है। विभिन्न शक्तियों और सीमाओं के साथ कई उपकरण उपलब्ध हैं, और उन्हें अध्ययन के लिए आवश्यक विश्लेषणों के अनुरूप चुना जाना चाहिए।

Figure 5
चित्रा 5: नवजात इंट्राओकुलर इंजेक्शन, टाइम-लैप्स इमेजिंग और डिकंवोल्यूशन के बाद प्रतिनिधि परिणाम। (A) P6 स्टारबर्स्ट एमेक्राइन सेल के डिकॉन्वॉल्व्ड टाइम-लैप्स इमेजिंग श्रृंखला (h:min) के अधिकतम अनुमान 5 दिन बाद AAV इंजेक्शन। ठीक filopodia गतिशीलता अब पारंपरिक ImageJ उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. डेंड्राइटिक शोधन (लाल बॉक्स) का एक क्षेत्र और डेंड्राइटिक आउटग्रोथ (हरे रंग का बॉक्स) के एक क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया है। (B, C) एकल P6 starburst amacrine सेल झिल्ली के साथ लेबल-टैग eYFP 5 दिन postAAV इंजेक्शन (dpi) उज्ज्वल एकल सेल लेबलिंग से पता चलता है. ऊपरी पैनलों के लिए स्केल बार = 50 μm; निचले पैनलों के लिए स्केल बार = 25 μm. इससे पहले (ए) और बाद में (बी) ImageJ के साथ deconvolution. इनसेट (लाल) सफल deconvolution के एक परिणाम के रूप में deblurring दिखाते हैं। (डी) पी 12 स्टारबर्स्ट सेल 11 डीपीआई की तुलना में पी 6 स्टारबर्स्ट एमेक्राइन सेल 5 डीपीआई (बाएं) फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के समान स्तर को दर्शाता है। एएवी इनक्यूबेशन बार बढ़ाने से फ्लोरोसेंट सिग्नल में वृद्धि नहीं होती है। फ्लोरोसेंट सिग्नल लंबे समय तक एएवी संक्रमण अवधि के साथ गिरावट नहीं करते हैं। समान अधिग्रहण और पोस्टप्रोसेसिंग पैरामीटर दोनों छवियों पर लागू किए गए थे। बढ़ी हुई शाखा मोटाई और P12 पर देखी गई वैरिकोसिटी परिपक्व स्टारबर्स्ट कोशिकाओं की सामान्य विशेषताएं हैं, न कि एक लेबलिंग या इमेजिंग आर्टिफैक्ट। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: AAV = एडेनो-संबद्ध वायरस; eYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; dpi = दिन postinfection. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: क्रे लाइन चयन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए विचार।

(A-D) लाइव पी 11 रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं को बीबीवी के 9 डीपीआई पर चित्रित किया गया था, जिसे Vglut2-iRES-Cre नॉक-इन चूहों में इंजेक्ट किया गया था, जिसमें क्रे को आरजीसी आबादी में चुनिंदा रूप से व्यक्त किया जाता है। (ए) जैम-बी आरजीसी को इसकी विशेषता असममित आकृति विज्ञान 24 द्वारा पहचाना गया। (B-D) अलग-अलग आरजीसी उपप्रकार जो उनके डेंड्राइट स्तरीकरण पैटर्न में भिन्न होते हैं। (ई) लाइव P11 स्टारबर्स्ट amacrine सेल biolistically साइटोसोलिक mCherry के साथ transfected और 512 x 512 पिक्सेल पर कताई डिस्क confocal के साथ कब्जा कर लिया की छवि. साइटोसोलिक एक्सएफपी ठीक डेंड्राइटिक प्रोट्रूशन के सापेक्ष सोमा में उच्च प्रतिदीप्ति संकेत की ओर जाता है। सोमा से आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का कारण बनता है जब छोटे समीपस्थ अनुमानों की इमेजिंग होती है (ऊपर दिए गए लाल बॉक्स में इनसेट नीचे दिखाया गया है)। (एफ) लाइव P11 स्टारबर्स्ट एमेक्राइन सेल की छवि झिल्ली-लक्षित eYFP के साथ transfected और 1024 x 1024 पिक्सेल पर confocal लेजर स्कैनिंग द्वारा कब्जा कर लिया। सोमा के चारों ओर फ्लोरोसेंट झिल्ली की अंगूठी, बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात, और सोमा के समीपस्थ ठीक अनुमानों की गुणवत्ता पर ध्यान दें जो झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (इनसेट) द्वारा उत्पादित होते हैं। स्केल बार = 50 μm और E और F के निचले पैनलों के लिए = 5 μm। संक्षिप्त रूप: IRES = आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट; BBV = Brainbow adeno-associated virus; Vglut2 = vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2; XFP = किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; eYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; mCherry = मोनोमेरिक चेरी; RGC = रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं; JAM-B = जंक्शन आसंजन अणु B. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक वीडियो 1: समय-अंतराल वीडियो P6 स्टारबर्स्ट amacrine डेंड्राइट्स, 5 दिन postinjection के विकास के वीडियो. वीडियो समय-चरण 2 मिनट है। Deconvolution और 3 D बहाव सुधार ImageJ का उपयोग कर लागू किए गए थे। शीर्ष पीले बक्से outgrowth के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला, और निचले बॉक्स क्षणिक filopodia outgrowth, आत्म संपर्क, और वापस लेने के एक क्षेत्र की रूपरेखा. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: बैच समानांतर पुनरावर्ती deconvolution के लिए ImageJ मैक्रो. मैक्रो Wiener फ़िल्टर पूर्वशर्त Landweber (WPL) पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म के 25 पुनरावृत्तियों चलाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह वीडियो एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन को दर्शाता है जो मौजूदा आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग कॉन्फोकल लाइव-इमेजिंग के साथ रेटिना न्यूरॉन्स के विकास की डेंड्राइट गतिशीलता की छवि के लिए करता है। इसके अलावा प्रदर्शन किया गया है Cre-निर्भर AAVs के इंट्राओकुलर इंजेक्शन नवजात चूहों में झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग। आनुवंशिक रूप से लक्षित आबादी की एकल कोशिकाओं को 4-5 डीपीआई के रूप में जल्दी के रूप में चमकीले रूप से लेबल किया जाता है। रेटिना फ्लैट-माउंट को मानक इमेजिंग कक्षों के लिए तैयार किया गया था ताकि लाइव-सेल कॉन्फोकल इमेजिंग किया जा सके। यह विधि एकल कोशिकाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-अंतराल वीडियो और उनके ठीक अनुमानों का उत्पादन करती है। छोटे अनुमानों को हल किया जाता है और खुले स्रोत सॉफ़्टवेयर के माध्यम से उपलब्ध deconvolution और postprocessing एल्गोरिदम का उपयोग करके परिमाणित किया जाता है, जिसमें ImageJ, Vaa3D, और ShuTu शामिल हैं, साथ ही Imaris और MBF Bioscience से उपलब्ध लाइसेंस प्राप्त सॉफ़्टवेयर भी शामिल हैं। चूंकि यह पाइपलाइन मॉड्यूलर है, इसलिए अध्ययन के उद्देश्यों को फिट करने के लिए प्रत्येक प्रोटोकॉल अनुभाग को बदला जा सकता है। इन मॉड्यूलर तत्वों पर नीचे चर्चा की गई है और इसमें शामिल हैं: 1) क्रे-लाइन चयन, 2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन और वायरल निर्माण की पसंद, 3) जीन वितरण विधियां, और 4) इमेजिंग विधि।

यह तकनीक रेटिना सेल उप-आबादी तक आनुवंशिक पहुंच के लिए क्रे ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करती है। क्रे को प्रसवोत्तर रूप से सक्रिय होना चाहिए और वायरल संक्रमण और सेल लेबलिंग की संभावना को बढ़ाने के लिए इंजेक्शन के समय सेल आबादी में व्यक्त किया जाना चाहिए। इस रिपोर्ट में, CHAT-Cre का उपयोग स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए किया गया था, और Vglut2-Cre लाइन का उपयोग RGCs42,43 (चित्रा 6) के विकास को लक्षित करने के लिए किया गया था। Vglut2-IRES-Cre नॉक-इन चूहों में क्रे-निर्भर AAV इंजेक्शन ने जंक्शन आसंजन अणु बी सेल (चित्रा 6A) और द्वि-स्तरीकृत RGCs (चित्रा 6B, C) सहित विभिन्न प्रकार के RGCs को लेबल किया। वैकल्पिक रूप से, सिंथेटिक प्रमोटरों के साथ एएवी के नए डिजाइन जो सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति को चलाते हैं, क्रे ट्रांसजेनिक लाइनों 44 की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं। लाइव-इमेजिंग के लिए उपयुक्त कुशल और उज्ज्वल लेबलिंग के लिए एक और विचार अभिकर्मक और अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक न्यूनतम समय है, जो एएवी सेरोटाइप, ट्रोपिज़्म और टिटर 45 के आधार पर भिन्न हो सकता है। इन अध्ययनों में, जैसा कि एएवी-मध्यस्थता लेबलिंग को एक्सएफपी अभिव्यक्ति के लिए न्यूनतम 4-5 डीपीआई की आवश्यकता होती है, यह विधि प्रारंभिक प्रसवोत्तर टाइमपॉइंट्स तक पहुंचने के लिए उपयुक्त नहीं है। प्रारंभिक टाइमपॉइंट्स (जैसे, P0-P4) को कैप्चर करने के लिए, इंट्राओकुलर इंजेक्शन भ्रूण जानवरों में गर्भाशय में किए जा सकते हैं, जैसा कि यूटेरो इलेक्ट्रोपोरेशन 46 में किया गया था। स्टारबर्स्ट डेंड्राइट विकास के इस समूह के अध्ययन में, CHAT-Cre के प्रारंभिक विरल पुनर्संयोजन पैटर्न को माउस ट्रांसजेनिक क्रे रिपोर्टर, रोजा-mTmG27 का उपयोग करके P0-P4 पर एकल स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं को लेबल करने के लिए शोषण किया गया था। अंत में, इस एएवी रेटिना इंजेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग वयस्क सेल आबादी को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, जो स्टारबर्स्ट सेल आकृति विज्ञान 34 पर हानिकारक प्रभावों के बिना इंजेक्शन के 3 महीने बाद फ्लोरोसेंट लेबलिंग की दृढ़ता की पुष्टि के आधार पर किया जा सकता है।

यह पाइपलाइन वायरल निर्माण चयन में लचीलेपन के लिए भी अनुमति देती है। डेंड्राइट गतिशीलता को पकड़ने के लिए, विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन शामिल हैं जो विशिष्ट उपकोशिकीय संरचनाओं, ब्याज के प्रोटीन, या एक्टिन गतिशीलता (जैसे, लाइफएक्ट) और कैल्शियम सिग्नल (जैसे, जीसीएएमपी) जैसे कार्यात्मक परिवर्तनों की रिपोर्ट करते हैं। किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या क्लोन एएवी वेक्टर को नियोजित किया जा सकता है, और fpbase.org जैसे ऑनलाइन टूल को चमक और फोटोस्टेबिलिटी के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए। यहां, ब्रेनबो वायरल वैक्टर एक एच-रास फ़ार्नेसिलेशन सीएएएक्स मोटिफ के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोडिंग करते हुए झिल्ली स्थानीयकरण के लिए उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल विकास की शुरुआत में, XPFs के साइटोसोलिक स्थानीयकरण को ठीक न्यूराइट आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए आदर्श नहीं पाया गया था, जिसमें सोमा से संकेतों की अधिकता और ठीक शाखाओं के खराब लेबलिंग (चित्रा 6 ई) के साथ। तुलनात्मक रूप से, झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को ठीक डेंड्राइटिक प्रोट्रूशियंस (चित्रा 6 ई, एफ) को लेबल करने और हल करने के लिए दिखाया गया था। एक अन्य विचार वायरल निर्माण का आकार, डिजाइन और जटिलता है, जो अभिव्यक्ति के समय को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX उत्पन्न किया गया था, जो एक XFP को Cre-dependent तरीके से व्यक्त करता है। इस निर्माण में एक सरल डिजाइन है, और इसके परिणामस्वरूप 4 डीपीआई द्वारा कुशल अभिव्यक्ति होती है। साथ में, क्रे लाइनों, एएवी डिजाइन, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टरों के लिए विविध विकल्प जो व्यापक रूप से भंडार (जैसे, जैक्स, एडजीन और वायरल वेक्टर कोर) से उपलब्ध हैं, इस पाइपलाइन को रेटिना में सेल प्रकारों और विकासात्मक घटनाओं के विभिन्न प्रकार के अध्ययनों के लिए अनुकूलित करते हैं।

यद्यपि यह प्रोटोकॉल इंट्राओकुलर एएवी इंजेक्शन का विवरण देता है, अन्य जीन वितरण विधियां उपलब्ध हैं जैसे प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन 46 और बायोलिस्टिक जीन डिलीवरी (जैसे, जीन गन)7। इलेक्ट्रोपोरेशन को एक इलेक्ट्रिक पल्स लागू करने की आवश्यकता होती है, और बायोलिस्टिक जीन डिलीवरी के लिए रेटिना स्पष्टीकरण के पूर्व विवो इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। एएवी लेबलिंग इन दोनों तरीकों की तुलना में कम आक्रामक है और इमेजिंग से ठीक पहले रेटिना स्पष्टीकरण की तीव्र तैयारी की अनुमति देता है। बायोलिस्टिक जीन डिलीवरी (चित्रा 6ई, एफ) की तुलना में, एएवी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ऊतक व्यवहार्यता में वृद्धि हुई जो न्यूराइट गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए आवश्यक निरंतर अधिग्रहण के लिए बेहतर अनुकूल थी। उचित तकनीक के साथ, एएवी लेबलिंग रेटिना को कोई नुकसान नहीं पहुंचाता है, जैसा कि विच्छेदन के समय ऊतक के स्वास्थ्य द्वारा आंका जाता है। इंट्राविट्रल इंजेक्शन मुख्य रूप से गैंग्लियन सेल परत और आंतरिक परमाणु परत के भीतर कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं, जैसे कि आरजीसी और एमेक्राइन कोशिकाएं। कई दर्जनों स्टारबर्स्ट एमेक्राइन कोशिकाओं को आमतौर पर लेबल किया जाता है, जिसमें ऑप्टिक तंत्रिका सिर के चारों ओर लेबल कोशिकाओं का घनत्व बढ़ जाता है (चित्रा 4 सी)। हालांकि, सभी तीन अभिकर्मक विधियों के साथ, ऑप्टिक तंत्रिका विच्छेदन रेटिना स्पष्टीकरण प्राप्त करने के लिए अपरिहार्य है और आरजीसी अध: पतन का कारण बनेगा। ऑप्टिक तंत्रिका विच्छेदन के बावजूद, अध्ययन 36 घंटे के लिए विभिन्न प्रकार के कशेरुक मॉडल से व्यवहार्य रेटिना स्पष्टीकरण की रिपोर्ट करते हैं और 6 दिनों तक पोस्टन्यूक्लिएशन 5,6,7,47,48 तक।

अंत में, डेंड्राइट गतिशीलता को पकड़ने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया है। आमतौर पर, एक इमेजिंग सत्र 2-4 घंटे तक फैलता है, और ऊतक क्षरण या न्यूराइट ब्लेबिंग से पहले निष्कर्ष निकाला जाता है। 6 घंटे तक इमेजिंग सत्र आयोजित किए गए हैं; हालांकि, ऊपरी सीमा को व्यवस्थित रूप से परीक्षण नहीं किया गया है। लंबे समय तक इमेजिंग के कारण क्षेत्रों में फोटोब्लीचिंग हो सकती है, लेकिन स्पष्टीकरण में अन्य क्षेत्रों-के-दृश्य में कोशिकाएं लाइव-इमेजिंग के लिए व्यवहार्य रहती हैं। इस विधि को गहरी परतों और बड़े वॉल्यूम में न्यूरोनल आकृति विज्ञान की छवि के लिए मल्टीफोटॉन या लाइटशीट माइक्रोस्कोपी तक भी बढ़ाया जा सकता है। मल्टीफोटॉन इमेजिंग माउस रेटिना में न्यूराइट गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है और गहरे रेटिना लामिना (जैसे, क्षैतिज या फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं) में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए बेहतर अनुकूल है। हाल ही में, लाइव-सेल लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग रेटिना एंजियोजेनेसिस 50 को पकड़ने के लिए किया गया था, जो पूरे रेटिना में मॉर्फोजेनेसिस के लाइव-इमेजिंग के लिए एक नया एवेन्यू प्रदान करता है। लाइव-सेल लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग बड़े पैमाने पर तंत्रिका सर्किट असेंबली का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि अक्षतंतु-डेंड्राइट लक्ष्यीकरण। मल्टीकलर लाइव-इमेजिंग इस पाइपलाइन का एक और अनुप्रयोग है जिसका उपयोग सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि डेंड्राइट विकास पर पड़ोसी कोशिकाओं का प्रभाव या अन्य विकासात्मक घटनाएं जैसे कि आरजीसी उपप्रकार1, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स सहित रेटिना कोशिकाओं की टाइलिंग।

अंत में, विकासात्मक अध्ययनों का एक चुनौतीपूर्ण पहलू इन महत्वपूर्ण समय बिंदुओं पर पहुंच प्राप्त कर रहा है। यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट अस्थायी विंडो के दौरान होने वाली मॉर्फोजेनेसिस की कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। पाइपलाइन आनुवंशिक रूप से सेल आबादी को लक्षित करने और झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए मौजूदा उपकरणों और तकनीकों को जोड़ती है। तीव्र रेटिना फ्लैट-माउंट तैयारी कई घंटों में लाइव-सेल कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए व्यवहार्यता और फ्लोरोसेंट संकेतों को बनाए रखती है। डेंड्राइट विकास के क्षणिक और गतिशील पहलुओं को 3 डी वीडियो में कैप्चर किया जाता है और ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेस किया जाता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी वीडियो को कैप्चर करने की क्षमता गतिशील विकास प्रक्रियाओं की जांच में आवश्यक है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मैडिसन ग्रे को मुझे एक हाथ देने के लिए धन्यवाद देते हैं जब मेरे पास कोई नहीं था। इस शोध को एक NSERC डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN-2016-06128), न्यूरोसाइंस में एक स्लोन फैलोशिप और कनाडा रिसर्च चेयर टियर 2 (जेएलएल के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। एस इंग-एस्टेव्स को विजन साइंस रिसर्च प्रोग्राम और एनएसईआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति-डॉक्टरेट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source

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