Summary
Prøveforberedelse til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er en betydelig flaskehals i strukturbestemmelsesarbejdsgangen for denne metode. Her giver vi detaljerede metoder til brug af en brugervenlig, tredimensionelt trykt blok til fremstilling af støttefilm for at stabilisere prøver til transmission EM-undersøgelser.
Abstract
Strukturbestemmelse ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er hurtigt vokset i det sidste årti; Prøveforberedelsen er dog fortsat en betydelig flaskehals. Makromolekylære prøver er ideelt afbildet direkte fra tilfældige retninger i et tyndt lag glasagtig is. Men mange prøver er ildfaste til dette, og protein denaturering på luft-vand interface er et fælles problem. For at overvinde sådanne problemer, støtte film-herunder amorf kulstof, grafen, og grafenoxid-kan anvendes til nettet for at give en overflade, som prøver kan befolke, hvilket reducerer sandsynligheden for partikler oplever de skadelige virkninger af luft-vand interface. Anvendelsen af disse sarte understøtninger på gitre kræver imidlertid omhyggelig håndtering for at forhindre brud, luftbåren forurening eller omfattende vaske- og rengøringstrin. En nylig rapport beskriver udviklingen af en brugervenlig flydeblok, der letter befrugtet overførsel af støttefilm direkte til prøven. Brugen af blokken minimerer antallet af manuelle håndteringstrin, der kræves, bevarer støttefilmens fysiske integritet og den tid, hvor hydrofob forurening kan opsamles, hvilket sikrer, at der stadig kan genereres en tynd isfilm. Dette papir giver trin-for-trin protokoller til fremstilling af kulstof, grafen, og grafenoxid understøtter em-undersøgelser.
Introduction
I løbet af det seneste årti har gennembrud, hovedsagelig inden for detektorteknologi, men også på andre tekniske områder, lettet en række betydelige stigninger i opløsningen, hvor biologisk relevante systemer kan afbildes ved transmissionselektronmikroskopi (TEM)1,2. På trods af at cryo-EM allerede tillader opløsning af strukturer med høj opløsning fra så lidt som 50 μg protein gennem enkeltpartikelanalyse (SPA), forbliver kryo-EM-prøve og gitterforberedelse store flaskehalse3,4,5. SPA prøver består af makromolekyler fordelt ca tilfældigt inden for et lag af glasagtig is. Isen skal være så tynd som muligt for at maksimere kontrastforskellen mellem partiklerne og opløsningsmidlet. Biologiske makromolekyler er mere stabile (dvs. mindre tilbøjelige til at miste deres oprindelige struktur) i tykkere is, fordi de forbliver bedre opløst. Desuden er partikler ofte viser sig at være meget bedre fordelt over synsfeltet i is meget tykkere end partikelstørrelse6 og ofte ikke kan findes inden for huller i kulstoffilm på alle.
Derudover reducerer tykkere lag af is sandsynligheden for, at molekyler er tæt på luft-vand-grænsefladen på grund af det høje overflade-til-volumen-forhold, og det er blevet anslået, at brug af standard plunge-freezing metoder til cryo-EM-undersøgelser resulterer i adsorption af ~ 90% af partikler til luft-vand interface7. Tykkere is resulterer i uønsket høj baggrund på grund af øgede spredningshændelser i opløsningsmidlet og samtidig dæmpning af signalet6,7. Det er derfor nødvendigt at opnå så tyndt et lag glasøs is som muligt; ideelt set ville laget kun være lidt tykkere end partiklen. Udfordringen for forskeren, som skal overvindes for hver anden prøve, der påføres et gitter, er at forberede prøver, der er tynde nok til billeddannelse med høj kontrast, samtidig med at partiklernes strukturelle integritet i deres prøve bevares. Protein adsorption til luft-vand interface er ledsaget af flere, normalt skadelige, effekter.
For det første fremkalder binding af proteiner til denne hydrofobiske grænseflade ofte denaturering af proteinet, som fortsætter hurtigt og typisk er irreversibelt8,9. En undersøgelse foretaget ved hjælp af gær fedtsyre synthase viste, at op til 90% af adsorberet partikler er denatureret10. For det andet viste beviser fra en undersøgelse, der sammenlignede orienteringsfordelingen af 80S ribosomdatasæt indsamlet enten på amorf kulstof11 eller uden støtte12, at luftvandsgrænsefladen kan forårsage alvorlig præferenceorientering, der kompromitterer 3D-rekonstruktionen af volumen13. Metoder til at reducere partikelinteraktion med luft-vand-grænsefladen omfatter tilskud af frysebufferen med overfladeaktive stoffer (såsom vaskemidler), brug af støttefilm, affinitetsoptagelse eller stilladser af substrater og accelererede kastetider. Brugen af overfladeaktive stoffer er forbundet med sine egne problemer, da nogle proteinprøver kan opføre sig ikke-ideelt i deres tilstedeværelse, mens affinitetsfangende og stilladssubstrater generelt kræver tekniske skræddersyede gitteroverflader og fangststrategier. Endelig, selv om der er en masse forskning i udviklingen af hurtig-kaster enheder14,15,16, disse kræver apparater, der generelt ikke er bredt tilgængelige.
Selv om standard TEM-nettet for biologisk cryo-EM allerede har en perforeret amorf carbonfolie17, er der en række protokoller til rådighed for generering af yderligere støttefilm og deres overførsel til TEM-net. Anvendelsen af disse film er en veletableret metode til prøvestabilisering18. Amorfe kulstofstøtter genereres ved fordampning og aflejring på krystallinske glimmerplader19, hvorfra lagene kan flyde på gitre, med nytten af flydestøtter som nyttige værktøjer etableret i tidligere rapporter20. Grafenoxid flager, typisk udarbejdet ved hjælp af en modificeret version af Hummers metode21, er blevet brugt som en foretrukken støtte struktur til amorfe kulstof for deres nedsat baggrundssignal samt evnen til at immobilisere og stabilisere makromolekyler22. For nylig har der været en stigende interesse i brugen af grafen som TEM-støttefilm på grund af dens mekaniske stabilitet, høje ledningsevne, ekstremt lavt bidrag til baggrundsstøj23 samt fremkomsten af reproducerbare metoder til generering af makroskopisk store områder af monolayergrafen24 og overførsel til TEM-net25 . Sammenlignet med amorf kulstof, som gennemgår stråle-inducerede bevægelser på samme måde som, eller værre, end is mangler en støtte film11,12,17, graphene viste en betydelig reduktion i stråle-induceret bevægelse af cryo-EM billeder12.
Men mens hydroofile grafen beskyttet fedtsyrer syntasere fra luft-vand interfacial denaturering, forfatterne af denne undersøgelse bemærkede, at grafen blev forurenet under prøve forberedelse, sandsynligvis på grund af en kombination af atmosfærisk kulbrinte forurening og fra reagens bruges til hydrophilize gitre10. På trods af mange af de overlegne kvaliteter af grafen er dens udbredte brug stadig hæmmet af den derivatisering, der kræves for at reducere dens hydrofobicity12, som i sidste ende er kemisk vanskelig og kræver specialudstyr. Dette papir rapporterer protokoller til fremstilling af amorf kulstof, grafenoxid og grafenprøveunderstøttelse ved hjælp af en tredimensionelt (3D) trykt prøve floatation block27 til direkte overførsel af støttefilm fra de substrater, hvor de blev genereret, til TEM-gitre (figur 1). En vigtig fordel ved at bruge en sådan enhed er den fugtede overførsel af film, minimere hydrofob forurening af understøtningerne og dermed behovet for yderligere behandling og reducere antallet af potentielt skadelige manuelle håndteringstrin. Disse tilgange er billige at implementere og derfor bredt tilgængelige og anvendelige for cryo-EM-undersøgelser, hvor prøvestøtte er nødvendige.
Protocol
1. Generel forberedelse af TEM-net før supportoverførsel
- Ved hjælp af et par rene, fine pincet, lift og nedsænke TEM gitre sekventielt i dobbeltdestilleret vand (ddH2O) eller ultrapure vand til 10-15 s, efterfulgt af ethylacetat, for 10-15 s.
BEMÆRK: Her blev der brugt negativ handling, skråt-tip pincet. - Placer pincet, med gitter stadig i greb, til den ene side til lufttørre i ~ 5 min.
- Plasmarengør gitrene for at fjerne overfladen af eventuelle forurenende stoffer, der opsamles gennem luften eller vasketrinene.
BEMÆRK: Her blev plasmarensning udført for 10-15 s i luften med en radiofrekvenseffekt på 25 W.
2. Generel forberedelse af reagensopløsninger
- Uranylacetat (UAc) opløsning (2% w/v)
- Pak et 50 mL rør i folie, fyld med 50 mL ultrapure vand, og tilsæt 1 g UAc pulver.
BEMÆRK: UAc er lysfølsom og bundfalder over tid, når den udsættes. Da UAc er radioaktivt og giftigt, opretholde et højt niveau af renlighed. Med den alvorligste fare som følge af indånding eller indtagelse bør der udvises ekstra forsigtighed for at forhindre enhver mulighed for indånding af fine partikler. Handsker skal altid bæres ved håndtering eller afvejning af uransaltene. Masker og beskyttelsesbriller anbefales stærkt. Uransalte skal bortskaffes i overensstemmelse med de lovkrav, der er fastsat for radioaktive farer i staten. - Lad opløsningen omrøre i 1 time for at gøre det muligt for hele UAc at opløse. Opbevar ved 4 °C.
- Før brug filtreres 1 ml af pletopløsningen i et lille hætteglas ved hjælp af 0,22 μm filter for at fjerne eventuelle resterende acetatkrystaller.
- Pak et 50 mL rør i folie, fyld med 50 mL ultrapure vand, og tilsæt 1 g UAc pulver.
- Grafenoxid (GrOx) suspension
- Pipette 2,5 μL GrOx i et 1,5 mL rør (1% endelig koncentration). Pipette 2,5 μL på 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) vaskemiddel i GrOx, og bland forsigtigt (0,1% (w/v) endelig koncentration).
- Tilsæt 245 μL ultrapurt vand til GrOx-DDM mixet, og hvirvl straks kraftigt i 5 min. Brug GrOx-affjedring inden for 1 time efter tilberedningen, hvirvle kraftigt i mindst 1 minut før øjeblikkelig brug.
- Jern(III) chloridopløsning (FeCl3) (10% w/v)
- Afvejes forsigtigt 5 g FeCl3 i en vejebåd. Overfør til en 100 mL målecylinder indeholdende 35 mL ddH2O og en magnetisk rørestang.
- Placer på en magnetisk omrøring plade, og opløse FeCl3, tilføje ddH2O til et endeligt volumen på 50 mL. FeCl3-opløsningen filtreres gennem et 0,8 μm sprøjtefilter i en ren flaske til opbevaring.
BEMÆRK: FeCl3 er ætsende og irriterende; vaske hænder og andre udsatte områder med mild sæbe og vand, før de spiser, drikker eller ryger, og når de forlader arbejdet. Sørg for god ventilation i procesområdet for at forhindre dannelse af damp. Træk ikke vejret tåge, dampe, spray. Handsker skal altid bæres, når saltet håndteres eller afvejes. Masker og beskyttelsesbriller anbefales stærkt, når de er i brug.
3. Bufferudveksling for kulstofstøttefilm på glimmer for at forberede negativt farvede prøver ved hjælp af støtte floatation blok
- Vask og plasmarengørende TEM-gitre.
BEMÆRK: Her blev der anvendt 300 mesh holey-carbon kobbergitre som beskrevet ovenfor i afsnit 1. - Pipette 10-12 μL prøve i bufferbytserne (med de små kanaler) i flydeblokken og 10-12 μL på 2% UAc-opløsning (se punkt 2.1) for negativ farvning i den tilstødende ikke-bufferbytte brønd.
BEMÆRK: Brønden har et volumen på 10 μL; Dog justeres prøvevolumen, således at der dannes en konveks menisk på væskens overflade, så der kan dannes en korrekt folieflåd. En lav prøvemængde kan forårsage filmbrud. - Skær forsigtigt to små stykker glimmer med forudbestemt carbonfilm på toppen. Sørg for, at glimmerfragmenterne er brede nok til at passe ind i brønden (3,4 mm bredde) og længere end brøndlængden (3,45 mm), således at fragmentet vil sidde på brønden, mens kulstof flyder, og der er plads nok til at håndtere fragmentet med pincet.
BEMÆRK: For at håndtere carbon, skal du bruge flad negativ-action lang-tip pincet. Når du skærer glimmerfragmenterne, skæres ved hjælp af enkelte bevægelser for at opretholde kulstoffilmens integritet. - Sænk glimmer i brønden med en omtrentlig vinkel på 45°, indtil glimmer sidder på rampen af brønden og et lag af kulstof observeres på overfladen af væskeprøven.
- Efter den første inkubation på prøven (typisk 20 s til 20 min afhængigt af prøvens tilslutning; optimer denne periode baseret på eksperimentelle behov), træk glimmerarket meget langsomt tilbage for at genvinde carbonfilmen og minimere resterende viskøse prøvefastholdelse.
- Skam glimmeren forsigtigt ved at trykke på den nederste overflade (ikke-kulstofbaseret side) med filterpapir for at fjerne overskydende væske, og ombytte derefter det kulstof, der bærer prøven, til negativ plet ved at påføring til den modsatte brønd (dvs. nedsænke glimmeren som i trin 3.4), der indeholder 2% UAc-opløsningen.
BEMÆRK: Der skal observeres et kulstoflag, der flyder oven på pletopløsningen på dette tidspunkt. - Genvind det flydende kulstoflag med den hullede kulstofdækkede side af et vasket og plasmarenset EM-gitter. Lad gitrene blive lufttørret, indtil de billeddannelser er på en TEM. Ideelt set dækker gitrene under tørringsprocessen for at undgå luftbåren forurening.
4. Anvendelse af støtte floatation blok til fremstilling af grafenoxid-belagt TEM gitre
- Vask og plasmarengørende TEM-gitre med 300 mesh holey-carbon kobbergitre som beskrevet ovenfor (afsnit 1).
- Pipette 10-12 μL GrOx-affjedring (se punkt 2.2) i de 4 ikke-bufferbyttebøndere langs flydeblokken. Pipette 10-12 μL ddH2O eller ultrapure vand i de resterende 4 buffer udveksling brønde af blokken.
BEMÆRK: Denne mængde vand skal være tilstrækkelig til at danne en lille konveks menisk, der stiger over blokkens højde. - Drop 4 gitre forsigtigt på GrOx-affjedringen af hver brønd i 1 min, hvilket sikrer, at den hulede kulstofdækkede side kommer i kontakt med opløsningen. Efter 1 min, inddrive hvert gitter omhyggeligt ved at skubbe pincet ind i pincet rillen af hver ikke-buffer udveksling godt.
- Meget forsigtigt og kort røre kobber, ikke-kulstof-dækket side af hvert gitter til ddH2O i den tilstødende brønd. Derefter forsigtigt og forsigtigt holde nettet, vand dråbe-side ned, mod et stykke filterpapir.
BEMÆRK: Blotting off vandet vil trække GrOx suspension gennem nettet ved kapillær handling. Det er afgørende at undgå at nedsænke nettet i ddH2O, så kontakten skal være meget kort. Når gitteret løftes, skal en dråbe vand holde til undersiden af nettet. Pas på ikke at flytte gitteret på filterpapiret, da dette kan forstyrre afviklingen af GrOx-flagerne. - Lad gitrene i pincet lufttørre, indtil de er klargøring med prøve. Ideelt set dækker gitrene under tørringsprocessen for at undgå luftbåren forurening.
5. Anvendelse af støtte floatation blok til fremstilling af prøver på monolayer-graphene film
- Vask TEM-gitrene som beskrevet ovenfor (afsnit 1), men udelader plasmarensning.
BEMÆRK: Her blev der brugt 300 mesh holey-carbon guldgitre, men andre ikke-kobbergitre eller kobberlegeringsgitre er også praktisk gennemførlige. - At deponere gitre med grafen, direkte overførsel fra grafen dyrket på kobber (Cu-graphene) substrater til cryo-EM gitre, som beskrevet tidligere25.
- Placer fire vaskede gitre oven på et Cu-graphene ark (10 mm × 10 mm), der er deponeret på et glasrutschebane, og dæk hvert gitter med en dråbe isopropanol (5-10 μL) for at tillade intim kontakt mellem monolagsgrafen og gitteret.
BEMÆRK: Sørg for at placere den hullede kulstofdækkede side af gitrene i kontakt med grafenarket. - Når isopropanolen er helt fordampet (typisk 2 timer), skal cu-grafenarket flydes med gitre på 10% (w/v) FeCl3-opløsning (se punkt 2.3) i en glas petriskål, og lad det ætse ved stuetemperatur natten over. Dæk skålen for at undgå luftbåren forurening.
BEMÆRK: Når ætsningen er færdig, er det kun grafenmonomeren, der forbliver flydende på FeCl3-opløsningen - dette skal være synligt for øjet med passende belysning. - Brug en løkke med diameter større end TEM gitter størrelse til at fiske gitre flyder på grafen monolayer, og omhyggeligt overføre til et glas Petri fad indeholdende ddH2O at vaske.
BEMÆRK: Vær yderst forsigtig, når du fisker i gitrene for at undgå at ramme væggene i petriskålen, hvilket kan forårsage grafenfilmbrud eller bøjning. - Vask to gange mere i vand ved at fiske net og overføre til en ren Petri fad indeholdende ddH2O at fjerne alle resterende FeCl3. Endelig overføres gitre til en petriskål, der indeholder prøvebuffer, indtil prøveforberedelse og frysning af dyk.
BEMÆRK: Den grafendækkede side af nettene skal til enhver tid holdes fugtet for at undgå, at de udsættes for luftbårne forurenende stoffer.
- Placer fire vaskede gitre oven på et Cu-graphene ark (10 mm × 10 mm), der er deponeret på et glasrutschebane, og dæk hvert gitter med en dråbe isopropanol (5-10 μL) for at tillade intim kontakt mellem monolagsgrafen og gitteret.
- Prøven (10-12 μL) pipettes i en brønd, der ikke bufferer, i flydeblokken. Når prøven er klar i blokken, skal du vælge et grafenbelagt gitter fra bufferopløsningen ved hjælp af et par rene pincet og placeres på overfladen af den prøveholdige brønd.
- Efter en passende inkubationsperiode (1-5 min afhængigt af prøven; optimer efter eksperimentelle behov), skal du vælge gitteret med et par rene frysende pincet og fortsætte med blotting og vitrifikation.
Representative Results
TEM-gitre, der er tilberedt med amorfe kulstofstøtter, er typisk dækket over hele gitteroverfladen. Selv om brud på kulstoffilmen forekommer i nogle tilfælde sammen med nogle ruffling (Figur 2A), er et stort antal gitter firkanter uberørte og dermed bredt anvendelige til negative farvningsformål. Den vigtigste faktor, der påvirker støttens integritet, er kulstoftykkelsen, som bestemmes under kulstoffordampning. Tilsvarende opnås god dækning rutinemæssigt med denne GrOx-protokol på tværs af hele nettet (Figur 2B). En enkelt anvendelse af GrOx-affjedring i 1 min er tilstrækkelig til at sikre få områder med flere lag, som er nemme at se på grund af flagekanter. GrOx gitre kan fremstilles hurtigt fra råvarer og er meget beskyttende for prøven. Flagekanter, ufuldstændig dækning og ruffling er dog oftere synlige med GrOx-gitre end for de andre teknikker på grund af GrOx-flagernes art.
Selv om integriteten af grafen støtte film, ligesom amorfe kulstof, afhænger af aflejringsprocessen, områder, der er godt dækket vise den karakteristiske diffraktion mønster af enkelt lag grafen. Det er vigtigt, at prøver kan genvindes fra flydeblokken efter en inkubationsperiode, og data, der indsamles på en måde, der kan bruges til analyse af enkeltpartikler, ved at holde grafenunderstøttede. Denne metode kræver ikke nogen anden behandling af grafen til befugtning, hvorved kravet om dyrt udstyr til at gøre grafen hydrofil, og det er bedst at forberede støtte film kort før prøve forberedelse og net frysning (Figur 2C).
Figur 1: Prøve floatation blok design og anvendelse under støtte film forberedelse. (A) Skematisk af top, brønd og sidevisninger af flydeblokken, herunder målinger af form, dybde og hældning. Rillen for pincet tips til at hvile, samt kanaler til at indsætte nåle, er angivet. (B) Amorfe kulstoflag kan let flød op på bufferoverfladen, der er indeholdt i flydeblokkens brønde ved hjælp af rampen, dvs. (C) Brøndenes bredde er velegnet til at rumme et TEM-gitter, mens pincetsporene reducerer behovet for at frigive og afhente gitre unødigt under forberedelsestrin, men tilbyder en defineret vej til at genvinde gitre uden risiko for bøjning, hvis gitre frigives. Billeder i B ændres fra 27. Forkortelse: TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Typiske eksempler på prøvestøttefilm, der er udarbejdet ved hjælp af flydeblokken. Gitter firkantede (venstre) og billede (højre) visninger er vist for (A) amorf kulstof, (B) grafenoxid, og (C) grafen støtte film udarbejdet ved hjælp af flydeblok. Den amorfe kulstofstøtte blev anvendt til fremstilling af 70S ribosomer til negativ farvning, mens grafenoxid- og grafenstøtterne blev anvendt til fremstilling af 70S ribosomer til kryo-EM. Billeder i A og C ændres fra 27. Skalastang for en gitter firkant = 10 μm; skalastænger for B- og C-gitterkvaler = 5 μm skalalinjer for A-C-billedvisninger = 50 nm. Forkortelse: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dette papir præsenterer protokoller for håndtering af både amorfe kulstof og grafen film til cryo-EM prøve forberedelse ved hjælp af en prøve floatation block27. En STL-fil til supportblokken er frit tilgængelig fra det offentlige Thingiverse-lager [www.thingiverse.com/thing:3440684] og kan 3D-printes med enhver passende stereolitografiprinter fra en passende harpiks. Brugen af kulstoffilm, der dækker et TEM-gitter, indebærer normalt kulstofflåd på prøven28. Denne tilgang til udarbejdelse af negative pletgitre minimerer lufteksponeringen under støttehåndtering og reducerer dermed forurening og proteindenaturering. Forberedelsen af gitre, der bruger flydende kulstof i små brønde, er fordelagtigt at flyde et større overfladeareal, dvs. i et vandbad eller petriskål, i hvilket tilfælde mekanisk klipning af kulstof forekommer meget lettere.
UAc kan være vanskeligt at købe på grund af gældende sundheds- og sikkerhedsbestemmelser på tidspunktet for offentliggørelsen. Mange andre almindeligt anvendte, ikke-radioaktive, negative farvning reagenser er tilgængelige, og protokoller for deres forberedelse er blevet beskrevet tidligere29. Selv om der ikke er anvendt alternative pletter med denne støtte floatation blok, er det ikke sandsynligt, at der ville være nogen forskelle i disse protokoller ud over optimering af inkubationstid med prøve (trin 3.5), som allerede i sagens natur er stikprøveafhængig. Det vigtigste trin i denne GrOx-supportforberedelsesprotokol er trin 4.4, fremhævet af noten for at forhindre vand- og GrOx-løsningen i at komme i kontakt rundt om gitterkanten. Uhensigtsmæssig blanding af vandet og GrOx-opløsninger forhindrer ensrettet afregning af GrOx-flagerne ved kapillær handling. At have GrOx-flager på begge sider af kulstoffolien resulterer i tykke lag og negerer dermed fordelene ved at bruge GrOx som en næsten enkelt lagstøtte samt fældefangstvand mellem flagerne, hvilket forårsager forurening af brugbare områder med yderligere lag is. Grafenoxid støtte forberedelse er relativt let at opnå ved hjælp af dråber af opløsning på fleksibel polyolefin film. Men når det udføres på den måde, er det lettere ved et uheld at forurene kobbersiden af nettet ved fejlfejl; brugen af flydeblokken reducerer sandsynligheden for denne eventualitet.
Endelig dette papir præsenterer en protokol til at forberede grafen-dækket net, der undgår enhver form for grafen forbehandling for at gøre det hydrofile, hvilket reducerer omkostningerne og øge dens tilgængelighed. Det er tilstrækkeligt at opretholde en fugtet folie under hele prøveforberedelsen og påføring af prøven på stedet i blokken lige før frysningen, så der kan dannes egnede ilag til kryo-EM med en homogen prøvefordeling. Samlet set minimerer de protokoller, der præsenteres her, prøvekontakt med luft-vand-grænsefladen, hvilket reducerer prøvedenaturering og understøtter forurening. For de tre støttefilm, der anvendes i disse tilgange, kan homogene prøvefordelinger opnås på tværs af gitrene sammen med billeddannelse af intakte, velbevarede enkeltpartikler.
Disclosures
Forfatterne er ikke bekendt med nogen interessekonflikter med hensyn til dette arbejde.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af sektionen for strukturel &syntetisk biologi på Imperial College London, der har hjulpet med at teste disse teknikker, samt Harry Barnett på Imperial College Advanced Hackspace, og Paul Simpson på Center for Strukturel Biologi. CHSA støttes af et Sir Henry Dale Fellowship, der finansieres i fællesskab af Wellcome Trust og Royal Society (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
