Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Induktion af humane dental pulp stamceller mod bugspytkirtel afstamning

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol præsenterer en sammenligning mellem to forskellige induktion protokoller for differentiering human tandmasse stamceller (hDPSCs) mod bugspytkirtel afstamning in vitro:den integrative protokol og den ikke-integrative protokol. Den integrative protokol genererer flere insulinproducerende celler (IPC'er).

Abstract

Fra 2000, succes bugspytkirtel bliver transplantation ved hjælp af Edmonton protokollen til behandling af type I diabetes mellitus stadig står over for nogle forhindringer. Disse omfatter det begrænsede antal af kadaveriske bugspytkirtel donorer og den langsigtede brug af immunosuppressiva. Mesenchymale stamceller (MSC' er) er blevet anset for at være en potentiel kandidat som en alternativ kilde til holmlignende cellegenerering. Vores tidligere rapporter har med succes illustreret etableringen af induktionsprotokoller til differentiering af humane tandpulssamceller (hDPSCs) til insulinproducerende celler (IPC'er). Induktionseffektiviteten varierede imidlertid meget. I dette papir demonstrerer vi sammenligningen af hDPSCs pancreas induktionseffektivitet via integrative (mikromiljø- og genmanipulation) og ikke-integrative (mikromiljømanipulation) induktionsprotokoller til levering af hDPSC-afledte IPC'er (hDPSC-IPCs). Resultaterne tyder på forskellige induktion effektivitet for både induktion tilgange i form af 3-dimensionelle koloni struktur, udbytte, bugspytkirtel mRNA markører, og funktionel egenskab på multi-dosering glukose udfordring. Disse resultater vil understøtte den fremtidige etablering af en klinisk anvendelig IPC'er og pancreas afstamning produktionsplatform.

Introduction

Diabetes mellitus er en løbende global bekymring. En international diabetesforbund (IDF) rapport anslog, at den globale forekomst af diabetes ville stige fra 151 millioner i 2000 til 415 millioner i 20151,2. Den seneste epidemiologibaserede undersøgelse har forudsagt, at den anslåede globale diabetesprævalens vil stige fra 451 millioner i 2017 til 693 millioner i 20451. Succesen med bugspytkirteløse transplantation ved hjælp af Edmonton protokollen blev først demonstreret i 2000, da det blev vist sig at opretholde endogene insulinproduktion og stabilisere normoglykæmisk tilstand hos type I diabetikere3. Anvendelsen af Edmonton-protokollen står dog stadig over for et flaskehalsproblem. Det begrænsede antal af kadaveriske bugspytkirtel donorer er det vigtigste problem, da hver patient med type I diabetes kræver mindst 2-4 holm donorer. Desuden kan langvarig brug af immundæmpende midler forårsage livstruende bivirkninger4,5. For at løse dette har udviklingen af en potentiel behandling for diabetes i det seneste årti hovedsagelig fokuseret på generering af effektive insulinproducerende celler (IPC'er) fra forskellige kilder til stamceller6.

Stamceller blev en alternativ behandling i mange sygdomme, herunder diabetes type I, som er forårsaget af tabet af beta-celler. Transplantation af IPC'er er den nye lovende metode til kontrol af blodsukkeret hos disse patienter7. To metoder til generering af IPC'er, integrative og ikke-integrative induktionsprotokoller, er præsenteret i denne artikel. Induktionsprotokollen efterlignede den naturlige udviklingsproces i bugspytkirtlen for at få de modne og funktionelle IPC'er8,9.

Til denne undersøgelse var hDPSC'er karakteriseret ved flowcytometry til MSC-overflademarkørdetektering, differentieringspotentiale for flerelinjer og RT-qPCR til bestemmelse af ekspressionen af stemnessegenskab og proliferative genmarkører (data vist ikke)8,9,10. hDPSC'er blev induceret mod endelig endoderm, pancreas endoderm, pancreas endokrine, og bugspytkirtel beta-celler eller IPC 'er (Figur 1), henholdsvis7. For at fremkalde cellerne blev en tretrins induktionsmetode brugt som en rygradsprotokol. Denne protokol blev kaldt en ikke-integrativ protokol. I tilfælde af integrativ protokol blev den væsentlige pancreas transskriptionsfaktor, PDX1, overekspresseret i hDPSCs efterfulgt af induktion af overekspresseret PDX1 i hDPSC'er ved hjælp af en tre-trins differentieringsprotokol. Forskellen mellem ikke-integrativ og integrativ protokol er overekspressionen af PDX1 i integrativ protokol og ikke i den ikke-integrative protokol. Pancreas differentiering blev sammenlignet mellem de integrative og ikke-integrative protokoller i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette arbejde blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og godkendt af Human Research Ethics Committee, Det Tandvidenskabelige Fakultet, Chulalongkorn Universitet. Human DPSCs (hDPSCs) blev isoleret fra humane dental pulp væv udvundet fra både premolarer og kindtænder på grund af visdom tænder spørgsmål. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienterne i henhold til en godkendt protokol (HREC-DCU 2018/054).

1. Integrerende introduktionsprotokol

  1. Forberedelse af lentiviral vektor med PDX1
    1. Brug humane embryonale nyrer (HEK) 293FT celler til viral emballage. Kultur og vedligeholde disse celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum (FBS), 1% L-glutamin, og 1% antibiotika-antimycotic.
    2. Generer PDX1-lentivirusvektorer ved co-transfekt på 10 μg hver af emballagen og kuvert plasmider og 20 μg af de målrettede gen plasmid i HEK293FT celler ved hjælp af calcium fosfat transfection system, f.eks psPAX2, pMD2. G, og menneskelige pWPT-PDX111. Sørg for, at cellerne er 80%-90% sammenflydende i infektionstidspunktet.
    3. Det medium, der indeholder lentivirale partikler ved 48 og 72 timer efter transfekten, opsamles.
    4. Det indsamlede medium filtreres gennem et 0,45 μm filter koncentrere viraene med et centrifugalfilter ved 100 kDa nominel molekylær vægtskæring (NMWCO).
  2. PDX1 overekspression
    1. Brug passage 3-5 hDPSC, der er 70-80% sammenflydende. Prøv at få prøver og tælle cellerne ved hjælp af en celletæller. Frø 1 x 106 hDPSCs på en 60 mm vævskulturbehandlet skål og inkuber natten over.
    2. 24 timer senere tilsættes friske viruspartikler fra trin 1.1.4 til transduce polybrene forbehandlede celler (4 μg/mL polybrene, 30 min under 37 °C og 5% CO2) ved den ønskede mangfoldighed af infektion (MOI). I dette tilfælde er moi f.eks. Cellerne i cellekulturinkubatoren skal opbevares i 24 timer ved 37 °C med 5% CO2.
    3. Efter infektionsperioden på 24 timer kasseres det medium, der indeholder viruspartikler. Tilføj friske kultur medier og fortsætte med at dyrke cellerne i 48 timer. Alle kulturer holdes ved 37 °C og 5% CO2.
    4. Kontroller den aggregerede morfologi af de transfected celler, før du går videre til induktion trin. PDX1 transduktion bekræftes ved genekspressionsanalyse(supplerende figur 1).
      BEMÆRK: Kontroller cellemorfologien under et mikroskop, før du går videre til næste trin.
    5. Høst og fortsæt til en induktionsprotokol i tre trin (trin 1.3) som en tilgang til induktion af mikromiljøet.
  3. Protokol om induktion i tre trin
    BEMÆRK: Den tre-trins induktion protokol resulterede i en række pancreas differentiering af hDPSCs til endelig endoderm, bugspytkirtel endoderm / endokrine, og bugspytkirtel beta-celler / IPC'er ved hjælp af serum-fri medium (SFM)-A, SFM-B, og SFM-C, hhv.
    1. Kasser dyrkningsmediet, og vask derefter de transducerede hDPSC'er med 1x fosfatbufferopløsning (PBS).
    2. Der tilsættes 0,25% trypsin-EDTA-opløsning til cellerne og inkuberes i 1 min ved 37 °C, 5% CO2.
    3. Tilsæt kulturmediet for at stoppe trypsinaktiviteten og skyl forsigtigt cellerne for at få enkeltcelleophænget. Tæl cellerne og aliquot 1 x 106 celler i hvert opsamlingsrør.
    4. Celleaffjedringen centrifuges ved 468 x g (relativ centrifugalkraft: RCF), 4 °C, i 5 min. Kassér supernatanten og gem cellepillen.
    5. Genbrug pellet i 3 mL af første pancreas induktion medium, dvs serum-fri medium (SFM)-A. Frø cellerne på en lav fastgørelse kultur plade (60 mm). Cellerne skal opbevares ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dage.
      BEMÆRK: Overhold cellernes morfologi under et omvendt mikroskop, før du går videre til næste trin.
    6. Fjern SFM-A og tilsæt 3 mL af det andet induktionsmedium, dvs. SFM-B. Cellerne skal vedligeholdes i de næste 2 dage ved 37 °C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Overhold cellernes morfologi under et omvendt mikroskop, før du går videre til næste trin.
    7. Fjern SFM-B og tilsæt 3 mL af det tredje induktionsmedium, dvs. SFM-C. Cellerne opbevares i de næste 5 dage i en cellekulturinkubator, der holdes ved 37 °C med 5% CO2. Skift mediet hver 48. Overhold deres morfologi efter 5 dage.
      BEMÆRK: Hvert induktionsmedium suppleres med forskellige reagenser som beskrevet; SFM-A: 1% kvægserumalbumin (BSA), 1x insulin-transferrin-selen (ITS), 4 nM aktiv i A, 1 nM natrium butyrat og 50 μM beta-mercaptoethanol SFM-B: 1% BSA, 1x ITS og 0,3 mM taurin; og SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM glukagonlignende peptid (GLP)-1, 1 mM nicotinamid og 1x ikke-essentielle aminosyrer (NEAAs).
    8. Sørg for at kontrollere cellemorfologien under et omvendt mikroskop efter hvert trin. Cellerne vil blive mere aggregeret og flyde som kolonier.
    9. Saml cellekolonier til yderligere analyse. Tjek for koloni morfologi og størrelse. Udfør pancreas genmarkør ekspression analyse og funktionel analyse (Glukose stimuleret C-peptid sekretion assay).

2. Ikke-integrativ induktionsprotokol

BEMÆRK: Den ikke-integrative protokol er rygradsprotokollen til levering af IPC'er med induktionsprocessen i tre trin som en tilgang til induktion af mikromiljøet8,9.

  1. Brug passage 3-5 hDPSCs ved 70%-80% sammenløb.
  2. Kassér kulturmediet og vask hDPSC'er med 1x PBS.
  3. Der tilsættes 0,25 % trypsin-EDTA-opløsning på cellerne og inkuberes i 1 min ved 37 °C, 5% CO2.
  4. Tilsæt kulturmediet for at stoppe trypsinaktiviteten og pipetter forsigtigt cellerne for at opnå enkeltcelleophænget. Tæl celler og aliquot 1 x 106 celler i hvert opsamlingsrør.
    1. Celleaffjedringen centrifuges ved 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Kassér supernatanten.
    2. Pelletpen i SFM-A og frøet opsuges på en lav fastgørelseskulturplade (60 mm). Cellerne dyrkes ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dage. Kontroller cellemorfologien under et omvendt mikroskop.
    3. Fjern SFM-A, tilsæt SFM-B (dag 3) og vedligehold derefter cellerne i de næste 2 dage under 37 °C, 5% CO2.
    4. Fjern SFM-B, tilsæt SFM-C (dag 5) og hold derefter cellerne i de næste 5 dage under 37 °C, 5% CO2. SFM-C ændres hver 48.
      BEMÆRK: Hvert induktionsmedium suppleres med forskellige reagenser som beskrevet; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM aktiv I A, 1 nM natrium butyrat og 50 μM beta-mercaptoethanol SFM-B: 1% BSA, 1x ITS og 0,3 mM taurin; og SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM nicotinamid og 1x NEAAs.
    5. Sørg for at kontrollere cellemorfologien under det omvendte mikroskop efter hvert trin og på dag 10.
      BEMÆRK: Cellerne bliver mere aggregerede og vil flyde som kolonier.
    6. Saml cellekolonier til yderligere analyse. Tjek for koloni morfologi og størrelse. Udfør pancreas genmarkør ekspression analyse og funktionel analyse (Glukose stimuleret C-peptid sekretion assay).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikel blev resultaterne af begge induktionsprotokoller sammenlignet. Diagrammerne for begge induktionsprotokoller er illustreret i figur 2A, C. I begge protokoller blev evalueringen udført under et let mikroskop, og billeder blev analyseret med ImageJ. hDPSCs var i stand til at danne kolonilignende strukturer fra den første induktionsdag i begge induktionsprotokoller. Koloniens morfologi var rund og tæt, og alle kolonier flød i kulturkarrene gennem induktionsperioden (Figur 2B, D). Det samlede antal kolonier af begge protokoller blev også fastlagt; resultatet viste, at det samlede antal kolonier i tilfælde af integrerende induktionsprotokol var lidt højere sammenlignet med den ikke-integrative induktionsprotokol (figur 2E). Forskellen var imidlertid ikke statistisk signifikant. Desuden blev kolonistørrelsesfordelingen i begge introduktionsprotokoller også evalueret (Figur 2F). Ifølge vores resultater blev små til mellemstore kolonier dannet ved den integrative induktion, hvilket var vigtigt for at reducere den nekrotiske kerne inde i kolonien.

Pancreas gen markør analyse blev udført ved hjælp af RT-qPCR i henhold til vores seneste publikation10. Oplysninger om listen over de primere, der anvendes i denne undersøgelse, findes i tabel 1. mRNA-værdien blev præsenteret som et relativt mRNA-udtryk ved normaliseret til 18S ribosomalt RNA og kontrolelementet ved hjælp af formlen 2(-ΔΔCt). Resultaterne af denne undersøgelse viste, at den integrative induktionsprotokol gav kolonier med højt udtryk for sene pancreasmarkører, herunder ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINog GLP-1R (Figur 3), hvilket tyder på differentiering af hDPSCs mod IPC'er. Den funktionelle evaluering af HDPSC-IPC'er blev også beskrevet (Figur 4) i denne undersøgelse. En glukosestimulerende C-peptid sekretion8,9 assay blev ansat ved hjælp af et ELISA-kit. Resultaterne viste, at de integrative og ikke-integrative induktionsprotokoller gav kolonier, der var i stand til at udskille C-peptid.

Figure 1
Figur 1: Diagram over MSC-differentiering over IPC'er. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Morfologi, samlet koloniantal og kolonistørrelsesfordeling af IPC'er ved hjælp af to forskellige protokoller. Diagram over den integrative protokol ved overekspression af væsentlige transskribering faktor, PDX1, efterfulgt af tre-stejle induktion protokol (A). Morfologi af transfected hDPSCs i hvert trin af induktion (B). Diagram over ikke-integrativ som rygradsprotokol (C). Morfologi af hDPSC-IPC'er ved hjælp af den ikke-integrative protokol (D). Total koloni (E) og kolonistørrelsesfordeling (F) af to forskellige protokoller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Analyse af genekspression i bugspytkirtlen af hDPSC-IPC'er fra to forskellige protokoller. MRNA-udtrykket af endoderm i bugspytkirtlen (PDX1 og NGN-3) (A), pancreas-isletmarkører (ISL-1, MAF-A, GLUT-2og INSULIN) (B) og pancreas-relateret markør (GLP-1R) (C) blev analyseret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4:Funktionel analyse af hDPSC-IPC'er fra to forskellige protokoller. C-peptid sekretion i hver induktion protokol, integrativ (A) og ikke-integrative (B) protokoller, blev bestemt af en glukose-stimuleret C-peptid sekretion (GSCS) analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: PDX1 mRNA-analyse efter PDX1-transduktion. PDX1 mRNA-udtryksanalyse efter 48 timers PDX1-transduktion ved MOI 20 i hDPSC'er vises. Klik her for at hente denne fil.

Gener Tiltrædelsesnummer Fremad primer Længde Tm
Omvendt primer (1984) (°C)
PDX-1 NM_000209,4 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999.3 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
GLUT-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
INSULIN NM_000207.2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062,4 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTCTGTGTTTG – 3' 60.25
18S NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGC – 3' 54.86

Tabel 1: Primer-oplysninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opnåelse af højere IPC'er produktion fra MSCs spiller en væsentlig rolle i diabetes terapi. De kritiske trin i den integrative protokol er afhængige af kvaliteten af de celler, der skal anvendes til transduktion og kvaliteten af transducerede celler. Nogle cellekrav, der bør kontrolleres for vellykket transduktion, sikrer cellesundhed, cellebankstyring og celler er i en mitotically aktiv tilstand. Desuden spiller overvågning af transducerede cellers levedygtighed også en vigtig rolle. Mindre vellykket transduktion skyldes den dårlige levedygtighed af de stimulerede celler12. For de ikke-integrative protokoller skal det morfologiske udseende og flydende kolonier opnås, fordi de er relateret til modningen af pancreas differentiering9.

Med hensyn til ændring og fejlfinding af teknikken til den integrative induktionsprotokol kan sunde celler af god kvalitet opnås ved hjælp af celler i passagerne 3-5 og 70%-80% sammenløb, mens kvaliteten af transducerede celler skal overvåges ved rutinemæssigt at kontrollere kvaliteten af de stimulerede celler, før du går videre til næste trin. Dette fund er i sammenhæng med en tidligere undersøgelse, der nævnte, at flere faktorer, der påvirker transduktionens effektivitet, er afhængige af cellesundhed, cellekonfluens og antallet af passager13. I denne undersøgelse står den ikke-integrative protokol med en tretrinsinduktionsproces stadig over for begrænsninger, hovedsagelig vedrørende kolonistørrelse og koloninummerdannelse. Dette resultat er ioverensstemmelsemed vores tidligere undersøgelse 8,9. For at løse dette problem foreslår vi at kontrollere cellernes kvalitet samt kvaliteten af de lave fastgørelseskulturskibe.

Begrænsningen af denne teknik er kompleksiteten af den integrative induktionsprotokol, som skyldtes brugen af to forskellige på hinanden følgende platforme. Desuden indebærer den højere MOI ikke højere effektivitet af transduktion. I en lignende undersøgelse ved hjælp af lentivirustransduktion kunne en højere MOI ikke opnå bedre transduktionseffektivitet. Forfatterne foreslår at bruge en adjuvans som protamin sulfat14. Begrænsningerne ved at anvende de ikke-integrative protokoller er relateret til tekniske spørgsmål såsom håndteringsteknikker til produktion og høst af kolonien og forskellige størrelser og morfologiske strukturer af de producerede IPC'er.

Den væsentlige transskriberingsfaktor, PDX1, var betydelig og spillede dermed en potentiel rolle i tilsagnet om MSC-induktion over for de modne IPC'er15,16,17,18. Ændringen af rygradsprotokollen ved hjælp af PDX1-overekspresseredehDPSC'er efterfulgt af en induktionsprotokol i tre trin var hovedsagelig rettet mod en vellykket produktion af modne og funktionelle IPC'er med højt udbytte19,20,21. Resultaterne af denne protokol afspejlede , at MSC-induktionen mod modne IPC'er krævede præ-endodermisk udtryk for PDX19. Den morfologiske evaluering viste, at koloniernes ikke-vedhæftede 3D-struktur kunne opnås i begge protokoller ved hjælp af fartøjer med lav fastgørelse. Denne struktur var vigtig for at opnå modning af differentiering i bugspytkirtlen7,9,22,23. Derudover resulterede den integrative protokol ifølge kolonistørrelsesevalueringen i en positiv tendens i det samlede kolonital og små til mellemstore koloniproduktioner, hvilket kan forhindre en nekrotisk kerne af kolonien. Derfor vil det være gavnligt for yderligere transplantation7,19,21,24,25. Opreguleringen af senfasede pancreas-genmarkører (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINog GLP-1R) blev observeret i denne protokol. Den sene fase pancreas gen markører i integrativ induktion protokol var højere i forhold til rygraden protokol. Det blev afsløret , at overekspressionen af PDX1 øgede antallet af pancreas stamfadere, dvs et bedre resultat i form af progression af midten til slutningen af bugspytkirtlen udvikling kunne opnås19,26,27,28. For at klarlægge IPC'ernes funktion blev der desuden foretaget en GSCS-analyse. hDPSC-IPC'er fremstillet af begge protokoller udskilles C-peptid, hvilket tyder på funktionelt aktive kolonier.

For at opsummere de fremtidige anvendelser af den teknik, der anvendes i denne undersøgelse, var begge induktionsprotokoller i bugspytkirtlen i stand til at generere IPC'erne in vitro. Med hensyn til det samlede koloniantal, små og mellemstore koloniproduktion og pancreasmarkørudtryk viste den integrative protokol en gavnlig tendens til IPC-dannelse, der understøtter yderligere MSC-anvendelse i stamcellebaserede diabetesbehandlinger til human og veterinær praksis7,29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

SK, WR og QDL blev støttet af Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO og PP blev støttet af Chulalongkorn Academic Advancement i sit2. århundredes projekt. CS blev støttet af en forskning støtte tilskud fra Det Veterinærvidenskabelige Fakultet, Chulalongkorn Akademisk Avancement i sin2 nd Century Project, Veterinary Stem Cell og Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University, og regeringen Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Tags

Bioengineering Problem 175 insulinproducerende celler IPC'er slægter i bugspytkirtlen humane tandmasse stamceller hDPSCs diabetes mellitus
<em>In vitro</em> Induktion af humane dental pulp stamceller mod bugspytkirtel afstamning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter