Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציג השוואה בין שני פרוטוקולי אינדוקציה שונים להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) כלפי שושלות הלבלב במבחנה: הפרוטוקול האינטגרטיבי והפרוטוקול הלא אינטגרטיבי. הפרוטוקול האינטגרטיבי מייצר יותר תאים המייצרים אינסולין (IPCs).

Abstract

נכון ל-2000, ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון לטיפול בסוכרת מסוג I עדיין נתקלה בכמה מכשולים. אלה כוללים את המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric ואת השימוש ארוך הטווח של מדכאי חיסון. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחשבו למועמד פוטנציאלי כמקור חלופי ליצירת תאים דמויי איון. הדו"חות הקודמים שלנו המחישו בהצלחה את הקמתם של פרוטוקולי אינדוקציה להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) לתאים מייצרי אינסולין (IPCs). עם זאת, יעילות האינדוקציה השתנתה מאוד. במאמר זה, אנו מדגימים את ההשוואה של יעילות אינדוקציה בלבלב hDPSCs באמצעות אינטגרטיבית (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית וגנטית) ופרוטוקולי אינדוקציה לא אינטגרטיביים (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית) לאספקת IPCs שמקורם ב- hDPSC (hDPSC-IPCs). התוצאות מצביעות על יעילות אינדוקציה ברורה הן עבור גישות האינדוקציה במונחים של מבנה מושבה תלת מימדי, תשואה, סמני mRNA הלבלב, ורכוש פונקציונלי על אתגר גלוקוז מרובה מינון. ממצאים אלה יתמכו בהקמה עתידית של IPCs ופלטפורמת ייצור שושלת לבלב ישימים קלינית.

Introduction

סוכרת היא דאגה גלובלית מתמשכת. דו"ח של הפדרציה הבינלאומית לסוכרת (צה"ל) העריך כי השכיחות העולמית של סוכרת תגדל מ-151 מיליון בשנת 2000 ל-415 מיליון בשנת 20151,2. המחקר האחרון המבוסס על אפידמיולוגיה חזה כי שכיחות הסוכרת העולמית המשוערת תגדל מ -451 מיליון בשנת 2017 ל -693 מיליון בשנת 20451. ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון הודגמה לראשונה בשנת 2000, כאשר הוכח לשמור על ייצור אינסולין אנדוגני ולייצב את המצב הנורמוגליקמי בסוג I חולי סוכרת3. עם זאת, היישום של פרוטוקול אדמונטון עדיין מתמודד עם בעיה צוואר בקבוק. המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric הוא הבעיה העיקרית שכן כל חולה עם סוכרת מסוג I דורש לפחות 2-4 תורמי איון. יתר על כן, השימוש ארוך הטווח של סוכנים מדכאי חיסון עלול לגרום לתופעות לוואי מסכנות חיים4,5. כדי להתמודד עם זה, הפיתוח של טיפול פוטנציאלי לסוכרת בעשור האחרון התמקד בעיקר ביצירת תאים יעילים לייצור אינסולין (IPCs) ממקורות שונים של תאי גזע6.

תאי גזע הפכו לטיפול אלטרנטיבי במחלות רבות, כולל סוכרת מסוג I, אשר נגרמת על ידי אובדן של תאי בטא. השתלת IPCs היא השיטה המבטיחה החדשה לשליטה גלוקוז בדם בחולים אלה7. במאמר זה מוצגות שתי גישות ליצירת IPCs, פרוטוקולי אינדוקציה אינדוקטיביים ולא אינטגרטיביים. פרוטוקול האינדוקציה חיקה את התהליך ההתפתחותי הטבעי של הלבלב כדי לקבל את IPCs8,9בוגרים ופונקציונליים .

עבור מחקר זה, hDPSCs התאפיינו בציטומטריית זרימה עבור זיהוי סמן משטח MSC, פוטנציאל בידול מרובה שורות, ו- RT-qPCR כדי לקבוע את הביטוי של מאפיין גזענות וסמני גנים נפוצים (נתונים שאינם מוצגים)8,9,10. hDPSCs הושרו לקראת אנדודרם סופי, אנדודרם הלבלב, אנדוקריני הלבלב, ותאי בטא הלבלב או IPCs (איור 1), בהתאמה7. כדי לגרום לתאים, גישת אינדוקציה בת שלושה שלבים שימשה לפרוטוקול עמוד השדרה. פרוטוקול זה נקרא פרוטוקול לא אינטגרטיבי. במקרה של פרוטוקול אינטגרטיבי, גורם שעתוק הלבלב החיוני, PDX1, התבטא יתר על המידה ב- hDPSCs ואחריו אינדוקציה של PDX1 בלחץ יתר ב- hDPSCs באמצעות פרוטוקול בידול של שלושה שלבים. ההבדל בין פרוטוקול לא אינטגרטיבי ואינטגרטיבי הוא ביטוי יתר של PDX1 בפרוטוקול אינטגרטיבי ולא בפרוטוקול הלא-אינטגרטיבי. ההבחנה בלבלב הושוותה בין הפרוטוקולים האינטגרטיביים והלא אינטגרטיביים במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבודה זו בוצעה בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרה על ידי ועדת האתיקה לחקר האדם, הפקולטה לרפואת שיניים, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. DPSCs אנושי (hDPSCs) היו מבודדים מרקמות עיסת שיניים אנושיות שחולצו הן premolars והן שיניים שיניים עקב בעיות שיני בינה. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים על פי פרוטוקול מאושר (HREC-DCU 2018/054).

1. פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי

  1. הכנת וקטור lentiviral נושא PDX1
    1. השתמש בכליות עובריות אנושיות (HEK) 293FT תאים לאריזה ויראלית. תרבית ושמירה על תאים אלה במדיום הנשר המותנה (DMEM) של דולבק בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% L-גלוטמין ו-1% אנטי-אנטי-מיקוטיק.
    2. צור PDX1-lentivirus וקטורים על ידי transfection משותף של 10 מיקרוגרם כל אחד מהפלסטידים אריזה ומעטפת ו 20 מיקרוגרם של פלסמיד הגן הממוקד לתוך תאי HEK293FT באמצעות מערכת טרנספקטיון פוספט סידן, למשל, psPAX2, pMD2. G, ו PWPT-PDX1אנושי 11. ודא כי התאים הם 80%-90% מפגש בזמן ההדבקה.
    3. לאסוף את המדיום המכיל חלקיקים lentiviral ב 48 ו 72 שעות לאחר transfection.
    4. לסנן את המדיום שנאסף באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר; לרכז את הווירוסים עם מסנן צנטריפוגלי ב 100 kDa נומינלי משקל מולקולרי לחתוך (NMWCO).
  2. ביטוי יתר של PDX1
    1. השתמש במעבר 3-5 hDPSC כי הם 70-80% confluent. Trypsinize וספור את התאים באמצעות מונה תאים. זרע 1 x 106 hDPSCs על צלחת 60 מ"מ תרבית טיפול רקמות ודגרה לילה.
    2. 24 שעות מאוחר יותר, להוסיף חלקיקי וירוס טריים המתקבלים בשלב 1.1.4 כדי להעביר תאים פוליברן שטופלו מראש (4 מיקרוגרם / מ"ל polybrene, 30 דקות תחת 37 °C ו 5% CO2) בריבוי הרצוי של זיהום (MOI). לדוגמה, במקרה זה, MOI בשימוש הוא 20. לשמור על התאים באינקובטור תרבית התא במשך 24 שעות ב 37 °C (5% CO2).
    3. לאחר תקופת ההדבקה של 24 שעות, יש להשליך את המדיום המכיל חלקיקים ויראליים. הוסף מדיה תרבית טרי ולהמשיך לגדל את התאים עבור 48 שעות. כל התרבויות נשמרות ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
    4. בדוק את המורפולוגיה המצטברת של התאים שהודבקו לפני שתמשיך לשלב האינדוקציה. התמרה PDX1 מאושרת על ידי ניתוח ביטויגנים (איור 1 משלים).
      הערה: בדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
    5. לקצור ולהמשיך לפרוטוקול אינדוקציה של שלושה שלבים (שלב 1.3) כגישת אינדוקציה מיקרו-ויראלית.
  3. פרוטוקול אינדוקציה תלת-שלטי
    הערה: פרוטוקול האינדוקציה בן שלושת השלבים הביא לסדרה של בידול הלבלב של hDPSCs לאנדודרם מוחלט, אנדודרם/אנדוקרין של הלבלב ותאי בטא/IPCs בלבלב באמצעות מדיום ללא סרום (SFM)-A, SFM-B ו- SFM-C, בהתאמה.
    1. השלך את מדיום התרבות ולאחר מכן לשטוף את transduced-hDPSCs עם פתרון 1x פוספט-חוצץ (PBS).
    2. הוסף 0.25% פתרון טריפסין-EDTA לתאים ודגר במשך דקה אחת ב 37 °C (5%), 5% CO2.
    3. הוסף את מדיום התרבות כדי לעצור את פעילות טריפסין ולשטוף בעדינות את התאים כדי לקבל את ההשעיה של תא בודד. לספור את התאים aliquot 1 x 106 תאים לתוך כל צינור איסוף.
    4. צנטריפוגה השעיית התא ב 468 x גרם (כוח צנטריפוגלי יחסי: RCF), 4 °C (5 דקות). להשליך את supernatant ולשמור את גלולה התא.
    5. Resuspend הכדור ב 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה הלבלב הראשון, כלומר, בינוני ללא סרום (SFM)-A. זרע את התאים על צלחת תרבות התקשרות נמוכה (60 מ"מ). לשמור על התאים ב 37 °C (5%) ו 5% CO2 במשך 3 ימים.
      הערה: התבונן במורפולוגיה של תאים תחת מיקרוסקופ הפוך לפני שתמשיך לשלב הבא.
    6. הסר SFM-A ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום האינדוקציה השני, כלומר, SFM-B. לשמור על התאים במשך 2 הימים הבאים ב 37 °C (5°F), 5% CO2.
      הערה: התבונן במורפולוגיה של תאים תחת מיקרוסקופ הפוך לפני שתמשיך לשלב הבא.
    7. הסר SFM-B והוסף 3 מ"ל של מדיום האינדוקציה השלישי, כלומר, SFM-C. לשמור על התאים במשך 5 הימים הבאים בחממה תרבית התא נשמר ב37 °C (5%) החליפו את המדיום כל 48 שעות. שימו לב למורפולוגיה שלהם לאחר 5 ימים.
      הערה: כל מדיום אינדוקציה מתווסף עם ריאגנטים שונים כמתואר; SFM-A: 1% אלבומין סרום בקר (BSA), 1x אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 4 ננומטר של activin A, 1 ננומטר של נתרן butyrate, ו 50 מיקרומטר של בטא-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS, ו 0.3 mM טאורין; ו-SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, טאורין 3 מ"מ, 100 ננומטר של פפטיד דמוי גלוקגון (GLP)-1, 1 mM nicotinamide ו-1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAAs).
    8. הקפד לבדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך לאחר כל שלב. התאים יהפכו למצטברים יותר ויצופו כמושבות.
    9. לאסוף מושבות תאים לניתוח נוסף. בדוק אם יש מורפולוגיה וגודל של המושבה. בצע ניתוח ביטוי סמן גן הלבלב וניתוח פונקציונלי (גלוקוז מגורה C-פפטיד הפרשת ישבן).

2. פרוטוקול אינדוקציה לא אינטגרטיבי

הערה: הפרוטוקול הלא-אינטגרטיבי הוא פרוטוקול עמוד השדרה להעברת ה- IPCs עם תהליך האינדוקציה בן שלושת השלבים כגישת אינדוקציה מיקרו-ויראלית8,9.

  1. השתמש במעבר 3-5 hDPSCs ב 70%-80% השפעה.
  2. השלך את מדיום התרבות ושטוף hDPSCs עם PBS 1x.
  3. הוסף 0.25% פתרון טריפסין-EDTA על התאים ודגר במשך 1 דקות ב 37 °C (5%), 5% CO2.
  4. הוסף את המדיום התרבותי כדי לעצור את פעילות טריפסין ולחבר בעדינות את התאים כדי להשיג את ההשעיה של תא בודד. לספור תאים aliquot 1 x 106 תאים לתוך כל צינור איסוף.
    1. צנטריפוגה השעיית התא ב 468 x גרם (RCF), 4 °C (5 °F), 5 דקות. זרוק את סופר-טבעי.
    2. יש להזרים מחדש את הכדור ב-SFM-A ולזרוע על צלחת תרבות נמוכה (60 מ"מ). תרבית התאים ב 37 °C (5%) ו 5% CO2 במשך 3 ימים. בדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך.
    3. הסר SFM-A, הוסף SFM-B (יום 3) ולאחר מכן לשמור על התאים במשך 2 הימים הבאים תחת 37 °C (5°F), 5% CO2.
    4. הסר SFM-B, הוסף SFM-C (יום 5) ולאחר מכן לשמור על התאים במשך 5 הימים הבאים תחת 37 °C (5 °F), 5% CO2. SFM-C משתנה כל 48 שעות.
      הערה: כל מדיום אינדוקציה מתווסף עם ריאגנטים שונים כמתואר; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 ננומטר של activin A, 1 ננומטר של נתרן butyrate, ו 50 מיקרומטר של בטא-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS, ו 0.3 mM טאורין; ו- SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, טאורין 3 מ"מ, 100 ננומטר של GLP-1, 1 mM ניקוטינאמיד ו- 1x NEAAs.
    5. הקפד לבדוק את מורפולוגיית התא תחת המיקרוסקופ ההפוך לאחר כל שלב וביום 10.
      הערה: התאים יהפכו לצבורים יותר ויצופו כמושבות.
    6. לאסוף מושבות תאים לניתוח נוסף. בדוק אם יש מורפולוגיה וגודל של המושבה. בצע ניתוח ביטוי סמן גן הלבלב וניתוח פונקציונלי (גלוקוז מגורה C-פפטיד הפרשת ישבן).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במאמר זה הושוו התוצאות של שני פרוטוקולי האינדוקציה. הדיאגרמות של שני פרוטוקולי האינדוקציה מודגמות באיור 2A, C. בשני הפרוטוקולים, ההערכה בוצעה תחת מיקרוסקופ אור, ותמונות נותחו עם ImageJ. hDPSCs הצליחו ליצור מבנים דמויי מושבה מהיום הראשון של אינדוקציה בשני פרוטוקולי האינדוקציה. המורפולוגיה של המושבה הייתה עגולה וצפופה, וכל המושבות צפו בכלי התרבות לאורך כל תקופת האינדוקציה(איורים 2B,D). כמו כן נקבעה ספירת המושבות הכוללת של שני הפרוטוקולים; התוצאה הראתה כי ספירת המושבות הכוללת במקרה של פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי הייתה מעט גבוהה יותר בהשוואה לפרוטוקול האינדוקציה הלא-אינטגרטיבי (איור 2E). עם זאת, ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית. יתר על כן, התפלגות גודל המושבה בשני פרוטוקולי האינדוקציה הוערכה גם היא (איור 2F). על פי התוצאות שלנו, מושבות קטנות עד בינוניות נוצרו על אינדוקציה אינטגרטיבית, אשר היה חשוב להפחתת הליבה הנמק בתוך המושבה.

ניתוח סמן גנים הלבלב נערך באמצעות RT-qPCR על פי הפרסום האחרון שלנו10. מידע על רשימת הפריימרים המשמשים במחקר זה נכלל בטבלה 1. ערך ה- mRNA הוצג כביטוי mRNA יחסי על-ידי נרמול ל- RNA ריבוזומלי של 18S והפקד באמצעות הנוסחה של 2(-ΔΔCt). תוצאות מחקר זה גילו כי פרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבי הניב מושבות עם ביטוי גבוה של סמני לבלב מאוחרים, כולל ISL-1, MAF-A, GLUT-2, אינסולין, ו- GLP-1R (איור 3), מה שמרמז על בידול של hDPSCs ל- IPCs. ההערכה התפקודית של hDPSC-IPCs תוארה גם היא (איור 4) במחקר זה. הפרשת C-פפטיד מגרה גלוקוז8,9 בדיקת הועסקה באמצעות ערכת ELISA. התוצאות הראו כי פרוטוקולי האינדוקציה האינטגרטיביים והלא אינטגרטיביים הניבו מושבות שהצליחו להפריש C-פפטיד.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של בידול MSC כלפי IPCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2:מורפולוגיה, ספירת מושבות כוללת והתפלגות גודל המושבה של IPCs באמצעות שני פרוטוקולים שונים. דיאגרמה של הפרוטוקול האינטגרטיבי על ידי ביטוי יתר של גורם תמלול חיוני, PDX1, ואחריו פרוטוקול אינדוקציה תלת תלול (A). מורפולוגיה של hDPSCs transfected בכל שלב של אינדוקציה (B). דיאגרמה של לא אינטגרטיבית כפרוטוקול עמוד שדרה (C). מורפולוגיה של hDPSC-IPCs באמצעות הפרוטוקול הלא אינטגרטיבי (D). התפלגות גודל המושבה הכוללת (E) וגודל המושבה (F) של שני פרוטוקולים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח ביטוי גנים בלבלב של hDPSC-IPCs שהתקבל משני פרוטוקולים שונים. ביטוי ה- mRNA של אנדודרם הלבלב (PDX1 ו- NGN-3) (A), סמני אי הלבלב (ISL-1, MAF-A, GLUT-2 ו- INSULIN) (B), וסמן הקשור ללבלב (GLP-1R) (C) נותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח פונקציונלי של hDPSC-IPCs שהתקבל משני פרוטוקולים שונים. הפרשת C-פפטיד בכל פרוטוקול אינדוקציה, פרוטוקולים אינטגרטיביים (A) ולא אינטגרטיביים (B), נקבעו על ידי בדיקת הפרשת C-פפטיד מגורה גלוקוז (GSCS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ניתוח PDX1 mRNA לאחר התמרה PDX1. מוצג ניתוח ביטוי PDX1 mRNA לאחר 48 שעות של התמלת PDX1 ב- MOI 20 ב- hDPSCs מוצג. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

גנים מספר גישה פריימר קדמי אורך Tm
פריימר הפוך (bp) (°C)
PDX-1 NM_000209.4 5' – AAGCTCACGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999.3 5' – CggTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCTTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
גלוט-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
אינסולין NM_000207.2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062.4 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTCTGTTTTTG – 3' 60.25
שנות ה-18 NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' 54.86

טבלה 1: מידע פריימר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השגת ייצור IPCs גבוה יותר מ- MSCs ממלאת תפקיד חיוני בטיפול בסוכרת. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול האינטגרטיבי מסתמכים על איכות התאים שישמשו להעברתם ולאיכות התאים המועברים. דרישות תאים מסוימות שיש לבדוק עבור טרנסולציה מוצלחת מבטיחות את תקינות התא, ניהול בנקאות התאים והתאים נמצאים במצב פעיל במיטוטי. יתר על כן, ניטור הכדאיות של תאים transduced גם ממלא תפקיד חשוב. טרנסדוקציה פחות מוצלחת נגרמת על ידי הכדאיות הירודה של התאים מגורה12. עבור הפרוטוקולים הלא אינטגרטיביים, המראה המורפולוגי והמושבות הצפות צריכות להיות מושגות מכיוון שהן קשורות להבשלת בידול הלבלב9.

במונחים של שינוי ופתרון בעיות של הטכניקה עבור פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי, תאים בריאים ואיכותיים ניתן להשיג באמצעות תאים במעברים 3-5 ו 70%-80% מפגש, בעוד איכות התאים transduced יש לפקח על ידי בדיקה שגרתית של איכות התאים מגורה לפני המעבר לשלב הבא. ממצא זה נמצא בקורלציה עם מחקר קודם שהזכיר כי מספר גורמים המשפיעים על היעילות של התמרה מסתמכים על בריאות התא, מפגש התאים ומספר המעברים13. במחקר זה, הפרוטוקול הלא אינטגרטיבי עם תהליך אינדוקציה של שלושה שלבים עדיין מתמודד עם מגבלות, בעיקר לגבי גודל המושבה ויצירת מספר המושבה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם המחקר הקודם שלנו8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו מציעים לבדוק את איכות התאים, כמו גם את איכות כלי התרבות ההתקשרות הנמוכה.

המגבלה של טכניקה זו היא המורכבות של פרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבית, שנבעה משימוש בשתי פלטפורמות רצופות שונות. יתר על כן, MOI גבוה יותר אינו מרמז על יעילות גבוהה יותר של transduction. במחקר דומה באמצעות התמרה lentivirus, MOI גבוה יותר לא יכול להשיג יעילות transduction טובה יותר. המחברים מציעים להשתמש אדג'ובנט כגון פרוטמין סולפט14. המגבלות של שימוש בפרוטוקולים שאינם אינטגרטיביים קשורות לנושאים טכניים כגון טכניקות הטיפול לייצור וקציר של המושבה וגדלים שונים ומבנים מורפולוגיים של IPCs המיוצרים.

גורם התמלול החיוני, PDX1, היה משמעותי, ובכך היה בעל תפקיד פוטנציאלי במחויבות של אינדוקציה MSC כלפי IPCs בוגר15,16,17,18. השינוי של פרוטוקול עמוד השדרה באמצעות PDX1- overexpressed hDPSCs ואחריו פרוטוקול אינדוקציה של שלושה שלבים כוון בעיקר לייצור מוצלח בתפוקה גבוהה של IPCs בוגרים ופונקציונליים19,20,21. הממצאים של פרוטוקול זה שיקפו כי אינדוקציה MSC כלפי IPCs בוגרים נדרש ביטוי טרום אנדודרמי של PDX19. ההערכה המורפולוגית הראתה כי המבנה 3D שאינו מצורף של מושבות ניתן להשיג בשני הפרוטוקולים באמצעות כלי התקשרות נמוכה. מבנה זה היה חשוב להשגת ההתבגרות של בידול הלבלב7,9,22,23. בנוסף, על פי הערכת גודל המושבה, הפרוטוקול האינטגרטיבי הביא למגמה חיובית של מספר המושבה הכולל וייצור מושבה קטן עד בינוני, אשר יכול למנוע ליבה נמקית של המושבה. לכן, זה יהיה מועיל להשתלה נוספת7,19,21,24,25. עלייה של סמני גן הלבלב בשלב מאוחר (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, אינסולין, ו- GLP-1R) נצפתה בפרוטוקול זה. סמני הגן הלבלב בשלב מאוחר בפרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבית היו גבוהים יותר בהשוואה לפרוטוקול עמוד השדרה. התגלה כי ביטוי יתר של PDX1 הגדיל את מספר אבות הלבלב, כלומר, תוצאה טובה יותר מבחינת ההתקדמות של התפתחות הלבלב באמצע עד מאוחר ניתן להשיג19,26,27,28. יתר על כן, כדי להבהיר את הפונקציה של IPCs, בדיקת GSCS בוצעה. h hDPSC-IPCs שהופקו משני הפרוטוקולים הפרש C-פפטיד, דבר המצביע על המושבות הפעילות מבחינה תפקודית.

כדי לסכם את היישומים העתידיים של הטכניקה המשמשת במחקר זה, שני פרוטוקולי אינדוקציה הלבלב הצליחו ליצור את IPCs במבחנה. במונחים של ספירת המושבות הכוללת, ייצור מושבה קטנה עד בינונית, וביטוי סמן הלבלב, הפרוטוקול האינטגרטיבי הראה מגמה מועילה להיווצרות IPC, ותומך ביישום MSC נוסף בטיפולי סוכרת מבוססי תאי גזע לפרקטיקות אנושיות ווטרינריות7,29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

SK, WR, ו- QDL נתמכו על ידי תא גזע וטרינרי ויחידת המחקר הביו-הנדסה, קרן הקרן להנדסה של Ratchadaphiseomphot, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. TO ו- PP נתמכו על ידי קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאההשנייה שלה. מדעי מדעי המוח נתמכו על ידי מענק תמיכה במחקר של הפקולטה למדעי הווטרינריה, קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאה השנייה שלה, תאי גזע וטרינריים ויחידת מחקרביו-הנדסה, קרן קרן ראטצ'אדאפיססומפוט, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן וקרן המחקר הממשלתית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 175 תאים מייצרי אינסולין IPCs שושלות לבלב תאי גזע עיסת שיניים אנושית hDPSCs סוכרת
<em>במבחנה</em> אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter