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Bioengineering

इन विट्रो अग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम सेल का प्रेरण

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विट्रो मेंअग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं (एचडीपीएससी) में अंतर करने के लिए दो अलग-अलग प्रेरण प्रोटोकॉलों के बीच तुलना प्रस्तुत करता है: एकीकृत प्रोटोकॉल और गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल। इंटीग्रेटिव प्रोटोकॉल अधिक इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) उत्पन्न करता है।

Abstract

2000 के रूप में, अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण की सफलता एडमोंटन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रकार मैं मधुमेह मेलिटस के इलाज के लिए अभी भी कुछ बाधाओं का सामना करना पड़ा. इनमें शव अग्न्याशय दाताओं की सीमित संख्या और इम्यूनोसप्रेसेंट का दीर्घकालिक उपयोग शामिल है। मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) को आइलेट जैसे सेल जनरेशन के वैकल्पिक स्रोत के रूप में संभावित उम्मीदवार माना गया है । हमारी पिछली रिपोर्टों में इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) के लिए मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं (एचडीपीएससी) में अंतर करने के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल की स्थापना को सफलतापूर्वक दर्शाया गया है । हालांकि, प्रेरण दक्षता बहुत भिन्न थी। इस पेपर में, हम एचडीपीएससी-व्युत्पन्न आईपीसी (एचएसपीएससी-आईपीसी) देने के लिए एकीकृत (माइक्रोएनवायरमेंटल और जेनेटिक हेरफेर) और गैर-एकीकृत (माइक्रोएनवायरमेंटल हेरफेर) प्रेरण प्रोटोकॉल के माध्यम से एचडीपीएससी अग्नाशय की प्रेरण दक्षता की तुलना प्रदर्शित करते हैं। परिणाम बहु-खुराक ग्लूकोज चुनौती पर 3-आयामी कॉलोनी संरचना, उपज, अग्नाशय एमआरएनए मार्कर और कार्यात्मक संपत्ति के संदर्भ में दोनों प्रेरण दृष्टिकोणों के लिए अलग-अलग प्रेरण दक्षता का सुझाव देते हैं। ये निष्कर्ष चिकित्सकीय रूप से लागू आईपीसी और अग्नाशय वंश उत्पादन मंच की भावी स्थापना का समर्थन करेंगे।

Introduction

मधुमेह मेलिटस एक सतत वैश्विक चिंता का विषय है । इंटरनेशनल डायबिटीज फेडरेशन (आईडीएफ) की एक रिपोर्ट में अनुमान लगाया गया है कि मधुमेह की वैश्विक व्यापकता 2000 के 151 मिलियन से बढ़कर 2015 में 415 मिलियन हो जाएगी। नवीनतम महामारी विज्ञान आधारित अध्ययन में भविष्यवाणी की गई है कि दुनिया भर में मधुमेह की अनुमानित व्यापकता २०१७ में ४५१,०,००० से बढ़कर २०४५ १ में६९३,०,०हो जाएगी । एडमोंटन प्रोटोकॉल का उपयोग करके अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण की सफलता पहली बार 2000 में प्रदर्शित की गई थी, जब इसे अंतर्जात इंसुलिन उत्पादन को बनाए रखने और टाइप I मधुमेह रोगियों में नॉर्मोग्लिेमिक स्थिति को स्थिर करने के लिए दिखाया गया था3। हालांकि, एडमोंटन प्रोटोकॉल के आवेदन अभी भी एक अड़चन समस्या का सामना करना पड़ता है । कैडेनिक अग्न्याशय दाताओं की सीमित संख्या मुख्य मुद्दा है क्योंकि प्रकार के साथ प्रत्येक रोगी मैं मधुमेह कम से कम 2-4 आइलेट दाताओं की आवश्यकता है। इसके अलावा, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के दीर्घकालिक उपयोग से जीवन-धमकी देने वाले दुष्प्रभाव4,5 होसकतेहैं। इसका समाधान करने के लिए, पिछले एक दशक में मधुमेह के लिए एक संभावित चिकित्सा के विकास ने मुख्य रूप से स्टेम सेल 6 के विभिन्न स्रोतों से प्रभावीइंसुलिनउत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित किया है।

स्टेम सेल मधुमेह टाइप I सहित कई बीमारियों में एक वैकल्पिक उपचार बन गया, जो बीटा कोशिकाओं के नुकसान के कारण होता है। इन रोगियों में रक्त ग्लूकोज कोनियंत्रितकरने के लिए आईपीसी का प्रत्यारोपण नई आशाजनक विधि है । इस लेख में आईपीसी, इंटीग्रेटिव और नॉन-इंटीग्रेटिव इंडक्शन प्रोटोकॉल जेनरेट करने के लिए दो दृष्टिकोण प्रस्तुत किए गए हैं । इंडक्शन प्रोटोकॉल ने परिपक्व और कार्यात्मक आईपीसी8,9प्राप्त करने के लिए प्राकृतिक अग्नाशय की विकास प्रक्रिया की नकल की .

इस अध्ययन के लिए, एचडीपीएससी को एमएससी सतह मार्कर डिटेक्शन, मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता, और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए प्रवाह साइटोमेट्री की विशेषता थी, जो स्टेमनेस संपत्ति और प्रोलिफेरेटिव जीन मार्कर (डेटा नहीं दिखाए गए)8,9,10की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए था। एचडीपीएससी को क्रमशः7निश्चित एंडोडर्म, अग्नाशय के एंडोडर्म, अग्नाशय के अंतःस्रावी, और अग्नाशय बीटा-कोशिकाओं या आईपीसी(चित्रा 1)की ओर प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए, एक रीढ़ प्रोटोकॉल के रूप में एक तीन कदम प्रेरण दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल को नॉन इंटीग्रेटिव प्रोटोकॉल कहा जाता था। एकीकृत प्रोटोकॉल के मामले में, आवश्यक अग्नाशय के ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, पीडीएक्स 1को एचडीपीएससी में अतिउपसारित किया गया था जिसके बाद तीन चरणों वाले भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके एचडीपीएससी में अतिएक्सप्रेस्ड पीडीएक्स1 को शामिल किया गया था। गैर-एकीकृत और एकीकृत प्रोटोकॉल के बीच अंतर एकीकृत प्रोटोकॉल में पीडीएक्स 1 का अतिव्यवसंगतता है न कि गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल में। अग्नाशय के भेदभाव की तुलना इस अध्ययन में एकीकृत और गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल के बीच की गई थी।

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Protocol

यह काम हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार किया गया था और मानव अनुसंधान आचार समिति, दंत चिकित्सा संकाय, चुलालोंग्कोर्न विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव डीपीएससी (एचडीपीएससी) को ज्ञान दांतों के मुद्दों के कारण प्रीमोलार और मोलर्स दोनों से निकाले गए मानव दंत लुगदी ऊतकों से अलग किया गया था। एक अनुमोदित प्रोटोकॉल (एचआरईसी-डीसीयू 2018/054) के तहत रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. इंटीग्रेटिव इंडक्शन प्रोटोकॉल

  1. पीडीएक्स1 ले जाने वाले लेंटीवायरल वेक्टर की तैयारी
    1. वायरल पैकेजिंग के लिए मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293FT कोशिकाओं का उपयोग करें। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में संस्कृति और इन कोशिकाओं को बनाए रखें।
    2. कैल्शियम फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन सिस्टम, जैसे, psPAX2, pMD2 का उपयोग करके HEK293FT कोशिकाओं में लक्षित जीन प्लाज्मिड के 10 माइक्रोन के सह-ट्रांसफेक्शन द्वारा PDX1-lentivirus वैक्टर उत्पन्न करें। जी, और मानव pWPT-PDX1 11। सुनिश्चित करें कि संक्रमण के समय कोशिकाएं 80%-90% कॉन्फ्लूंट हैं।
    3. ट्रांसफेक्शन के बाद 48 और 72 घंटे में लेंटीवायरल कणों वाले माध्यम को इकट्ठा करें।
    4. एकत्र किए गए माध्यम को 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें; 100 केडीए नाममात्र आणविक वजन कट-ऑफ (एनएमडब्ल्यूसीओ) पर एक अपकेंद्रित्र फिल्टर के साथ वायरस को केंद्रित करें।
  2. PDX1 अतिव्यक्तता
    1. 3-5 एचडीपीएससी का उपयोग करें जो 70-80% कॉन्फ्लूंट हैं। एक सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और गिनें। बीज 1 x 106 एचडीपीएससी पर 60 मिमी ऊतक संस्कृति-उपचारित पकवान और रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. 24 घंटे बाद, संक्रमण की वांछित बहुलता (एमओआई) पर पॉलीब्रेन पूर्व-उपचारित कोशिकाओं (4 μg/mL पॉलीब्रेन, 30 मिनट अंडर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के लिए चरण1.1.4से प्राप्त ताजा वायरस कणों को जोड़ें। उदाहरण के लिए, इस मामले में, एमओआई का उपयोग 20 है। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर24घंटे तक बनाए रखें ।
    3. 24 घंटे की संक्रमण अवधि के बाद, वायरल कणों वाले माध्यम को त्याग दें। ताजा संस्कृति मीडिया जोड़ें और ४८ घंटे के लिए कोशिकाओं को बढ़ जारी है । सभी संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए रखाजाताहै।
    4. प्रेरण चरण पर आगे बढ़ने से पहले संक्रमित कोशिकाओं की एकत्रित आकृति विज्ञान की जांच करें। पीडीएक्स 1 ट्रांसडक्शन की पुष्टि जीन एक्सप्रेशनएनालिसिस (पूरक चित्रा 1)द्वारा की जाती है।
      नोट: अगले चरणों में आगे बढ़ने से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे सेल आकृति विज्ञान की जांच करें।
    5. फसल और एक माइक्रोएनवायरमेंटल प्रेरण दृष्टिकोण के रूप में एक तीन कदम प्रेरण प्रोटोकॉल (चरण 1.3) के लिए आगे बढ़ें।
  3. तीन कदम प्रेरण प्रोटोकॉल
    नोट: तीन कदम प्रेरण प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप क्रमशः सीरम-मुक्त माध्यम (एसएफएम)-ए, एसएफएम-बी और एसएफएम-सी का उपयोग करके एचडीपीएससी के अग्नाशय के भेदभाव की श्रृंखला हुई ।
    1. संस्कृति माध्यम को त्यागें, और फिर ट्रांसड्यूडेड-एचडीपीएससी को 1x फॉस्फेट-बफर समाधान (पीबीएस) के साथ धोएं।
    2. कोशिकाओं में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. ट्राइप्सिन गतिविधि को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ें और एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे कोशिकाओं को फ्लश करें। प्रत्येक संग्रह ट्यूब में कोशिकाओं और aliquot 1 x10 6 कोशिकाओं की गणना करें।
    4. 468 x g (सापेक्ष सेंट्रलीफ्यूगल फोर्स: आरसीएफ), 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए सेल निलंबन पर सस्पेंशन करें। सुपरनेट को त्यागें और सेल पैलेट को बचाएं।
    5. पहले अग्नाशय के इंडक्शन मीडियम यानी सीरम-फ्री मीडियम (एसएफएम) के 3 एमएल में पैलेट को रीसपेंड करें- कम अटैचमेंट कल्चर प्लेट (60 एमएम) पर कोशिकाओं को सीड करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर3 दिनों तक बनाए रखें।
      नोट: अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
    6. एसएफएम-ए निकालें और दूसरे इंडक्शन मीडियम यानी एसएफएम-बी के 3 एमएल डालें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5%सीओ2 पर अगले 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।
      नोट: अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
    7. एसएफएम-बी को हटाएं और तीसरे इंडक्शन मीडियम यानी एसएफएम-सी के 3 एमएल डालें। कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में अगले 5 दिनों तक कोशिकाओं को बनाए रखें जो 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है। हर 48 घंटे में माध्यम बदलें। 5 दिनों के बाद उनकी आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
      नोट: प्रत्येक प्रेरण माध्यम को वर्णित विभिन्न अभिकर् ती के साथ पूरक किया जाता है; एसएफएम-ए: 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 1x इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस), एक्टिविन ए के 4 एनएम, सोडियम ब्यूटाइट के 1 एनएम, और बीटा-मर्केप्टोथेनॉल के 50 माइक्रोन; एसएफएम-बी: 1% बीएसए, 1x आईटीएस, और 0.3 एमएम टॉरिन; और एसएफएम सी: 1.5% बीएसए, 1x आईटीएस, 3 एमएम टॉरिन, 100 एनएम ग्लूकागन जैसे पेप्टाइड (जीएलपी) - 1, 1 एमएम निकोटिनामाइड, और 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईए) ।
    8. प्रत्येक चरण के बाद एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की जांच करना सुनिश्चित करें। कोशिकाएं अधिक एकत्रित हो जाएंगी और कालोनियों के रूप में तैरेंगी।
    9. आगे के विश्लेषण के लिए सेल कॉलोनियों को इकट्ठा करें। कॉलोनी आकृति विज्ञान और आकार के लिए जांच करें। अग्नाशय जीन मार्कर अभिव्यक्ति विश्लेषण और कार्यात्मक विश्लेषण (ग्लूकोज उत्तेजित सी-पेप्टाइड स्राव परख) करें।

2. नॉन इंटीग्रेटिव इंडक्शन प्रोटोकॉल

नोट: गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल आईपीसी को माइक्रोएनवायरमेंटल इंडक्शन अप्रोच8,9के रूप में तीन-स्टेप इंडक्शन प्रक्रिया के साथ वितरित करने के लिए रीढ़ प्रोटोकॉल है।

  1. 70%-80% की ढुलमुलता पर 3-5 एचडीपीएससी का उपयोग करें।
  2. संस्कृति माध्यम को त्यागें और 1x पीबीएस के साथ एचडीपीएससी धोएं।
  3. कोशिकाओं पर 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. ट्राइप्सिन गतिविधि को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ें और एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे कोशिकाओं को पिपेट करें। प्रत्येक संग्रह ट्यूब में कोशिकाओं और aliquot 1 x10 6 कोशिकाओं की गिनती।
    1. 468 एक्स जी (आरसीएफ), 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    2. एसएफएम-ए में गोली को फिर से खर्च करें और बीज को कम लगाव संस्कृति प्लेट (60 मिमी) पर रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं संस्कृति और 3 दिनों के लिए 5% सीओ2। उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे सेल आकृति विज्ञान की जांच करें।
    3. एसएफएम-ए निकालें, एसएफएम-बी (दिन 3) जोड़ें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के तहत अगले2दिनों के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।
    4. एसएफएम-बी को हटाएं, एसएफएम-सी (दिन 5) जोड़ें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2के तहत अगले 5 दिनों तक कोशिकाओं को बनाए रखें। एसएफएम-सी हर 48 घंटे में बदल जाता है।
      नोट: प्रत्येक प्रेरण माध्यम को वर्णित विभिन्न अभिकर् ती के साथ पूरक किया जाता है; एसएफएम-ए: 1% बीएसए, 1x आईटीएस, एक्टिविन ए के 4 एनएम, सोडियम ब्यूटारेट के 1 एनएम, और बीटा-मर्केप्टोथेनॉल के 50 माइक्रोन; एसएफएम-बी: 1% बीएसए, 1x आईटीएस, और 0.3 एमएम टॉरिन; और एसएफएम सी: 1.5% बीएसए, 1x आईटीएस, 3 एमएम टॉरिन, 100 एनएम जीएलपी-1, 1 एमएम निकोटिनामाइड और 1x एनईएए।
    5. प्रत्येक चरण के बाद और 10 दिन में उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की जांच करना सुनिश्चित करें।
      नोट: कोशिकाएं अधिक एकत्रित हो जाएंगी और कालोनियों के रूप में तैरेंगी।
    6. आगे के विश्लेषण के लिए सेल कॉलोनियों को इकट्ठा करें। कॉलोनी आकृति विज्ञान और आकार के लिए जांच करें। अग्नाशय जीन मार्कर अभिव्यक्ति विश्लेषण और कार्यात्मक विश्लेषण (ग्लूकोज उत्तेजित सी-पेप्टाइड स्राव परख) करें।

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Representative Results

इस लेख में, दोनों इंडक्शन प्रोटोकॉल के परिणामों की तुलना की गई थी। दोनों इंडक्शन प्रोटोकॉल के आरेख चित्र 2ए,सीमें दर्शाए गए हैं। दोनों प्रोटोकॉल में, मूल्यांकन एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत किया गया था, और छवियों का विश्लेषण इमेजजे के साथ किया गया था। एचडीपीएससी दोनों इंडक्शन प्रोटोकॉल में शामिल होने के पहले दिन से कॉलोनी जैसी संरचनाएं बनाने में सक्षम थे। कॉलोनी की आकृति विज्ञान गोल और घना था, और सभी उपनिवेशों ने पूरे प्रेरण अवधि(आंकड़े 2B,D) में संस्कृति जहाजों मेंमंगाई। दोनों प्रोटोकॉल की कुल कॉलोनी गिनती भी निर्धारित की गई थी; परिणाम से पता चला है कि एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल के मामले में कुल कॉलोनी गिनती गैर-एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल(चित्रा 2E)की तुलना में थोड़ी अधिक थी। हालांकि, अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था । इसके अलावा, दोनों इंडक्शन प्रोटोकॉल में कॉलोनी आकार वितरण का भी मूल्यांकन किया गया(चित्रा 2F)। हमारे परिणामों के अनुसार, एकीकृत प्रेरण पर छोटे से मध्यम आकार की उपनिवेशों का गठन किया गया था, जो कॉलोनी के अंदर परिगलित कोर को कम करने के लिए महत्वपूर्ण था।

अग्नाशय जीन मार्कर विश्लेषण हमारे हाल ही में प्रकाशन10के अनुसार आरटी-qPCR का उपयोग कर आयोजित किया गया था । इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्राइमर की सूची के बारे में जानकारी तालिका 1में शामिल है । एमआरएनए मूल्य को 18S रिबोसोमल आरएनए और 2(-Τ ΤCt)के सूत्र का उपयोग करके नियंत्रण को सामान्यीकृत करके एक सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति के रूप में प्रस्तुत किया गया था। इस अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल में आईएसएल-1, एमएएफ-ए, ग्लूट-2, इंसुलिनऔर जीएलपी-1आर (चित्रा 3)सहित देर से अग्नाशय के मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति वाली उपनिवेशों का परिणाम प्राप्त हुआ, जिसमें आईपीसीएस की ओर एचडीपीएससी के भेदभाव का सुझाव दिया गया है । इस अध्ययन में एचडीपीएससी-आईपीसी के कार्यात्मक मूल्यांकन(चित्रा 4) काभी वर्णन किया गया था। एक ग्लूकोज उत्तेजक सी-पेप्टाइड स्राव8,9 परख एक एलिसा किट का उपयोग कर नियोजित किया गया था । परिणामों से पता चला है कि एकीकृत और गैर-एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल ने ऐसी उपनिवेशों को उत्पिित किया जो सी-पेप्टाइड को स्रावित करने में सक्षम थे।

Figure 1
चित्रा 1:एमएससी के प्रति एमएससी भेदभाव का आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:आकृति विज्ञान, कुल कॉलोनी गिनती, और दो अलग-अलग प्रोटोकॉल का उपयोग करके आईपीसी का कॉलोनी आकार वितरण। आवश्यक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, पीडीएक्स 1 के अतिव्यक्तता द्वारा एकीकृत प्रोटोकॉल का आरेख, इसके बाद तीन-खड़ी इंडक्शन प्रोटोकॉल(ए)। प्रत्येक चरण में संक्रमित एचडीपीएससी की आकृति विज्ञान(बी)। बैकबोन प्रोटोकॉल(सी)के रूप में गैर-एकीकृत का आरेख। गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल(डी)का उपयोग करते हुए एचडीपीएससी-आईपीसी की आकृति विज्ञान। दो अलग-अलग प्रोटोकॉल की कुल कॉलोनी(ई)और कॉलोनी आकार वितरण(एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:दो अलग-अलग प्रोटोकॉल से प्राप्त एचडीपीएससी-आईपीसी का अग्नाशयई जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। अग्नाशय के एंडोडर्म(पीडीएक्स 1 और एनजीएन-3)(ए),अग्नाशय के आइलेट मार्कर(आईएसएल-1, एमएएफ-ए, ग्लूट-2,और इंसुलिन)(बी)और अग्नाशय से संबंधित मार्कर(जीएलपी-1आर)(सी)की एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:दो अलग-अलग प्रोटोकॉल से प्राप्त एचडीपीएससी-आईपीसी का कार्यात्मक विश्लेषण। प्रत्येक इंडक्शन प्रोटोकॉल, इंटीग्रेटिव(ए)और गैर-एकीकृत(बी)प्रोटोकॉल में सी-पेप्टाइड स्राव, ग्लूकोज-उत्तेजित सी-पेप्टाइड स्राव (जीएसएक्स) परिख द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: PDX1 ट्रांसडक्शन के बाद PDX1 mRNA विश्लेषण। एचडीपीएससी में एमओआई 20 में पीडीएक्स1 ट्रांसडक्शन के 48 घंटे के बाद पीडीएक्स1 एमआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन परिग्रहण संख्या फॉरवर्ड प्राइमर लंबाई टीएम
रिवर्स प्राइमर (बीपी) (डिग्री सेल्सियस)
पीडीएक्स-1 NM_000209.4 5' - AAGCTCACGGTGGAAAAGG - 3' 145 57.89
5' - GGCCGTGATGTACTTTTTTG - 3' 52.38
एनजीएन-3 NM_020999.3 5' - CGGTAGAAGATGACGCCT - 3' 138 59.54
5' - जीजीटीसीएक्टटीसीजीटीसीटीजीजी - 3' 60.11
आईएसएल-1 NM_002202.2 5' - टीसीसीसीटीटीजीटीजीजीजीजी - 3' 200 60.32
5' - टीटीजीसीसीजीएटीटीसीसीसीसीजीटीए - 3' 60.39
एमएएफ-ए NM_201589.3 5' - जीसीएसीसीटीसीटीग्गागा - 3' 102 59.83
5' - टीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीजी - 3' 58.74
ग्लूट-2 NM_000340.1 5' - GGTTTGTAACTTGCCTAAG - 3' 211 52.25
5' - जीसीसीटीटॉटजीकैटगैग - 3' 54.24
इन्सुलिन NM_000207.2 5' - CCGCAGCCTTTGAACCAACA - 3' 215 64.34
5' - TTCCACAATGCCCCCCCTCTGC - 3' 64.45
जीएलपी-1आर NM_002062.4 5' - टीसीजीसीटीजीएटेगागा - 3' 189 59.38
5' - टीसीएआरसीसीसीसीटीसीटीजीटीटीजी - 3' 60.25
18S NR_003286.2 5' - GTGATGCCCTTAGATGTCC - 3' 233 55.04
5' - CCATCCAAAATCGGTAGTAGC - 3' 54.86

तालिका 1: प्राइमर जानकारी।

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Discussion

एमएससी से उच्च आईपीसी उत्पादन प्राप्त करना मधुमेह चिकित्सा में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। एकीकृत प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ट्रांसडक्शन और ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं की गुणवत्ता के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की गुणवत्ता पर भरोसा करते हैं। कुछ सेल आवश्यकताओं है कि सफल लेनदेन के लिए जांच की जानी चाहिए सेल स्वास्थ्य, सेल बैंकिंग प्रबंधन सुनिश्चित कर रहे हैं, और कोशिकाओं को एक मिटोटिक रूप से सक्रिय राज्य में हैं । इसके अलावा ट्रांसड्यूडिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है । कम सफल परिवर्तन उत्तेजित कोशिकाओं की खराब व्यवहार्यता के कारण होता है12. गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल के लिए, रूपात्मक उपस्थिति और फ्लोटिंग कॉलोनियों को प्राप्त किया जाना चाहिए क्योंकि वे अग्नाशय के भेदभाव9की परिपक्वता से संबंधित हैं।

एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल के लिए तकनीक के संशोधन और समस्या निवारण के संदर्भ में, 3-5 और 70%-80% संगम में कोशिकाओं का उपयोग करके स्वस्थ और अच्छी गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सकता है, जबकि अगले चरण पर जाने से पहले प्रेरित कोशिकाओं की गुणवत्ता की नियमित रूप से जांच करके ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं की गुणवत्ता की निगरानी की जानी चाहिए। यह निष्कर्ष पिछले अध्ययन के साथ संबंध में है जिसमें उल्लेख किया गया है कि ट्रांसडक्शन की दक्षता को प्रभावित करने वाले कई कारक सेल स्वास्थ्य, कोशिका संगम और मार्ग की संख्या13पर निर्भर करते हैं। इस अध्ययन में, तीन-चरण प्रेरण प्रक्रिया के साथ गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल अभी भी सीमाओं का सामना करता है, मुख्य रूप से कॉलोनी के आकार और कॉलोनी संख्या गठन से संबंधित है। यह परिणाम हमारे पिछले अध्ययन8,9के अनुरूप है । इस समस्या को दूर करने के लिए, हम कोशिकाओं की गुणवत्ता के साथ-साथ कम लगाव संस्कृति जहाजों की गुणवत्ता की जांच करने का सुझाव देते हैं।

इस तकनीक की सीमा इंटीग्रेटिव इंडक्शन प्रोटोकॉल की जटिलता है, जो लगातार दो अलग-अलग प्लेटफार्मों के उपयोग के कारण थी। इसके अलावा, उच्च एमओआई ट्रांसडक्शन की उच्च दक्षता का संकेत नहीं देता है। लेंटीवायरस ट्रांसडक्शन का उपयोग करके इसी तरह के अध्ययन में, एक उच्च एमओआई बेहतर लेनदेन दक्षता प्राप्त नहीं कर सका। लेखक प्रोटामाइन सल्फेट14जैसे एडजुवेंट का उपयोग करने का सुझाव देते हैं । गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सीमाएं तकनीकी मुद्दों से संबंधित हैं जैसे कॉलोनी के उत्पादन और कटाई के लिए हैंडलिंग तकनीक और उत्पादित आईपीसी के अलग-अलग आकार और रूपात्मक संरचनाएं।

आवश्यक प्रतिलेखन कारक, पीडीएक्स1महत्वपूर्ण था, जिससे परिपक्वआईपीसीएस15, 16, 17,18की ओर एमएससी इंडक्शन की प्रतिबद्धता में संभावित भूमिका थी। पीडीएक्स1-अतिउपंपित एचडीपीएससी का उपयोग करके रीढ़ प्रोटोकॉल का संशोधन और उसके बाद तीन चरणों वाला प्रेरण प्रोटोकॉल मुख्य रूप से परिपक्व और कार्यात्मक आईपीसीएस19,20,21के सफल उच्च उपज उत्पादन के उद्देश्य से किया गया था। इस प्रोटोकॉल के निष्कर्षों से यह परिलक्षित होता है कि परिपक्व आईपीसी की ओर एमएससी इंडक्शन के लिए पीडीएक्स19की पूर्व-एंडोडरमिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है । रूपात्मक मूल्यांकन से पता चला है कि कम लगाव जहाजों का उपयोग करके कॉलोनियों की गैर-संलग्न 3 डी संरचना दोनों प्रोटोकॉल में प्राप्त की जा सकती है। यह संरचना अग्नाशय के भेदभाव 7 ,9, 22,23की परिपक्वता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण थी । इसके अलावा, कॉलोनी आकार मूल्यांकन के अनुसार, एकीकृत प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप कुल कॉलोनी संख्या और छोटे से मध्यम आकार के कॉलोनी उत्पादन की सकारात्मक प्रवृत्ति हुई, जो कॉलोनी के एक परिगलित कोर को रोक सकती है। इसलिए यह आगे प्रत्यारोपण7,19 ,21,24,25केलिए फायदेमंद होगा । इस प्रोटोकॉल में देर से चरण के अग्नाशय के जीन मार्कर(आईएसएल-1, एमएएफ-ए, ग्लूट-2, इंसुलिनऔर जीएलपी-1आर)का अपरेगुलेशन देखा गया । एकीकृत प्रेरण प्रोटोकॉल में देर से चरण अग्नाशय जीन मार्कर रीढ़ प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक थे । यह पता चला कि पीडीएक्स 1 के अतिव्यवजन ने अग्नाशय के जनकों की संख्या में वृद्धि की, यानी मध्य से देर से चरण अग्नाशय के विकास की प्रगति के संदर्भ में एक बेहतर परिणाम19,26,27, 28प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, आईपीसीएस के कार्य को स्पष्ट करने के लिए, एक जीएससीएस परख किया गया था। दोनों प्रोटोकॉल से उत्पादित एचडीपीएससी-आईपीसी ने कार्यात्मक रूप से सक्रिय उपनिवेशों का सुझाव देते हुए सी-पेप्टाइड का स्राव किया।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, दोनों अग्नाशय के प्रेरण प्रोटोकॉल आईपीसी इन विट्रोउत्पन्न करने में सक्षम थे। कुल कॉलोनी गिनती, छोटे से मध्यम आकार के कॉलोनी उत्पादन, और अग्नाशय मार्कर अभिव्यक्ति के संदर्भ में, एकीकृत प्रोटोकॉल आईपीसी के गठन के लिए एक लाभदायक प्रवृत्ति दिखाया, स्टेम सेल में आगे एमएससी आवेदन का समर्थन मानव और पशु चिकित्सा प्रथाओं के लिए मधुमेह उपचार7,29,30,31,३२।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एसके, डब्ल्यूआर, और क्यूडीएल को वेटनरी स्टेम सेल और बायोइंजीनियरिंग रिसर्च यूनिट, राचडाफिसेकसोम्फॉट एंडोमेंट फंड, चुलालोंग्कोर्न विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। टू और पीपी को अपनी2 शताब्दी परियोजना में चुलालोंग्कोर्न अकादमिक उन्नति द्वारा समर्थित किया गया था। सीएस को पशु चिकित्सा विज्ञान संकाय, चुलालोंग्कोर्न अकादमिक उन्नति को अपनीदूसरी शताब्दी परियोजना, पशु चिकित्सा स्टेम सेल और बायोइंजीनियरिंग रिसर्च यूनिट, राचडाफिसेकसोम्फॉट एंडोमेंट फंड, चुलालोंग्कोर्न विश्वविद्यालय और सरकारी अनुसंधान निधि में एक शोध का समर्थन करने वाले शोध द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 175 इंसुलिन उत्पादक कोशिकाएं आईपीसी अग्नाशय की वंशावली मानव दंत लुगदी स्टेम सेल एचडीपीएससी मधुमेह मेलिटस
<em>इन विट्रो</em> अग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम सेल का प्रेरण
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Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

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