Summary
Detta protokoll presenterar en jämförelse mellan två olika induktionsprotokoll för differentiering av humant dental massa stamceller (hDPSCs) mot bukspottskörteln härstamningar in vitro:integrativ protokollet och icke-integrativ protokollet. Det integrativa protokollet genererar fler insulinproducerande celler (IPC).
Abstract
Från och med år 2000 stod framgången för bukspottskörtel holme transplantation med Hjälp av Edmonton protokollet för att behandla typ I diabetes mellitus fortfarande inför vissa hinder. Dessa inkluderar det begränsade antalet cadaveric bukspottkörteln givare och långsiktig användning av immunsuppressiva. Mesenkymala stamceller (MSC) har ansetts vara en potentiell kandidat som en alternativ källa till holmeliknande cellgenerering. Våra tidigare rapporter har framgångsrikt illustrerat upprättandet av induktionsprotokoll för differentiering av humant dentalt massa stamceller (hDPSCs) till insulinproducerande celler (IPCs). Induktionseffektiviteten varierade dock kraftigt. I detta dokument visar vi jämförelsen av hDPSCs bukspottskörteln induktion effektivitet via integrativ (microenvironmental och genetisk manipulation) och icke-integrativ (microenvironmental manipulation) induktion protokoll för att leverera hDPSC-härledda IPCs (hDPSC-IPCs). Resultaten tyder på distinkt induktion effektivitet för både induktion metoder när det gäller 3-dimensionell koloni struktur, utbyte, bukspottskörteln mRNA markörer och funktionella egenskap vid multi-dosering glukos utmaning. Dessa resultat kommer att stödja det framtida inrättandet av en kliniskt tillämplig ipc och en plattform för produktion av pankreas härstamning.
Introduction
Diabetes mellitus är ett pågående globalt problem. En rapport från Internationella diabetesfederationen (IDF) uppskattade att den globala prevalensen av diabetes skulle öka från 151 miljoner år 2000 till 415 miljoner 20151,2. Den senaste epidemiologiska studien har förutspått att den uppskattade globala diabetesprevalensen kommer att öka från 451 miljoner 2017 till 693 miljoner 20451. Framgången för bukspottskörteln holme transplantation med hjälp av Edmonton protokollet visades först 2000, när det visade sig upprätthålla endogen insulinproduktion och stabilisera normoglykemiska villkoret i typ I diabetiker patienter3. Tillämpningen av Edmontonprotokollet står dock fortfarande inför ett flaskhalsproblem. Det begränsade antalet kadaver bukspottkörteldonatorer är huvudfrågan eftersom varje patient med typ I-diabetes kräver minst 2-4 holmedonatorer. Dessutom kan långvarig användning av immunsuppressiva medel orsaka livshotande biverkningar4,5. För att ta itu med detta har utvecklingen av en potentiell behandling för diabetes under det senaste decenniet främst fokuserat på generering av effektiva insulinproducerande celler (IPC) från olika källor till stamceller6.
Stamceller blev en alternativ behandling vid många sjukdomar, inklusive diabetes typ I, som orsakas av förlust av betaceller. Transplantation av börsintroduktioner är den nya lovande metoden för att kontrollera blodsocker hos dessa patienter7. Två metoder för att generera IPC, integrativa och icke-integrerande induktionsprotokoll, presenteras i den här artikeln. Induktionsprotokollet efterliknade den naturliga bukspottskörtelutvecklingsprocessen för att få de mogna och funktionella IPCs8,9.
För denna studie kännetecknades hDPSCs av flöde cytometri för MSC ytan markör detektering, multilineage differentiering potential och RT-qPCR att bestämma uttrycket av stemness egendom och proliferative gen markörer (data visas inte)8,9,10. HDPSCs inducerades mot slutgiltig endderm, bukspottskörteln endoderm, bukspottskörteln endokrina och bukspottskörteln beta-celler eller IPCs(figur 1),respektive7. För att inducera cellerna användes en trestegs induktionsmetod som ett stamnätsprotokoll. Detta protokoll kallades ett icke-integrerande protokoll. När det gäller integrativt protokoll var den väsentliga bukspottskörteln transkription faktor, PDX1, överuttryckt i hDPSCs följt av induktion av överuttryckta PDX1 i hDPSCs med hjälp av en trestegs differentiering protokoll. Skillnaden mellan icke-integrerande och integrativt protokoll är överuttryck av PDX1 i integrativt protokoll och inte i det icke-integrativa protokollet. Bukspottskörteln differentiering jämfördes mellan integrativa och icke-integrativa protokoll i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta arbete utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av Human Research Ethics Committee, Dentistry Faculty, Chulalongkorn University. Mänskliga DPSCs (hDPSCs) isolerades från humant dental massa vävnader extraheras från både premolarer och molarer på grund av visdom tänder problem. Informerat samtycke erhölls från patienterna enligt ett godkänt protokoll (HREC-DCU 2018/054).
1. Integrerande induktionsprotokoll
- Beredning av lentiviral vektor som bär PDX1
- Använd human embryonal njure (HEK) 293FT celler för viral förpackning. Odla och underhåll dessa celler i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% L-glutamin och 1% Antibiotiska-antimycotic.
- Generera PDX1-lentivirusvektorer genom samtransfektion av 10 μg var och en av förpacknings- och kuvertplasmiderna och 20 μg av den riktade genplasmiden till HEK293FT-celler med hjälp av kalciumfosfattransfection-system, t.ex. psPAX2, pMD2. G och human pWPT-PDX111. Se till att cellerna är 80-90% konfluenta under infektionstiden.
- Samla in mediet som innehåller lentivirala partiklar vid 48 och 72 timmar efter transfection.
- Filtrera det insamlade mediet genom ett filter på 0,45 μm. koncentrera virusen med ett centrifugalfilter vid 100 kDa nominell molekylviktsskärning (NMWCO).
- PDX1 överuttryck
- Använd passage 3-5 hDPSC som är 70-80% konfluenta. Prova och räkna cellerna med hjälp av en cellräknare. Frö 1 x 106 hDPSCs på en 60 mm vävnad kulturbehandlad maträtt och inkubera över natten.
- 24 timmar senare tillsätt färska viruspartiklar från steg 1.1.4 för att omvandla polybrenförbehandlade celler (4 μg/ml polybren, 30 min under 37 °C och 5 % CO2) vid önskad multiplicitet av infektion (MOI). I det här fallet är moi som används till exempel 20. Håll cellerna i cellkulturinkubatorn i 24 timmar vid 37 °C med 5 % CO2.
- Efter infektionsperioden på 24 timmar kassera det medium som innehåller viruspartiklar. Tillsätt färska odlingsmedier och fortsätt växa cellerna i 48 timmar. Alla kulturer hålls vid 37 °C och 5% CO2.
- Kontrollera den aggregerade morfologin hos de transfekterade cellerna innan du fortsätter till induktionssteget. PDX1 transduktion bekräftas genom genuttryck analys (Kompletterande figur 1).
OBS: Kontrollera cellmorfologin under ett mikroskop innan du går vidare till nästa steg. - Skörda och fortsätt till ett trestegs induktionsprotokoll (steg 1.3) som en mikromiljöinduktionsmetod.
- Induktionsprotokoll i tre steg
OBS: Trestegs induktionsprotokollet resulterade i serien av bukspottskörteln differentiering av hDPSCs till slutgiltigt endoderm, bukspottskörteln endoderm/endokrina och bukspottskörteln beta-celler/IPCs med serum-fria medium (SFM)-A, SFM-B och SFM-C, respektive.- Kassera odlingsmediet och tvätta sedan transduced-hDPSCs med 1x fosfatbuffrad lösning (PBS).
- Tillsätt 0,25% trypsin-EDTA-lösning till cellerna och inkubera i 1 min vid 37 °C, 5% CO2.
- Tillsätt odlingsmediet för att stoppa trypsinaktiviteten och spola försiktigt cellerna för att få encellsfjädringen. Räkna cellerna och alikvoten 1 x 106 celler i varje uppsamlingsrör.
- Centrifugera cellupphängningen vid 468 x g (relativ centrifugalkraft: RCF), 4 °C, i 5 minuter. Kassera supernaten och spara cellpelleten.
- Återanvänd pelleten i 3 ml första bukspottskörtelinduktionsmedium, dvs. serumfritt medium (SFM)-A. Frö cellerna på en låg fastsättningskulturplatta (60 mm). Håll cellerna vid 37 °C och 5% CO2 i 3 dagar.
OBS: Observera cellmorfologin under ett inverterat mikroskop innan du går vidare till nästa steg. - Ta bort SFM-A och tillsätt 3 ml av det andra induktionsmediet, dvs SFM-B. Håll cellerna under de kommande 2 dagarna vid 37 °C, 5 % CO2.
OBS: Observera cellmorfologin under ett inverterat mikroskop innan du går vidare till nästa steg. - Ta bort SFM-B och tillsätt 3 ml av det tredje induktionsmediet, dvs. Underhåll cellerna under de kommande 5 dagarna i en cellkulturinkubator som hålls vid 37 °C med 5% CO2. Byt medium var 48:e timme. Observera deras morfologi efter 5 dagar.
OBS: Varje induktionsmedium kompletteras med olika reagenser enligt beskrivningen; SFM-A: 1% bovint serumalbumin (BSA), 1x insulinöverföringssyre-selen (ITS), 4 nM activin A, 1 nM natrium butyrat och 50 μM beta-merkaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS och 0,3 mM taurin; och SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM glukagonliknande peptid (GLP)-1, 1 mM nikotinamid och 1x icke-essentiella aminosyror (NEAAs). - Se till att kontrollera cellmorfologin under ett inverterat mikroskop efter varje steg. Cellerna blir mer aggregerade och flyter som kolonier.
- Samla in cellkolonier för vidare analys. Kontrollera om det finns kolonimorfologi och storlek. Utför analys av genmarköruttryck i bukspottskörteln och funktionell analys (Glukosstimulerad C-peptidsekretionsanalys).
2. Icke-integrerande induktionsprotokoll
OBS: Det icke-integrativa protokollet är stamnätets protokoll för att leverera IPC:erna med trestegsinduktionsprocessen som mikromiljöinduktionsmetod8,9.
- Använd passage 3-5 hDPSCs vid 70%-80% confluency.
- Kassera odlingsmediet och tvätta hDPSCs med 1x PBS.
- Tillsätt 0,25% trypsin-EDTA-lösning på cellerna och inkubera i 1 min vid 37 °C, 5% CO2.
- Tillsätt odlingsmediet för att stoppa trypsinaktiviteten och pipetten försiktigt cellerna för att få encellsfjädringen. Räkna celler och alikvot 1 x 106 celler i varje insamlingsrör.
- Centrifugera cellfjädringen vid 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Kassera supernaten.
- Återanvänd pelleten i SFM-A och frö på en låg fastsättningskulturplatta (60 mm). Odla cellerna vid 37 °C och 5% CO2 i 3 dagar. Kontrollera cellmorfologin under ett inverterat mikroskop.
- Ta bort SFM-A, tillsätt SFM-B (dag 3) och behåll sedan cellerna under de kommande 2 dagarna under 37 °C, 5 % CO2.
- Ta bort SFM-B, tillsätt SFM-C (dag 5) och behåll sedan cellerna under de kommande 5 dagarna under 37 °C, 5 % CO2. SFM-C ändras var 48:e timme.
OBS: Varje induktionsmedium kompletteras med olika reagenser enligt beskrivningen; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM aktivin A, 1 nM natrium butyrat och 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS och 0,3 mM taurin; och SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM nikotinamid och 1x NEAAs. - Se till att kontrollera cellmorfologin under det inverterade mikroskopet efter varje steg och på dag 10.
OBS: Cellerna blir mer aggregerade och flyter som kolonier. - Samla in cellkolonier för vidare analys. Kontrollera om det finns kolonimorfologi och storlek. Utför analys av genmarköruttryck i bukspottskörteln och funktionell analys (Glukosstimulerad C-peptidsekretionsanalys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den här artikeln jämfördes resultaten av båda induktionsprotokollen. Diagrammen för båda induktionsprotokollen illustreras i figur 2A, C. I båda protokollen utfördes utvärderingen under ett ljusmikroskop, och bilder analyserades med ImageJ. hDPSCs kunde bilda koloni-liknande strukturer från den första dagen av induktion i båda induktion protokoll. Kolonins morfologi var rund och tät, och alla kolonier flöt i kulturkärlen under hela induktionsperioden (Figur 2B,D). Det totala antalet kolonier i båda protokollen fastställdes också. Resultatet visade att det totala antalet kolonier vid integrativt induktionsprotokoll var något högre jämfört med det icke-integrativa induktionsprotokollet (figur 2E). Skillnaden var dock inte statistiskt signifikant. Dessutom utvärderades fördelningen av kolonistorleken i båda induktionsprotokollen (figur 2F). Enligt våra resultat bildades små till medelstora kolonier på den integrativa induktionen, vilket var viktigt för att minska den nekrotiska kärnan inuti kolonin.
Bukspottskörteln genmarkör analys utfördes med RT-qPCR enligt vår senaste publikation10. Information om listan över primers som används i denna studie finns i tabell 1. MRNA-värdet presenterades som ett relativt mRNA-uttryck genom normaliserat till 18S ribosomal RNA och kontrollen med formeln 2(-ΔΔCt). Resultaten av denna studie visade att det integrativa induktionsprotokollet gav kolonier med högt uttryck för sena bukspottskörtelmarkörer, inklusive ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINoch GLP-1R (Figur 3), vilket tyder på differentiering av hDPSCs mot börsintroduktioner. Den funktionella utvärderingen av hDPSC-IPC beskrevs också (figur 4) i denna studie. En glukosstimulerande C-peptidutsöndring 8,9 analys användes med hjälp av en ELISA kit. Resultaten visade att de integrativa och icke-integrativa induktionsprotokollen gav kolonier som kunde utsöndra C-peptid.
Bild 1: Diagram över MSC-differentiering mot IPC. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2:Morfologi, totalt antal kolonier och fördelningen av kolonistorlek för IPC:er med hjälp av två olika protokoll. Diagram över det integrativa protokollet genom överuttryck av essentiell transkriptionsfaktor, PDX1, följt av tre brant induktionsprotokoll (A). Morfologi av transfected hDPSCs i varje steg av induktion (B). Diagram över icke-integrativa som stamnätsprotokoll (C). Morfologi hos hDPSC-IPC med hjälp av det icke-integrativa protokollet (D). Total koloni (E) och kolonistorleksfördelning(F) av två olika protokoll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Analys av bukspottskörtelns genuttryck av hDPSC-IPC som erhållits från två olika protokoll. MRNA uttryck för bukspottskörteln endoderm (PDX1 och NGN-3) (A), bukspottskörteln holme markörer(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, och INSULIN)(B), och bukspottskörteln-relaterade markör (GLP-1R) (C) analyserades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Funktionell analys av hDPSC-IPC som erhållits från två olika protokoll. C-peptid utsöndring i varje induktion protokoll, integrativ (A) och icke-integrativ (B) protokoll, bestämdes av en glukosstimulerad C-peptid utsöndring (GSCS) analys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: PDX1 mRNA-analys efter PDX1-transduktion. PDX1 mRNA uttryck analys efter 48 h PDX1 transduktion vid MOI 20 i hDPSCs visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Gener | Anslutningsnummer | Framåt Primer | Längd | Tm | |
| Omvänd primer | bp) I artikel 3.1 skall | (°C) | |||
| PDX-1 (pdx-1) | NM_000209,4 | 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAAGG – 3' | 145 | 57.89 | |
| 5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' | 52.38 | ||||
| NGN-3 (NGN-3) | NM_020999,3 | 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 (på 1) | NM_002202,2 | 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' | 200 | 60.32 | |
| 5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' | 60.39 | ||||
| MAF-A (MAF-A) | NM_201589,3 | 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' | 102 | 59.83 | |
| 5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' | 58.74 | ||||
| GLUT-2 (GLUT-2) | NM_000340,1 | 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' | 211 | 52.25 | |
| 5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' | 54.24 | ||||
| INSULIN | NM_000207,2 | 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' | 215 | 64.34 | |
| 5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062,4 | 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' | 189 | 59.38 | |
| 5' – TCACTCCCGCTCTGTGTTTG – 3' | 60.25 | ||||
| 18S | NR_003286,2 | 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' | 233 | 55.04 | |
| 5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' | 54.86 | ||||
Tabell 1: Primerinformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att uppnå högre IPC-produktion från MSC spelar en viktig roll i diabetesbehandling. De kritiska stegen i det integrativa protokollet är beroende av kvaliteten på de celler som ska användas för transduktion och kvaliteten på transduced celler. Vissa cellkrav som bör kontrolleras för framgångsrik transduktion säkerställer cellhälsa, cellbankhantering och celler är i ett mitotiskt aktivt tillstånd. Vidare spelar övervakning av livskraften hos transduced celler också en viktig roll. Mindre framgångsrik transduktion orsakas av den dåliga livskraften hos de stimulerade cellerna12. För de icke-integrativa protokollen bör morfologiska utseende och flytande kolonier uppnås eftersom de är relaterade till mognaden av bukspottskörtel differentiering9.
När det gäller modifiering och felsökning av tekniken för det integrativa induktionsprotokollet kan friska och högkvalitativa celler erhållas genom att använda celler i passagerna 3-5 och 70%-80% sammanflöde, medan kvaliteten på transduceda celler bör övervakas genom att rutinmässigt kontrollera kvaliteten på de stimulerade cellerna innan du går vidare till nästa steg. Detta konstaterande är i samband med en tidigare studie som nämnde att flera faktorer som påverkar effektiviteten av transduktionen är beroende av cellhälsa, cellkonfluens och antalet passager13. I denna studie står det icke-integrativa protokollet med en trestegs induktionsprocess fortfarande inför begränsningar, främst när det gäller kolonins storlek och koloninummerbildning. Detta resultat överensstämmer med vår tidigare studie8,9. För att övervinna detta problem föreslår vi att du kontrollerar cellernas kvalitet samt kvaliteten på de låga fästkulturkärlen.
Begränsningen av denna teknik är komplexiteten i det integrativa induktionsprotokollet, som berodde på användningen av två olika plattformar i följd. Dessutom innebär den högre moi inte högre verkningsgrad för transduktion. I en liknande studie med lentivirustransduktion kunde en högre MOI inte uppnå bättre transduktionseffektivitet. Författarna föreslår att använda en adjuvant såsom protamin sulfat14. Begränsningarna med att använda de icke-integrerande protokollen är relaterade till tekniska frågor, såsom hanteringstekniken för produktion och skörd av kolonin och olika storlekar och morfologiska strukturer hos de producerade börsintroduktionerna.
Den väsentliga transkriptionsfaktorn, PDX1, var betydande och hade därmed en potentiell roll i engagemanget för MSC-induktion mot de mognabörsintroduktionerna 15,16,17,18. Ändringen av stamnätsprotokollet med hjälp av PDX1-överuttryckta hDPSCs följt av ett trestegs induktionsprotokoll syftade främst till framgångsrik high-yield produktion av mogna och funktionella IPCs19,20,21. Resultaten av detta protokoll återspeglade att MSC induktion mot mogna IPCs krävs pre-endodermic uttryck av PDX19. Den morfologiska utvärderingen visade att den icke-bifogade 3D-strukturen hos kolonier kunde erhållas i båda protokollen med hjälp av fartyg med låg fastsättning. Denna struktur var viktig för att uppnå mognad av bukspottskörtel differentiering7,9,22,23. Dessutom, enligt kolonistorleksutvärdering, resulterade det integrativa protokollet i en positiv trend av totalt koloninummer och liten till medelstor koloniproduktion, vilket kan förhindra en nekrotisk kärna av kolonin. Därför kommer det att vara fördelaktigt för ytterligaretransplantation 7,19,21,24,25. Uppreglering av sena bukspottskörteln gen markörer(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULIN, och GLP-1R)observerades i detta protokoll. De sena bukspottskörteln gen markörer i integrativ induktion protokollet var högre jämfört med ryggraden protokollet. Det avslöjades att överuttryck av PDX1 ökade antalet bukspottskörteln stamceller, dvs ett bättre resultat när det gäller utvecklingen av mid- till late-stage bukspottskörteln utveckling kunde uppnås19,26,27,28. För att klargöra funktionen hos börsintroduktioner utfördes dessutom en GSCS-analys. hDPSC-IPCs produceras från båda protokoll utsöndrade C-peptid, vilket tyder på funktionellt aktiva kolonier.
För att sammanfatta de framtida tillämpningarna av tekniken som används i denna studie kunde båda induktionsprotokollen för bukspottskörteln generera IPC in vitro. När det gäller det totala antalet kolonier, små till medelstora koloniproduktion och bukspottskörtelmarköruttryck visade det integrativa protokollet en fördelaktig trend för IPC-bildning, vilket stöder ytterligare MSC-tillämpning i stamcellsbaserade diabetesbehandlingar för mänsklig ochveterinärpraxis 7,29,30,31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
SK, WR och QDL stöddes av veterinary stem cell and bioengineering research unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO och PP stöddes av Chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project. CS stöddes av ett forskningsstödjande anslag från fakulteten för veterinärvetenskap, Chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University och Government Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care.
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B.
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
