Summary
このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を インビトロの膵臓系統に対して分化するための2つの異なる誘導プロトコル(統合プロトコルと非統合プロトコル)の比較を示す。統合プロトコルは、より多くのインスリン産生細胞(IPC)を生成する。
Abstract
2000年現在、エドモントンプロトコルを使用して膵島移植の成功は、I型糖尿病を治療するために依然としていくつかの障害に直面しています。これらには、限られた数の死体膵臓ドナーおよび免疫抑制剤の長期使用が含まれる。間葉系幹細胞(MCs)は、イレット様細胞生成の代替源として有力候補と考えられてきました。これまでの報告では、ヒトの歯髄幹細胞(hPPC)をインスリン産生細胞(IPC)に分化するための誘導プロトコルの確立を図示しています。しかし、誘導効率は大きく変化した。本論文では、hDPSC由来IPC(hDPSC-IPC)を提供するための統合(微小環境・遺伝子操作)と非統合(微小環境操作)誘導プロトコルによるhDPSC膵インダクション効率の比較を示す。この結果は、3次元コロニー構造、収率、膵mRNAマーカー、および多用量グルコースチャレンジ時の機能的特性の点で、誘導アプローチの両方に対して明確な誘導効率を示唆している。これらの知見は、臨床的に適用可能なIPCおよび膵臓系統生産プラットフォームの将来の確立を支援する。
Introduction
糖尿病は世界的な懸念事項です。国際糖尿病連盟(IDF)の報告書によると、糖尿病の世界的な罹患率は、2000年の1億5,100万人から2015年には4億1500万人に増加すると推定されています。最新の疫学ベースの研究では、推定された世界的な糖尿病の罹患率は、2017年の4億5,100万人から2045年には6億9,300万人に増加すると予測されています。エドモントン議定書を用いた膵島移植の成功は、2000年に初めて実証され、内因性インスリン産生を維持し、I型糖尿病患者3のノルモ血糖状態を安定化することが示された。しかし、Edmonton プロトコルの適用は依然としてボトルネックの問題に直面しています。I型糖尿病の各患者には少なくとも2〜4人の膵島ドナーが必要であるため、限られた数のカダダブリック膵臓ドナーが主な問題です。さらに、免疫抑制剤の長期使用は生命を脅かす副作用4,5を引き起こす可能性がある。これに対処するために、過去10年間の糖尿病に対する潜在的な治療法の開発は、主に幹細胞の様々な供給源からの有効なインスリン産生細胞(IPC)の生成に焦点を当ててきた6。
幹細胞は、β細胞の喪失によって引き起こされる糖尿病I型を含む多くの疾患で代替治療となりました。IPCの移植は、これらの患者の血糖を制御するための新しい有望な方法である7.IPC を生成する 2 つのアプローチ、統合的な誘導プロトコルと非統合的な誘導プロトコルは、この記事で紹介します。誘導プロトコルは、成熟した機能的なIPC8、9を得るために自然膵の発達プロセスを模倣した。
本研究では、hDPCRは、MSC表面マーカー検出のためのフローサイトメトリー、多系統分化電位、およびRT-qPCRにより、ステムネス特性および増殖性遺伝子マーカーの発現を決定することを特徴とする(データは示さない)8、9、10。hDDPCは、決定的な内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓内分泌物、および膵臓β細胞またはIPC(図1)に誘導された(図1)、それぞれ7。細胞を誘導するために、3段階誘導アプローチをバックボーンプロトコルとして用いた。このプロトコルは非統合型プロトコルと呼ばれます。統合型プロトコルの場合、必須の膵転写因子PDX1は、hDDPCsで過剰発現し、続いて3段階分化プロトコルを用いてhDDPSCsで過発現PDX1誘導を行った。非統合型プロトコルと統合型プロトコルの違いは、非統合型プロトコルではなく、統合型プロトコルにおけるPDX1の過剰表現です。膵分化は、本研究における統合的プロトコルと非統合的プロトコルの間で比較された。
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Protocol
この作業は、ヘルシンキ宣言に従って行われ、チュラロンコン大学歯学部人間研究倫理委員会によって承認されました。ヒトDPC(hDDP)は、親知らずの問題により小臼歯と大臼歯の両方から抽出されたヒトの歯髄組織から分離された。インフォームド・コンセントは、承認されたプロトコル(HREC-DCU 2018/054)の下で患者から得られました。
1. 統合誘導プロトコル
- PDX1を担持するレンチウイルスベクターの調製
- ウイルス包装のためにヒト胚性腎臓(HEK)293FT細胞を使用する。10%のウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%抗生物質抗ミコティックを添加したダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)でこれらの細胞を培養し、維持する。
- PDX1-レンチウイルスベクターを、それぞれ10μgの包装およびエンベローププラスミドと20μgの共トランスフェクションにより、リン酸カルシウムトランスフェクションシステムを用いてHEK293FT細胞に、例えばpsPAX2、pMD2を用いて生成する。G、およびヒトpWPT-PDX111.感染時に細胞が80%-90%コンフルエントであることを確認してください。
- トランスフェクション後48時間および72時間でレンチウイルス粒子を含む培地を採取する。
- 収集した培地を0.45 μmのフィルターでフィルターします。100 kDa 公称分子量カットオフ(NMWCO)で遠心フィルターでウイルスを濃縮します。
- PDX1 過剰表現
- 70-80%コンフルエントである通路3-5 hDPSCを使用してください。トリプシン化し、セルカウンターを使用してセルを数えます。種子1 x 106 hDPCを60mm組織培養処理皿に入れ、一晩インキュベートします。
- 24時間後、ステップ1.1.4から得られた新鮮なウイルス粒子を加えて、ポリブレン前処理細胞(4μg/mLポリブレン、30分下30°C、5%CO2)を所望の感染多重度(MOI)に加える。例えば、この場合、MOI は 20 です。細胞培養インキュベーター内の細胞を、5%CO2で37°Cで24時間維持する。
- 24時間の感染期間後、ウイルス粒子を含む培地を廃棄する。新鮮な培養培地を加え、細胞を48時間増殖させ続けます。すべての培養物は、37°Cおよび5%CO2で維持される。
- 誘導ステップに進む前に、トランスフェクトされた細胞の凝集された形態を確認してください。PDX1の導入は遺伝子発現解析によって確認される(補足図1)。
メモ:次の手順に進む前に、顕微鏡で細胞の形態を確認してください。 - 微小環境誘導アプローチとして3段階誘導プロトコル(ステップ1.3)を収穫し、進む。
- 三段階誘導プロトコル
注:3段階誘導プロトコルは、hDDPCの膵臓分化のシリーズをもたらしましたが、それぞれ無血清培地(SFM)-A、SFM-B、SFM-Cを使用して、hPDPCの一連の分化が決定的な内胚葉、膵臓内胚葉/内分泌、膵臓β細胞/IPCに決定されました。- 培養液を廃棄し、次いで、1倍のリン酸緩衝溶液(PBS)でトランスデューセドhDDPCを洗浄する。
- 0.25%のトリプシン-EDTA溶液を細胞に加え、37°C、5%CO2で1分間インキュベートする。
- トリプシン活性を停止し、細胞を穏やかに洗い流して単一細胞懸濁液を得るために培養培地を加える。各収集管に細胞とアリコート1 x 106 細胞をカウントします。
- 468 x g で細胞懸濁液を遠心分離し(相対遠心力:RCF)、4°C、5分間用いた。上清を捨てて、細胞ペレットを保存します。
- ペレットを第1膵インダクション培地の3mL、すなわち、無血清培地(SFM)-A.低付着培養プレート(60mm)上に細胞を播種する。37°C、5%CO2で3日間セルを維持します。
注: 次のステップに進む前に、細胞の形態を反転した顕微鏡で観察してください。 - SFM-Aを取り外し、第2誘導媒体、すなわちSFM-Bの3mLを加える。次の2日間、37°C、5%CO2でセルを維持します。
注: 次のステップに進む前に、細胞の形態を反転した顕微鏡で観察してください。 - SFM-Bを取り外し、第3誘導媒体、すなわちSFM-Cの3mLを加える。5%CO2で37°Cで維持した細胞培養インキュベーターで、次の5日間細胞を維持する。48時間ごとに培地を交換します。5日後にそれらの形態を観察する。
注:各誘導媒体は、記載されているように異なる試薬で補充されます。SFM-A:1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1xインスリントランスフェリンセレン(ITS)、アクチビンAの4 nM、ブチレートナトリウム1nM、およびβ-メルカプトエタノール50 μM;SFM-B:1%BSA、1x ITS、および0.3 mMタウリン;SFM C:1.5%BSA、1x ITS、3 mMタウリン、グルカゴン様ペプチド(GLP)-1の100 nM、1mMニコチンアミド、および1x非必須アミノ酸(NEAA)。 - 各ステップの後に、反転した顕微鏡の下で細胞の形態を確認してください。細胞はより凝集し、コロニーとして浮かぶでしょう。
- さらなる分析のために細胞コロニーを収集します。コロニーの形態と大きさを確認します。膵臓遺伝子マーカー発現解析および機能解析(グルコース刺激Cペプチド分泌アッセイ)を行う。
2. 非統合誘導プロトコル
注: 非統合型プロトコルは、IFC をマイクロ環境誘導アプローチ8,9 として 3 段階誘導プロセスで提供するためのバックボーン プロトコルです。
- 70%~80%のコンフルで3~5 hDDPを使用してください。
- 培養培地を廃棄し、1x PBSでhDPCを洗浄します。
- 0.25%のトリプシン-EDTA溶液を細胞に加え、37°C、5%CO2で1分間インキュベートする。
- トリプシン活性を停止し、細胞を穏やかにピペット化する培養培地を加えて、単一細胞懸濁液を得た。各採取管に細胞及びアリコート1x106細胞を数える。
- 468 x g (RCF) で細胞懸濁液を遠心分離し、 4 °C, 5 分.上清を捨てます。
- SFM-Aのペレットを再懸濁し、低い取り付け培養プレート(60mm)にシードします。37°Cで細胞を5%CO2で3日間培養した。逆顕微鏡で細胞の形態を確認します。
- SFM-Aを取り除き、SFM-B(3日目)を追加し、37°C、5%CO2の下で次の2日間セルを維持します。
- SFM-Bを取り除き、SFM-C(5日目)を加え、37°C、5%CO2の下で次の5日間セルを維持します。SFM-Cは48時間ごとに変更されます。
注:各誘導媒体は、記載されているように異なる試薬で補充されます。SFM-A:1%BSA、1x ITS、4 nMのアクチビンA、1 nMの乳酸ナトリウム、および50μMのβ-メルカプトエタノール;SFM-B:1%BSA、1x ITS、および0.3 mMタウリン;SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM タウリン, 100 nM GLP-1, 1 mM ニコチンアミド, および 1x NEAA. - 各ステップの後、10日目に反転した顕微鏡の下で細胞形態を確認してください。
注:細胞はより集約され、コロニーとして浮かぶでしょう。 - さらなる分析のために細胞コロニーを収集します。コロニーの形態と大きさを確認します。膵臓遺伝子マーカー発現解析および機能解析(グルコース刺激Cペプチド分泌アッセイ)を行う。
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Representative Results
本稿では、両方の誘導プロトコルの結果を比較した。両方の誘導プロトコルの図を図 2A、Cに示します。両プロトコルにおいて、評価を光顕微鏡で行い、画像をImageJで解析した。hDDPは、両方の誘導プロトコルで誘導の最初の日からコロニー様の構造を形成することができた。コロニーの形態は丸く、密集しており、すべてのコロニーは誘導期間を通して培養容器に浮かんでいた(図2B、D)。両方のプロトコルのコロニー数の合計も決定されました。その結果、統合誘導プロトコルの場合のコロニー総カウントが非統合誘導プロトコルと比べてわずかに高いことが示された(図2E)。しかし、その差は統計的に有意ではなかった。さらに、両方の誘導プロトコルにおけるコロニーサイズ分布も評価した(図2F)。我々の結果によると、コロニー内の壊死コアを減らすために重要であった統合誘導時に中小コロニーが形成された。
膵臓遺伝子マーカー解析は、最近の刊行物10に従ってRT-qPCRを用いて行った。本研究で使用したプライマーのリストに関する情報は、表1に記載されています。mRNA値を、18SリボソームRNAに正規化して2の式を用いて対照を行うことにより、相対mRNA発現として提示した。本研究の結果、統合誘導プロトコルは、ISL-1、MAF-A、GLUT-2、インスリン、GLP-1R(図3)を含む膵臓後期マーカーの高発現を有するコロニーを生み出し、HPPCのIPCに対する分化を示唆した。 hDPSC-IPCの機能評価もこの研究で説明した(図4)。ELISAキットを用いてグルコース刺激Cペプチド分泌8,9アッセイを採用した。その結果、統合的および非統合的誘導プロトコルが、Cペプチドを分泌できるコロニーを生み出した。
図2:2つの異なるプロトコルを用いたIPCの形態、コロニー数の合計、コロニーサイズ分布 必須転写因子 PDX1 の過剰発現による統合プロトコルの図、続いて3急な誘導プロトコル(A)が続く。誘導の各ステップにおけるトランスフェクトhDDPの形態論(B)バックボーンプロトコルとしての非統合の図 (C)非統合プロトコルを用いたhDPSC-IPCの形態論(D)2つの異なるプロトコルのコロニー(E)とコロニーサイズ分布(F)の合計。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2つの異なるプロトコルから得られたhDPSC-IPCの膵臓遺伝子発現解析膵臓内胚葉(PDX1およびNGN-3)(A)、膵島マーカー(ISL-1、MAF-A、GLUT-2、インスリン)(B)および膵臓関連マーカー(GLP-1R)(C)のmRNA発現を解析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 2つの異なるプロトコルから得られたhDPSC-IPCの機能解析 各誘導プロトコルにおけるCペプチド分泌は、統合型(A)および非統合型(B)プロトコル、グルコース刺激Cペプチド分泌(GSCS)アッセイによって決定した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:PDX1導入後のPDX1 mRNA分析HDPCにおけるMOI20におけるPDX1導入の48時間後のPDX1 mRNA発現解析が示されている。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | 加盟番号 | フォワードプライマー | 長さ | Tm | |
| リバースプライマー | (bp) | (°C) | |||
| PDX-1 | NM_000209.4 | 5' – AAGCTCACGCGTGGAAGG – 3' | 145 | 57.89 | |
| 5' – GGCCGTGAGATGTクトクトクトGtTG – 3' | 52.38 | ||||
| NGN-3 | NM_020999.3 | 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' - GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 | NM_002202.2 | 5' – TCCCTATGTGtTGGTGCGG - 3' | 200 | 60.32 | |
| 5' – TTGGCGCATTGATCCCGTA – 3' | 60.39 | ||||
| MAF-A | NM_201589.3 | 5' – GCACATCTGGAGAGGaggaga – 3' | 102 | 59.83 | |
| 5' – TTCTCCTTG TACAGGCCCCCCG – 3' | 58.74 | ||||
| グルト2 | NM_000340.1 | 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' | 211 | 52.25 | |
| 5' – GCCTAGTTAGCATGCAG – 3' | 54.24 | ||||
| インスリン | NM_000207.2 | 5' – CCGCAGCTGtGAACCAACA – 3' | 215 | 64.34 | |
| 5' – TTCCACAATGCCACTCtCTGC – 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062.4 | 5' – TCGCTGTガートガガ – 3' | 189 | 59.38 | |
| 5' – TCACTCCCGCGtGTGtTTG – 3' | 60.25 | ||||
| 18S | NR_003286.2 | 5' – GTGATCCCタガットGTCC – 3' | 233 | 55.04 | |
| 5' – CCATCAGGタグタグタグ – 3' | 54.86 | ||||
表1:プライマー情報
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Discussion
MSCからのIPC産生の向上は、糖尿病治療において重要な役割を果たします。統合プロトコルの重要なステップは、トランスダクションに使用される細胞の品質とトランスデュース細胞の品質に依存します。正常な伝達をチェックする必要があるセル要件のいくつかは、細胞の健全性、細胞バンキング管理、および細胞が有糸分裂的に活性な状態であることを保証することです。また、細胞の導入可能性をモニタリングすることも重要な役割を果たす。あまり成功しなかった伝達は、刺激された細胞12の生存率が悪い場合に引き起こされる。非統合的なプロトコルでは、形態学的外観と浮遊コロニーは膵分化9の成熟に関連しているので達成されるべきである。
統合誘導プロトコルの修正とトラブルシューティングの観点から、正常で良質な細胞は、次のステップに進む前に刺激された細胞の品質を定期的にチェックすることによって、3-5および70%-80%合流の通路で細胞を使用することによって得ることができる。この知見は、伝達の効率に影響を与えるいくつかの要因が細胞の健康状態、細胞合流、および通過数13に依存すると述べた以前の研究と相関している。本研究では、3段階誘導プロセスを伴う非統合的なプロトコルは、主にコロニーサイズとコロニー数形成に関する限界に直面している。この結果は、以前の研究8,9と一致しています。この問題を克服するために、細胞の品質と低い愛着培養容器の品質を確認することをお勧めします。
この技術の限界は、2つの異なる連続したプラットフォームの使用による統合誘導プロトコルの複雑さです。さらに、高いMOIは、高い伝達の効率を意味するものではありません。レンチウイルスの導入を用いた同様の研究では、より高いMOIはより良いトランスダクション効率を達成できませんでした。著者らは、プロタミン硫酸塩14などのアジュバントを使用することをお勧めします。非統合的なプロトコルを使用する制限は、コロニーの生産と収穫のための取り扱い技術、および生産されたIPCの様々なサイズおよび形態学的構造などの技術的な問題に関連しています。
必須転写因子PDX1は重要であり、それによって成熟したIPC15、16、17、18に向けたMSC誘導のコミットメントにおいて潜在的な役割を有する。PDX1-過剰発現hDDPCsを用いた後に3段階誘導プロトコルを用いたバックボーンプロトコルの改変は、主に成熟した機能的なIPC19、20、21の高収率生産を成功させることを目的とした。このプロトコルの知見は、成熟したIPCへのMSC誘導にはPDX19の予め内皮的発現が必要であることを反映した。形態学的評価は、コロニーの非結合3D構造が低い付着容器を使用することによって両方のプロトコルで得ることができることを示した。この構造は、膵分化7、9、22、23の成熟を達成するために重要であった。さらに、コロニーサイズ評価によれば、統合プロトコルはコロニー総数と中小コロニー生産の肯定的な傾向をもたらし、コロニーの壊死的なコアを防ぐことができる。したがって、さらに移植7、19、21、24、25に有益です。後期膵臓遺伝子マーカー(ISL-1、MAF-A、GLUT-2、インスリン、およびGLP-1R)のアップレギュレーションは、このプロトコルで観察された。 統合誘導プロトコルにおける後期膵臓遺伝子マーカーは、バックボーンプロトコルと比較して高かった。PDX1の過剰発現は膵臓前駆物質の数を増加させた、すなわち、中期から後期の膵臓の進行の点でより良い結果が19、26、27、28に達成され得ることを明らかにした。さらに、IPCの機能を明らかにするために、GSCSアッセイを行った。両プロトコルから生成されたhDPSC-IPCはCペプチドを分泌し、機能的に活性なコロニーを示唆した。
この研究で使用される技術の将来の用途を要約すると、両方の膵インダクションプロトコルがインビトロでIPCを生成することができた。コロニー総個数、中小コロニー生産、および膵臓マーカー発現に関しては、統合プロトコルはIPC形成に有益な傾向を示し、ヒトおよび獣医の実践に対する幹細胞ベースの糖尿病治療におけるMSCの適用を7、29、30、31、32に対して支持した。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
SK、WR、QDLは、チュラロンコン大学ラチャダフィセコンプロフメント基金の獣医幹細胞およびバイオエンジニアリング研究ユニットによって支援されました。TOとPPは、チュラロンコーン学術振興によって2世紀 プロジェクトに支援されました。CSは、2世紀 プロジェクト、獣医幹細胞およびバイオエンジニアリング研究ユニット、ラチャダフィセコンフォト基金、チュラロンコーン大学、政府研究基金への獣医学部の助成金を支援する研究によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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