Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

Abstract

Vanaf 2000 werd het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol voor de behandeling van diabetes mellitus type I nog steeds geconfronteerd met enkele obstakels. Deze omvatten het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren en het langdurig gebruik van immunosuppressiva. Mesenchymale stamcellen (MSC's) worden beschouwd als een potentiële kandidaat als een alternatieve bron van eilandjesachtige celgeneratie. Onze vorige rapporten hebben met succes de vaststelling van inductieprotocollen geïllustreerd voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) tot insulineproducerende cellen (IPC's). De inductie-efficiëntie varieerde echter sterk. In dit artikel demonstreren we de vergelijking van hDPSC's pancreasinductie-efficiëntie via integratieve (micro-environmentale en genetische manipulatie) en niet-integratieve (micro-environmentale manipulatie) inductieprotocollen voor het leveren van hDPSC-afgeleide IPCs (hDPSC-IPCs). De resultaten suggereren een duidelijke inductie-efficiëntie voor zowel de inductiebenaderingen in termen van 3-dimensionale koloniestructuur, opbrengst, pancreas mRNA-markers en functionele eigenschap bij multidoseringsglucose-uitdaging. Deze bevindingen zullen de toekomstige oprichting van een klinisch toepasbaar IPCs- en pancreaslijnproductieplatform ondersteunen.

Introduction

Diabetes mellitus is een voortdurende wereldwijde zorg. Een rapport van de International Diabetes Federation (IDF) schatte dat de wereldwijde prevalentie van diabetes zou toenemen van 151 miljoen in 2000 tot 415 miljoen in 20151,2. De meest recente epidemiologische studie heeft voorspeld dat de geschatte wereldwijde prevalentie van diabetes zal toenemen van 451 miljoen in 2017 tot 693 miljoen in 20451. Het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol werd voor het eerst aangetoond in 2000, toen werd aangetoond dat het de endogene insulineproductie handhaafde en de normoglycemische toestand stabiliseerde bij type I diabetespatiënten3. De toepassing van het Edmonton-protocol kampt echter nog steeds met een knelpuntprobleem. Het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren is het belangrijkste probleem, omdat elke patiënt met type I diabetes ten minste 2-4 eilandjesdonoren nodig heeft. Bovendien kan het langdurig gebruik van immunosuppressiva levensbedreigende bijwerkingen veroorzaken4,5. Om dit aan te pakken, heeft de ontwikkeling van een potentiële therapie voor diabetes in het afgelopen decennium zich voornamelijk gericht op de generatie van effectieve insulineproducerende cellen (IPC's) uit verschillende bronnen van stamcellen6.

Stamcellen werden een alternatieve behandeling bij veel ziekten, waaronder diabetes type I, die wordt veroorzaakt door het verlies van bètacellen. Transplantatie van IPC's is de nieuwe veelbelovende methode voor het beheersen van de bloedglucose bij deze patiënten7. In dit artikel worden twee benaderingen gepresenteerd voor het genereren van IPC's, integratieve en niet-integratieve inductieprotocollen. Het inductieprotocol bootste het natuurlijke pancreasontwikkelingsproces na om de gerijpte en functionele IPC's8,9te krijgen .

Voor deze studie werden hDPSC's gekenmerkt door flowcytometrie voor MSC-oppervlaktemarkerdetectie, multilineagedifferentiatiepotentieel en RT-qPCR om de expressie van stamheidseigenschap en proliferatieve genmarkers te bepalen (gegevens niet getoond)8,9,10. hDPSC 's werden geïnduceerd in de richting van definitief endoderm, pancreasendoderm, pancreas-endocriene en pancreas bètacellen of IPC's (figuur 1), respectievelijk7. Om de cellen te induceren, werd een inductiebenadering in drie stappen gebruikt als een backbone-protocol. Dit protocol werd een niet-integratief protocol genoemd. In het geval van integratief protocol werd de essentiële pancreastranscriptiefactor, PDX1, overexpressie in hDPSC's gevolgd door de inductie van overexpressie PDX1 in hDPSC's met behulp van een differentiatieprotocol in drie stappen. Het verschil tussen niet-integratief en integratief protocol is de overexpressie van PDX1 in het integratieve protocol en niet in het niet-integratieve protocol. De pancreasdifferentiatie werd in deze studie vergeleken tussen de integratieve en niet-integratieve protocollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee, Faculteit Tandheelkunde, Chulalongkorn University. Menselijke DPC's (hDPSCs) werden geïsoleerd uit menselijke tandpulpweefsels die werden geëxtraheerd uit zowel premolaren als kiezen als gevolg van problemen met verstandskiezen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten volgens een goedgekeurd protocol (HREC-DCU 2018/054).

1. Integratief inductieprotocol

  1. Voorbereiding van lentiviral vector die PDX1 draagt
    1. Gebruik humane embryonale nier (HEK) 293FT cellen voor virale verpakking. Kweek en onderhoud deze cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% Antibiotic-Antimycoticum.
    2. Genereer PDX1-lentivirusvectoren door co-transfectie van 10 μg elk van de verpakking en envelopplasmiden en 20 μg van het beoogde genplasmide in HEK293FT-cellen met behulp van calciumfosfaattransfectiesysteem, bijvoorbeeld psPAX2, pMD2. G, en menselijke pWPT-PDX111. Zorg ervoor dat de cellen 80%-90% samenvloeien tijdens de tijd van infectie.
    3. Verzamel het medium dat lentivirale deeltjes bevat op 48 en 72 uur na transfectie.
    4. Filtreer het verzamelde medium door een filter van 0,45 μm; concentreer de virussen met een centrifugaalfilter bij 100 kDa nominale moleculaire gewichtsafsnijding (NMWCO).
  2. PDX1 overexpressie
    1. Gebruik passage 3-5 hDPSC die 70-80% samenvloeiend zijn. Probeer de cellen te verkleinen en te tellen met behulp van een celteller. Zaai 1 x 106 hDPSC's op een met weefselkweek behandelde schaal van 60 mm en incubeer 's nachts.
    2. Voeg 24 uur later verse virusdeeltjes toe die zijn verkregen uit stap 1.1.4 om voorbehandelde cellen van polybreen (4 μg/ml polybreen, 30 min onder 37 °C en 5% CO2)bij de gewenste vermenigvuldigende infectie (MOI) over te brengen. In dit geval is MOI bijvoorbeeld 20. Houd de cellen in de celkweek-incubator gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
    3. Gooi na de infectieperiode van 24 uur het medium met virale deeltjes weg. Voeg verse kweekmedia toe en blijf de cellen 48 uur laten groeien. Alle culturen worden onderhouden op 37 °C en 5% CO2.
    4. Controleer de geaggregeerde morfologie van de getransfecteerde cellen voordat u doorgaat naar de inductiestap. PDX1-transductie wordt bevestigd door genexpressieanalyse (Aanvullende figuur 1).
      OPMERKING: Controleer de celmorfologie onder een microscoop voordat u doorgaat met de volgende stappen.
    5. Oogst en ga verder met een inductieprotocol in drie stappen (stap 1.3) als een micromilieu-inductiebenadering.
  3. Inductieprotocol in drie stappen
    OPMERKING: Het inductieprotocol in drie stappen resulteerde in de reeks pancreasdifferentiatie van hDPSC's naar respectievelijk definitief endoderm, pancreasendoderm/endocriene en pancreas bètacellen/IPC's met behulp van serumvrij medium (SFM)-A, SFM-B en SFM-C.
    1. Gooi het kweekmedium weg en was vervolgens de transduceerde hDPSC's met 1x fosfaatgebufferde oplossing (PBS).
    2. Voeg 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C, 5% CO2.
    3. Voeg het kweekmedium toe om de trypsineactiviteit te stoppen en spoel de cellen voorzichtig door om de suspensie met één cel te krijgen. Tel de cellen en aliquot 1 x 106 cellen in elke verzamelbuis.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 468 x g (relatieve centrifugaalkracht: RCF), 4 °C, gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en bewaar de celkorrel.
    5. Resuspendeer de pellet in 3 ml van het eerste pancreasinductiemedium, d.w.z. serumvrij medium (SFM)-A. Zaai de cellen op een cultuurplaat met lage aanhechting (60 mm). Houd de cellen 3 dagen op 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Observeer de morfologie van cellen onder een omgekeerde microscoop voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    6. Verwijder SFM-A en voeg 3 ml van het tweede inductiemedium toe, d.w.z. SFM-B. Houd de cellen de komende 2 dagen op 37 °C, 5% CO2.
      OPMERKING: Observeer de morfologie van cellen onder een omgekeerde microscoop voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    7. Verwijder SFM-B en voeg 3 ml van het derde inductiemedium toe, d.w.z. SFM-C. Houd de cellen de komende 5 dagen in een celkweek-incubator die op 37 °C wordt gehouden met 5% CO2. Verander het medium om de 48 uur. Observeer hun morfologie na 5 dagen.
      OPMERKING: Elk inductiemedium wordt aangevuld met verschillende reagentia zoals beschreven; SFM-A: 1% runderserumalbumine (BSA), 1x insuline-transferrine-selenium (ITS), 4 nM activine A, 1 nM natrium butyraat en 50 μM bèta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS en 0,3 mM taurine; en SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurine, 100 nM glucagon-achtig peptide (GLP)-1, 1 mM nicotinamide en 1x niet-essentiële aminozuren (NEAAs).
    8. Zorg ervoor dat u de celmorfologie na elke stap onder een omgekeerde microscoop controleert. De cellen zullen meer geaggregeerd worden en als kolonies drijven.
    9. Verzamel celkolonies voor verdere analyse. Controleer op koloniemorfologie en grootte. Uitvoeren van pancreas gen marker expressie analyse en functionele analyse (Glucose gestimuleerdE C-peptide secretie test).

2. Niet-integratief inductieprotocol

OPMERKING: Het niet-integratieve protocol is het backbone-protocol voor het leveren van de IPC 's met het inductieproces in drie stappen als een micromilieu-inductiebenadering8,9.

  1. Gebruik passage 3-5 hDPSCs bij 70%-80% samenvloeiing.
  2. Gooi het kweekmedium weg en was hDPSC's met 1x PBS.
  3. Voeg 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Voeg het kweekmedium toe om de trypsineactiviteit te stoppen en pipetteer de cellen voorzichtig om de suspensie met één cel te verkrijgen. Tel cellen en aliquot 1 x 106 cellen in elke verzamelbuis.
    1. Centrifugeer de celsuspensie bij 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Gooi het supernatant weg.
    2. Resuspend de pellet in SFM-A en zaad op een lage bevestigingscultuurplaat (60 mm). Kweek de cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Controleer de celmorfologie onder een omgekeerde microscoop.
    3. Verwijder SFM-A, voeg SFM-B (dag 3) toe en houd de cellen vervolgens de komende 2 dagen onder 37 °C, 5% CO2.
    4. Verwijder SFM-B, voeg SFM-C (dag 5) toe en houd de cellen vervolgens de komende 5 dagen onder 37 °C, 5% CO2. SFM-C wordt elke 48 uur vervangen.
      OPMERKING: Elk inductiemedium wordt aangevuld met verschillende reagentia zoals beschreven; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM activine A, 1 nM natrium butyraat en 50 μM bèta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS en 0,3 mM taurine; en SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurine, 100 nM GLP-1, 1 mM nicotinamide en 1x NEAAs.
    5. Zorg ervoor dat u de celmorfologie na elke stap en op dag 10 onder de omgekeerde microscoop controleert.
      OPMERKING: De cellen worden meer geaggregeerd en drijven als kolonies.
    6. Verzamel celkolonies voor verdere analyse. Controleer op koloniemorfologie en grootte. Uitvoeren van pancreas gen marker expressie analyse en functionele analyse (Glucose gestimuleerdE C-peptide secretie test).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit artikel werden de resultaten van beide inductieprotocollen vergeleken. De diagrammen van beide inductieprotocollen zijn geïllustreerd in figuur 2A,C. In beide protocollen werd de evaluatie uitgevoerd onder een lichtmicroscoop en werden beelden geanalyseerd met ImageJ. hDPSCs waren in staat om kolonie-achtige structuren te vormen vanaf de eerste dag van inductie in beide inductieprotocollen. De morfologie van de kolonie was rond en dicht, en alle kolonies dreven in de cultuurvaten gedurende de inductieperiode (Figuren 2B, D). De totale kolonietelling van beide protocollen werd ook bepaald; het resultaat toonde aan dat het totale aantal kolonies in het geval van integratief inductieprotocol iets hoger was in vergelijking met het niet-integratieve inductieprotocol (figuur 2E). Het verschil was echter niet statistisch significant. Bovendien werd ook de verdeling van de koloniegrootte in beide inductieprotocollen geëvalueerd (figuur 2F). Volgens onze resultaten werden kleine tot middelgrote kolonies gevormd na de integratieve inductie, wat belangrijk was voor het verminderen van de necrotische kern in de kolonie.

Pancreas genmarker analyse werd uitgevoerd met behulp van RT-qPCR volgens onze recente publicatie10. Informatie over de lijst van primers die in deze studie worden gebruikt , is opgenomen in tabel 1. De mRNA-waarde werd gepresenteerd als een relatieve mRNA-expressie door genormaliseerd tot 18S ribosomale RNA en de regeling met behulp van de formule van 2(-ΔΔCt). De resultaten van deze studie toonden aan dat het integratieve inductieprotocol kolonies opleverde met een hoge expressie van late pancreasmarkers, waaronder ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINen GLP-1R (figuur 3), wat wijst op de differentiatie van hDPSC's naar IPC's. De functionele evaluatie van hDPSC-IPC's werd ook beschreven (figuur 4) in deze studie. Een glucose-stimulerende C-peptide secretie8,9 test werd gebruikt met behulp van een ELISA kit. De resultaten toonden aan dat de integratieve en niet-integratieve inductieprotocollen kolonies opleverden die C-peptide konden afscheiden.

Figure 1
Figuur 1: Diagram van MSC differentiatie naar IPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Morfologie, totale kolonietelling en koloniegrootteverdeling van IPC's met behulp van twee verschillende protocollen. Diagram van het integratieve protocol door overexpressie van essentiële transcriptiefactor, PDX1, gevolgd door drie steil inductieprotocol (A). Morfologie van getransfecteerde hDPSC's in elke inductiestap (B). Diagram van niet-integratief als backbone protocol (C). Morfologie van hDPSC-IPC's met behulp van het niet-integratieve protocol (D). Totale kolonie (E) en koloniegrootteverdeling (F) van twee verschillende protocollen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Pancreas genexpressie analyse van hDPSC-IPCs verkregen uit twee verschillende protocollen. De mRNA-expressie van pancreasendoderm (PDX1 en NGN-3) (A), pancreas eilandjesmarkers (ISL-1, MAF-A, GLUT-2en INSULINE) (B) en pancreasgerelateerde marker (GLP-1R) (C) werd geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Functionele analyse van hDPSC-IPC's verkregen uit twee verschillende protocollen. C-peptide secretie in elk inductieprotocol, integratieve (A) en niet-integratieve (B) protocollen, werden bepaald door een glucose-gestimuleerde C-peptide secretie (GSCS) test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: PDX1 mRNA-analyse na PDX1-transductie. PDX1 mRNA expressie analyse na 48 uur PDX1 transductie bij MOI 20 in hDPSCs wordt getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Genen Toetredingsnummer Voorwaartse primer Lengte Tm
Omgekeerde primer (bp) (°C)
PDX-1 NM_000209,4 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999,3 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
GLUT-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
INSULINE NM_000207,2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062,4 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTCTGTGTTTG – 3' 60.25
18S NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' 54.86

Tabel 1: Primer informatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het bereiken van een hogere IPC-productie van MSC's speelt een essentiële rol in diabetestherapie. De kritische stappen van het integratieve protocol zijn afhankelijk van de kwaliteit van cellen die moeten worden gebruikt voor de transductie en de kwaliteit van transducte cellen. Sommige celvereisten die moeten worden gecontroleerd op succesvolle transductie, zorgen voor celgezondheid, celbankbeheer en cellen bevinden zich in een mitotically actieve toestand. Verder speelt het monitoren van de levensvatbaarheid van transduceerde cellen ook een belangrijke rol. Minder succesvolle transductie wordt veroorzaakt door de slechte levensvatbaarheid van de gestimuleerde cellen12. Voor de niet-integratieve protocollen moeten het morfologische uiterlijk en drijvende kolonies worden bereikt omdat ze verband houden met de rijping van pancreasdifferentiatie9.

In termen van modificatie en probleemoplossing van de techniek voor het integratieve inductieprotocol kunnen gezonde en kwalitatief goede cellen worden verkregen door cellen te gebruiken in passages 3-5 en 70%-80% samenvloeiing, terwijl de kwaliteit van transducte cellen moet worden gecontroleerd door routinematig de kwaliteit van de gestimuleerde cellen te controleren voordat u doorgaat naar de volgende stap. Deze bevinding is in correlatie met een eerdere studie die vermeldde dat verschillende factoren die de efficiëntie van de transductie beïnvloeden, afhankelijk zijn van celgezondheid, celconfluentie en het aantal passages13. In deze studie heeft het niet-integratieve protocol met een inductieproces in drie stappen nog steeds beperkingen, voornamelijk met betrekking tot de koloniegrootte en kolonienummervorming. Dit resultaat komt overeen met onze vorige studie8,9. Om dit probleem op te lossen, raden we aan om de kwaliteit van de cellen en de kwaliteit van de lage hechtingscultuurvaten te controleren.

De beperking van deze techniek is de complexiteit van het integratieve inductieprotocol, dat te wijten was aan het gebruik van twee verschillende opeenvolgende platforms. Bovendien impliceert de hogere MOI geen hogere efficiëntie van transductie. In een vergelijkbare studie met lentivirustransductie kon een hogere MOI geen betere transductie-efficiëntie bereiken. De auteurs stellen voor om een adjuvans zoals protaminesulfaat14 tegebruiken. De beperkingen van het gebruik van de niet-integratieve protocollen houden verband met technische kwesties zoals de behandelingstechnieken voor de productie en oogst van de kolonie en verschillende groottes en morfologische structuren van de geproduceerde IPC's.

De essentiële transcriptiefactor, PDX1, was significant en speelde daarmee een potentiële rol in de inzet van MSC-inductie ten aanzien van de volwassen IPC 's15,16,17,18. De wijziging van het backbone-protocol met behulp van PDX1-overexpressed hDPSCs , gevolgd door een inductieprotocol in drie stappen , was voornamelijk gericht op de succesvolle productie met een hoog rendement van volwassen en functionele IPC 's19,20,21. De bevindingen van dit protocol weerspiegelden dat de MSC-inductie naar volwassen IPC 's pre-endodermische expressie van PDX19vereiste . De morfologische evaluatie toonde aan dat de niet-gekoppelde 3D-structuur van kolonies in beide protocollen kon worden verkregen met behulp van vaten met een laag aanhechtingsvat. Deze structuur was belangrijk voor het bereiken van de rijping van pancreasdifferentiatie7,9,22,23. Bovendien resulteerde het integratieve protocol volgens de evaluatie van de koloniegrootte in een positieve trend van het totale kolonieaantal en de productie van kleine tot middelgrote kolonies, wat een necrotische kern van de kolonie kan voorkomen. Daarom zal het gunstig zijn voor verderetransplantatie 7,19,21,24,25. De upregulatie van laat stadium pancreasgenmarkers (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINEen GLP-1R) werd in dit protocol waargenomen. De late pancreasgenmarkers in het integratieve inductieprotocol waren hoger in vergelijking met het backbone-protocol. Er werd onthuld dat de overexpressie van PDX1 het aantal pancreasvoorlopers verhoogde, d.w.z. dat een beter resultaat in termen van de progressie van de ontwikkeling van de pancreas in het midden tot laat stadium kon worden bereikt19,26,27,28. Om de functie van IPC's te verduidelijken, werd bovendien een SGRS-test uitgevoerd. hDPSC-IPCs geproduceerd uit beide protocollen uitgescheiden C-peptide, wat de functioneel actieve kolonies suggereert.

Om de toekomstige toepassingen van de in deze studie gebruikte techniek samen te vatten, waren beide pancreasinductieprotocollen in staat om de IPC's in vitrote genereren . In termen van het totale aantal kolonies, de productie van kleine tot middelgrote kolonies en de expressie van pancreasmarkers vertoonde het integratieve protocol een gunstige trend voor IPC-vorming, ter ondersteuning van verdere MSC-toepassing in stamcelgebaseerde diabetesbehandelingen voor menselijke en veterinaire praktijken7,29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

SK, WR en QDL werden ondersteund door de Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO en PP werden ondersteund door Chulalongkorn Academic Advancement in Its 2nd Century Project. CS werd ondersteund door een onderzoeksondersteunende subsidie van de Faculteit Diergeneeskunde, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University en Government Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Tags

Bioengineering insulineproducerende cellen IPC's pancreaslijnen menselijke tandheelkundige pulpstamcellen hDPSCs diabetes mellitus
<em>In vitro</em> Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter