Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

Abstract

A partir de 2000, o sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas usando o protocolo de Edmonton para tratar diabetes mellitus tipo I ainda enfrentou alguns obstáculos. Estes incluem o número limitado de doadores cadavéricos do pâncreas e o uso a longo prazo de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido consideradas como um candidato em potencial como uma fonte alternativa de geração celular semelhante a ilhotas. Nossos relatórios anteriores ilustraram com sucesso o estabelecimento de protocolos de indução para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em células produtoras de insulina (IPCs). No entanto, a eficiência da indução variou muito. Neste artigo, demonstramos a comparação da eficiência da indução pancreática do HDPSCs por meio de protocolos integrativos (manipulação microambiental e genética) e não integrativos (manipulação microambiental) para a entrega de IPCs derivados do HDPSC (hDPSC-IPCs). Os resultados sugerem uma eficiência de indução distinta tanto para as abordagens de indução em termos de estrutura de colônia tridimensional, rendimento, marcadores de mRNA pancreático e propriedade funcional no desafio de glicose multidosagem. Esses achados apoiarão o futuro estabelecimento de um IPC clinicamente aplicável e uma plataforma de produção de linhagem pancreática.

Introduction

Diabetes mellitus é uma preocupação global em curso. Um relatório da Federação Internacional de Diabetes (IDF) estimou que a prevalência global de diabetes aumentaria de 151 milhões em 2000 para 415 milhões em 20151,2. O último estudo baseado em epidemiologia previu que a prevalência estimada mundial de diabetes aumentará de 451 milhões em 2017 para 693 milhões em 20451. O sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas utilizando o protocolo de Edmonton foi demonstrado pela primeira vez em 2000, quando foi demonstrado manter a produção endógena da insulina e estabilizar a condição normóglicêica em pacientes diabéticos tipo I3. No entanto, a aplicação do protocolo de Edmonton ainda enfrenta um problema de gargalo. O número limitado de doadores de pâncreas cadavérico é o principal problema, uma vez que cada paciente com diabetes tipo I requer pelo menos 2-4 doadores de ilhotas. Além disso, o uso a longo prazo de agentes imunossupressores pode causar efeitos colaterais fatais4,5. Para lidar com isso, o desenvolvimento de uma potencial terapia para diabetes na última década tem focado principalmente na geração de células eficazes produtoras de insulina (IPCs) de várias fontes de células-tronco6.

As células-tronco tornaram-se um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo o diabetes tipo I, que é causado pela perda de células beta. O transplante de IPCs é o novo método promissor para o controle da glicemia nesses pacientes7. Neste artigo, estão apresentadas duas abordagens para geração de IPCs, protocolos integrativos e não integrativos de indução. O protocolo de indução imitou o processo natural de desenvolvimento pancreático para obter os IPCs amadurecidos e funcionais8,9.

Para este estudo, os hDPSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para detecção de marcadores de superfície MSC, potencial de diferenciação de multilineagem e RT-qPCR para determinar a expressão da propriedade stemness e marcadores genéticos proliferativos (dados não mostrados)8,9,10. hDPSCs foram induzidos em direção ao endoderme definitivo, endóderme pancreático, endócrina pancreática e células beta pancreáticas ou IPCs(Figura 1), respectivamente7. Para induzir as células, uma abordagem de indução de três etapas foi usada como protocolo de espinha dorsal. Este protocolo foi chamado de protocolo não integrativo. No caso do protocolo integrativo, o fator essencial de transcrição pancreática, PDX1,foi superexpresso em hDPSCs seguido pela indução de PDX1 superexpresso em hDPSCs utilizando um protocolo de diferenciação de três etapas. A diferença entre protocolo não integrativo e integrativo é a superexpressão do PDX1 no protocolo integrativo e não no protocolo não integrativo. A diferenciação pancreática foi comparada entre os protocolos integrativos e não integrativos deste estudo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana, Faculdade de Odontologia da Universidade chulalongkorn. Os DPSCs humanos (hDPSCs) foram isolados de tecidos de polpa dentária humana extraídos tanto de pré-molares quanto de molares devido a problemas de dentes do siso. O consentimento informado foi obtido dos pacientes sob protocolo aprovado (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocolo de indução integrativa

  1. Preparação do vetor lentiviral que carrega PDX1
    1. Use células de rim embrionário humano (HEK) 293FT para embalagem viral. Cultura e manutenção dessas células no Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina e 1% Antibiótico-Antimycotic.
    2. Gerar vetores PDX1-lentivírus por co-transfecção de 10 μg cada uma das embalagens e plasmídeos de envelope e 20 μg do plasmídeo genético alvo em células HEK293FT usando sistema de transfecção fosfato de cálcio, por exemplo, psPAX2, pMD2. G, e humano pWPT-PDX111. Certifique-se de que as células são 80%-90% confluentes durante o tempo de infecção.
    3. Colete o meio contendo partículas lentivirais em 48 e 72 h após a transfecção.
    4. Filtrar o meio coletado através de um filtro de 0,45 μm; concentrar os vírus com um filtro centrífuga a 100 kDa nominais de peso molecular (NMWCO).
  2. Superexpressão PDX1
    1. Use a passagem 3-5 hDPSC que seja 70-80% confluente. Tentepsinizar e contar as células usando um contador de células. Semente 1 x 106 hDPSCs em um prato tratado de cultura de tecido de 60 mm e incubar durante a noite.
    2. 24 h depois, adicione partículas de vírus frescos obtidas da etapa 1.1.4 para transduzir células pré-tratadas de polibreno (4 μg/mL de polibrene, 30 min abaixo de 37 °C e 5% de CO2) na multiplicidade desejada de infecção (MOI). Por exemplo, neste caso, o MOI usado é 20. Manter as células na incubadora de cultura celular por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
    3. Após o período de infecção de 24 horas, descarte o meio contendo partículas virais. Adicione novas mídias culturais e continue crescendo as células por 48 h. Todas as culturas são mantidas a 37 °C e 5% de CO2.
    4. Verifique a morfologia agregada das células transfeinadas antes de prosseguir para a etapa de indução. A transdução PDX1 é confirmada pela análise de expressão genética(Figura Suplementar 1).
      NOTA: Verifique a morfologia celular sob um microscópio antes de prosseguir para os próximos passos.
    5. Colher e proceder a um protocolo de indução de três etapas (etapa 1.3) como uma abordagem de indução microambiental.
  3. Protocolo de indução de três etapas
    NOTA: O protocolo de indução de três etapas resultou na série de diferenciação pancreática de hDPSCs para endoderme definitivo, endoderme/endócrina pancreática e beta-células/IPCs pancreáticos usando meio sem soro (SFM)-A, SFM-B e SFM-C, respectivamente.
    1. Descarte o meio de cultura e, em seguida, lave os fdpscs transduturados com solução tamponada de fosfato 1x (PBS).
    2. Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA às células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% de CO2.
    3. Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e lave suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte as células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo coletor.
    4. Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (Força Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, por 5 min. Descarte o supernatante e salve a pelota da célula.
    5. Resuspenque a pelota em 3 mL do primeiro meio de indução pancreática, ou seja, meio sem soro (SFM)-A. Semente as células em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Mantenha as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias.
      NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.
    6. Remova o SFM-A e adicione 3 mL do segundo meio de indução, ou seja, SFM-B. Mantenha as células pelos próximos 2 dias a 37 °C, 5% DE CO2.
      NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.
    7. Remova o SFM-B e adicione 3 mL do terceiro meio de indução, ou seja, SFM-C. Manter as células pelos próximos 5 dias em uma incubadora de cultura celular mantida a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 horas. Observe sua morfologia depois de 5 dias.
      NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% de albumina de soro bovino (BSA), 1x insulina-transferrina-selênio (ITS), 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de peptídeo semelhante a glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamida e 1x aminoácidos não essenciais (NEAAs).
    8. Certifique-se de verificar a morfologia celular sob um microscópio invertido após cada passo. As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.
    9. Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).

2. Protocolo de indução não integrativo

NOTA: O protocolo não integrativo é o protocolo backbone para a entrega dos IPCs com o processo de indução de três etapas como abordagem de indução microambiental8,9.

  1. Use a passagem 3-5 hDPSCs a 70%-80% de confluência.
  2. Descarte o meio de cultura e lave os hDPSCs com 1x PBS.
  3. Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA nas células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% DE CO2.
  4. Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e pipeta suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo de coleta.
    1. Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Descarte o supernatante.
    2. Resuspend a pelota em SFM-A e semente em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Cultume as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias. Verifique a morfologia celular sob um microscópio invertido.
    3. Remova o SFM-A, adicione SFM-B (Dia 3) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 2 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2.
    4. Remova o SFM-B, adicione SFM-C (Dia 5) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 5 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2. O SFM-C é alterado a cada 48 horas.
      NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida e 1x NEAAs.
    5. Certifique-se de verificar a morfologia celular sob o microscópio invertido após cada passo e no dia 10.
      NOTA: As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.
    6. Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neste artigo, foram comparados os resultados de ambos os protocolos de indução. Os diagramas de ambos os protocolos de indução são ilustrados na Figura 2A,C. Em ambos os protocolos, a avaliação foi realizada sob um microscópio leve, e as imagens foram analisadas com ImageJ. hDPSCs foram capazes de formar estruturas semelhantes a colônias a partir do primeiro dia de indução em ambos os protocolos de indução. A morfologia da colônia era redonda e densa, e todas as colônias flutuavam nos vasos culturais durante todo o período de indução (Figuras 2B,D). A contagem total de colônias de ambos os protocolos também foi determinada; o resultado mostrou que a contagem total de colônias no caso do protocolo de indução integrativa foi ligeiramente maior em relação ao protocolo de indução não integrativa(Figura 2E). No entanto, a diferença não foi estatisticamente significante. Além disso, também foi avaliada a distribuição do tamanho da colônia em ambos os protocolos de indução (Figura 2F). De acordo com nossos resultados, colônias de pequeno a médio porte foram formadas após a indução integrativa, que foi importante para a redução do núcleo necrosado dentro da colônia.

A análise do marcador genético pancreático foi realizada utilizando-se o RT-qPCR de acordo com nossa recentepublicação 10. As informações sobre a lista de primers utilizadas neste estudo estão incluídas na Tabela 1. O valor mRNA foi apresentado como uma expressão relativa de mRNA por normalizado para RNA ribossômico 18S e o controle utilizando a fórmula de 2(-ΔΔCt). Os resultados deste estudo revelaram que o protocolo de indução integrativa rendeu colônias com alta expressão de marcadores pancreáticos tardios, incluindo ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAe GLP-1R (Figura 3),sugerindo a diferenciação dos HDPSCs em relação aos IPCs. Também foi descrita a avaliação funcional dos IPCs do HDPSC-IPCs (Figura 4) neste estudo. Uma secreção de C-peptídeo estimulante de glicose8,9 ensaio foi empregado utilizando um kit ELISA. Os resultados mostraram que os protocolos integrativos e não integrativos de indução produziram colônias capazes de segregar c-peptídeos.

Figure 1
Figura 1: Diagrama da diferenciação do MSC em relação aos IPCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfologia, contagem total de colônias e distribuição do tamanho da colônia de IPCs usando dois protocolos diferentes. Diagrama do protocolo integrativo por superexpressão do fator de transcrição essencial, PDX1, seguido pelo protocolo de indução de trêsíngremes (A). Morfologia dos hDPSCs transfectados em cada etapa de indução (B). Diagrama de não integrativo como protocolo backbone(C). Morfologia de hDPSC-IPCs utilizando o protocolo não integrativo(D). Colônia total(E)e distribuição de tamanho de colônia(F)de dois protocolos diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise da expressão genética pancreática dos IPCs hDPSC-IPCs obtidos a partir de dois protocolos diferentes. A expressão mRNA de endoderme pancreático(PDX1 e NGN-3),marcadores de ilhotas pancreáticas(ISL-1, MAF-A, GLUT-2e INSULINA)(B)e marcador relacionado ao pâncreas(GLP-1R)(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise funcional de hDPSC-IPCs obtidos a partir de dois protocolos diferentes. A secreção de c-peptídeos em cada protocolo de indução, protocolos integrativos (A) e não integrativos(B),foram determinadas por um ensaio de secreção C-peptídeo estimulado por glicose (GSCS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise PDX1 mRNA após transdução PDX1. A análise de expressão PDX1 mRNA após 48 h de transdução PDX1 no MOI 20 em hDPSCs é mostrada. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Genes Número de adesão Primer avançado Comprimento Tm
Primer reverso (bp) (°C)
PDX-1 NM_000209.4 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999.3 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
GLUT-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
INSULINA NM_000207.2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062.4 5' – TCGCTGAAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTGTGTTTG – 3' 60.25
18S NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' 54.86

Tabela 1: Informações do primer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alcançar maior produção de IPCs de MSCs desempenha um papel essencial na terapia do diabetes. As etapas críticas do protocolo integrativo dependem da qualidade das células a serem utilizadas para a transdução e a qualidade das células transduzidas. Alguns requisitos celulares que devem ser verificados para uma transdução bem-sucedida estão garantindo a saúde celular, o gerenciamento de bancos celulares e as células estão em um estado mitoticamente ativo. Além disso, o monitoramento da viabilidade das células transduzidas também desempenha um papel importante. A transdução menos bem sucedida é causada pela baixa viabilidade das células estimuladas12. Para os protocolos não integrativos, a aparência morfológica e as colônias flutuantes devem ser alcançadas porque estão relacionadas ao amadurecimento da diferenciação pancreática9.

Em termos de modificação e solução de problemas da técnica para o protocolo de indução integrativa, células saudáveis e de boa qualidade podem ser obtidas utilizando células nas passagens 3-5 e 70%-80% de confluência, enquanto a qualidade das células transduzidas deve ser monitorada verificando rotineiramente a qualidade das células estimuladas antes de passar para o próximo passo. Esse achado está em correlação com um estudo anterior que mencionou que vários fatores que influenciam a eficiência da transdução dependem da saúde celular, da confluência celular e do número de passagens13. Neste estudo, o protocolo não integrativo com um processo de indução de três etapas ainda enfrenta limitações, principalmente no que diz respeito ao tamanho da colônia e à formação de números de colônias. Este resultado é consistente com nosso estudo anterior8,9. Para superar esse problema, sugerimos verificar a qualidade das células, bem como a qualidade dos vasos de cultura de baixa fixação.

A limitação dessa técnica é a complexidade do protocolo de indução integrativa, que se deveu ao uso de duas plataformas consecutivas diferentes. Além disso, o MOI superior não implica maior eficiência da transdução. Em um estudo semelhante usando transdução de lentivírus, um MOI mais elevado não poderia alcançar melhor eficiência de transdução. Os autores sugerem o uso de um adjuvante como sulfato de protamina14. As limitações do uso dos protocolos não integrativos estão relacionadas a questões técnicas como as técnicas de manuseio e colheita da colônia e tamanhos variados e estruturas morfológicas dos IPCs produzidos.

O fator de transcrição essencial, PDX1,foi significativo, tendo assim um papel potencial no compromisso da indução do MSC para com os IPCs maduros15,16,17,18. A modificação do protocolo backbone usando hDPSCs superexpressos PDX1,seguido de um protocolo de indução de três etapas, foi voltada principalmente para a produção bem-sucedida de alta produtividade de IPCs maduros e funcionais19,20,21. Os achados deste protocolo refletiram que a indução do MSC para IPCs maduros exigia expressão pré-endodêmica do PDX19. A avaliação morfológica mostrou que a estrutura 3D não anexada das colônias poderia ser obtida em ambos os protocolos por meio de vasos de baixa fixação. Essa estrutura foi importante para alcançar o amadurecimento da diferenciação pancreática7,9,22,23. Além disso, segundo avaliação do tamanho da colônia, o protocolo integrativo resultou em uma tendência positiva do número total de colônias e da produção de colônias de pequeno e médio porte, o que pode impedir um núcleo necrosado da colônia. Portanto, será benéfico para o transplante adicional7,19,21,24,25. A regulação dos marcadores genéticos pancreáticos em estágio final (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAe GLP-1R) foi observada neste protocolo. Os marcadores genéticos pancreáticos em estágio final no protocolo de indução integrativa foram maiores em comparação com o protocolo backbone. Foi revelado que a superexpressão do PDX1 aumentou o número de progenitores pancreáticos, ou seja, um melhor resultado em termos de progressão do desenvolvimento pancreático de médio para final poderia ser alcançado19,26,27,28. Além disso, para esclarecer a função dos IPCs, foi realizado um ensaio GSCS. hDPSC-IPCs produzidos a partir de ambos os protocolos secretaram C-peptídeo, sugerindo as colônias funcionalmente ativas.

Para resumir as aplicações futuras da técnica utilizada neste estudo, ambos os protocolos de indução pancreática foram capazes de gerar os IPCs in vitro. Em termos da contagem total de colônias, produção de colônias de pequeno a médio porte e expressão de marcadores pancreáticos, o protocolo integrativo mostrou tendência benéfica para a formação de IPC, apoiando a aplicação adicional de MSC em tratamentos de diabetes baseados em células-tronco para práticas humanas e veterinárias7,29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

SK, WR e QDL foram apoiados pela Unidade veterinária de pesquisa de células-tronco e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP foram apoiados pelo Avanço Acadêmico de Chulalongkorn em seu projeto do séculoII. CS foi apoiado por uma pesquisa apoiando a bolsa da Faculdade de Ciência Veterinária, o Avanço Acadêmico chulalongkorn em seu projeto do século2, unidade de pesquisa de células-tronco veterinárias e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Tags

Bioengenharia Edição 175 células produtoras de insulina IPCs linhagens pancreáticas células-tronco de polpa dentária humana hDPSCs diabetes mellitus
<em>In vitro</em> Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter