Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

Abstract

2000 yılı itibariyle, tip I diabetes mellitus tedavisinde Edmonton protokolünü kullanarak pankreas adacık naklinin başarısı hala bazı engellerle karşı karşıya kaldı. Bunlar arasında sınırlı sayıda kadavra pankreas bağışçısı ve immünsüpresanların uzun süreli kullanımı saydır. Mezenkimal kök hücreler (MSC' ler) adacık benzeri hücre neslinin alternatif bir kaynağı olarak potansiyel bir aday olarak kabul edilmiştir. Önceki raporlarımız, insan diş hamuru kök hücrelerini (hDC'ler) insülin üreten hücrelere (IPC' ler) ayırt etmek için indüksiyon protokollerinin oluşturulmasını başarıyla ortaya koymuştur. Bununla birlikte, indüksiyon verimliliği büyük ölçüde değişti. Bu yazıda, hDPSC türevli IPC'ler (hDPSC-IPC'ler) sunmak için bütünleştirici (mikroçevresel ve genetik manipülasyon) ve bütünleştirici olmayan (mikroçevronmental manipülasyon) indüksiyon protokolleri yoluyla hDPSC'lerin pankreas indüksiyon verimliliğinin karşılaştırılması gösterilmiştir. Sonuçlar, 3 boyutlu koloni yapısı, verim, pankreas mRNA belirteçleri ve çok dozajlı glikoz zorluğu üzerine fonksiyonel özellik açısından hem indüksiyon yaklaşımları için belirgin indüksiyon verimliliği göstermektedir. Bu bulgular, klinik olarak uygulanabilir bir IPC'lerin ve pankreas soy üretim platformunun gelecekteki kurulmasını destekleyecektir.

Introduction

Diabetes mellitus devam eden küresel bir endişe kaynağıdır. Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) raporunda, diyabetin küresel prevalansının 2000 yılında 151 milyondan 2015 yılında 415 milyona yükseleceği tahmin edilmektedir1,2. Epidemiyoloji temelli en son çalışma, dünya çapında tahmini diyabet prevalansının 2017'de 451 milyondan 2045'te 693 milyona yükseleceğini öngörtü1. Edmonton protokolü kullanılarak pankreas adacık naklinin başarısı ilk olarak 2000 yılında, tip I diyabetik hastalarda endojen insülin üretiminin sürdürülmesi ve normoglisemik durumun stabilize edildiği gösterildiğinde gösterilmiştir3. Ancak, Edmonton protokolünün uygulanması hala bir darboğaz sorunuyla karşı karşıyadır. Tip I diyabetli her hasta en az 2-4 adacık bağışçısı gerektirdiğinden, kadavra pankreas donörlerinin sınırlı sayıda olması ana konudur. Ayrıca, immünsüpresif ajanların uzun süreli kullanımı hayatı tehdit eden yan etkilere neden olabilir4,5. Bunu ele almak için, son on yılda diyabet için potansiyel bir tedavinin geliştirilmesi, esas olarak çeşitli kök hücre kaynaklarından etkili insülin üreten hücrelerin (IPC' ler) üretimine odaklanmıştır6.

Kök hücreler, beta hücrelerinin kaybından kaynaklanan diyabet tipi I de dahil olmak üzere birçok hastalıkta alternatif bir tedavi haline geldi. İP'lerin nakli, bu hastalarda kan şekerinin kontrol altına için yeni umut verici yöntemdir7. BU makalede, IPC'ler oluşturmak için bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolleri olmak üzere iki yaklaşım sunulmuştur. İndüksiyon protokolü, olgunlaşmış ve işlevsel IPC'leri elde etmek için doğal pankreas gelişim sürecini taklit etti8,9.

Bu çalışma için hDCPCs, MSC yüzey belirteci tespiti için akış sitometrisi, çok satırlı farklılaşma potansiyeli ve rt-qPCR ile karakterize edildi ve sap özelliği ve proliferatif gen belirteçlerinin (veri gösterilmedi) ekspresyonunu belirlemek için8,9,10. hDC'ler kesin endoderm, pankreas endoderm, pankreas endokrin ve pankreas beta hücreleri veya IPC'lere indüklenmiştir (Şekil 1), sırasıyla7. Hücreleri indüklamak için omurga protokolü olarak üç aşamalı indüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Bu protokole bütünleştirici olmayan protokol denirdi. Bütünleştirici protokol durumunda, temel pankreas transkripsiyon faktörü PDX1,hDC'lerde aşırı ifade edildi ve ardından üç adımlı bir farklılaşma protokolü kullanılarak hDC'lerde aşırı ifade edilen PDX1 indüksiyonu yapıldı. Bütünleştirici olmayan ve bütünleştirici protokol arasındaki fark, PDX1'in bütünleştirici olmayan protokolde değil, bütünleştirici protokolde aşırı ifade olmasıdır. Pankreas farklılaşması bu çalışmada bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan protokoller arasında karşılaştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi ve Chulalongkorn Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi İnsan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı. İnsan DPSC'leri (hDC'ler), yirmilik diş sorunları nedeniyle hem premolarlardan hem de azı dişlerinden çıkarılan insan diş hamuru dokularından izole edildi. Onaylı bir protokol (HREC-DCU 2018/054) kapsamında hastalardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. Bütünleştirici indüksiyon protokolü

  1. PDX1 taşıyan lentiviral vektörün hazırlanması
    1. Viral paketleme için insan embriyonik böbrek (HEK) 293FT hücreleri kullanın. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) hücrelerinde %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin ve %1 Antibiyotik-Antimykotik ile desteklenmiş bu hücrelerin kültür ve bakımı.
    2. Kalsiyum fosfat transfeksiyon sistemi kullanarak HEK293FT hücrelerine ambalaj ve zarf plazmidlerinin her biri için 10 μg ve hedeflenen gen plazmidlerinin 20 μg'si eş-transfeksiyon ile PDX1-lentivirüs vektörleri oluşturun, örneğin psPAX2, pMD2. G ve insan pWPT-PDX111. Enfeksiyon sırasında hücrelerin% 80-% 90 birleştiğinden emin olun.
    3. Lentiviral parçacıklar içeren ortamı transfeksiyondan sonra 48 ve 72 saat arasında toplayın.
    4. Toplanan ortamı 0,45 μm filtreden geçirin; virüsleri 100 kDa nominal moleküler ağırlık kesme (NMWCO) santrifüj filtre ile konsantre eder.
  2. PDX1 aşırı ifade
    1. %70-80 birleştirilmiş 3-5 hDPSC pasajı kullanın. Hücre sayacı kullanarak hücreleri deneyin ve sayın. Tohum 1 x 106 hDPSC 60 mm doku kültürü ile işlenmiş bir çanak üzerine ve bir gecede kuluçkaya yaslayın.
    2. 24 saat sonra, 1.1.4 adımından elde edilen taze virüs parçacıklarını, istenen enfeksiyon çokluğunda (MOI) polibrenin önceden işlenmiş hücrelerini (4 μg / mL polibren, 37 ° C'nin altında 30 dk ve% 5 CO2)transdüse etmek için ekleyin. Örneğin, bu durumda, kullanılan MOI 20'dir. Hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri % 5 CO 2 ile 37 °C'de24saat boyunca koruyun.
    3. 24 saat enfeksiyon süresinden sonra, viral parçacıklar içeren ortamı atın. Taze kültür medyası ekleyin ve hücreleri 48 saat büyütmeye devam edin. Tüm kültürler 37 °C ve% 5 CO2'detutulur.
    4. İndüksiyon adımına geçmeden önce transfected hücrelerin toplam morfolojisini kontrol edin. PDX1 transdüksiyon gen ekspresyon analizi ile doğrulanır (Ek Şekil 1).
      NOT: Sonraki adımlara geçmeden önce mikroskop altında hücre morfolojisini kontrol edin.
    5. Mikroçevrimsel indüksiyon yaklaşımı olarak üç adımlı bir indüksiyon protokolünü (adım 1.3) hasat edin ve devam edin.
  3. Üç adımlı indüksiyon protokolü
    NOT: Üç aşamalı indüksiyon protokolü, sırasıyla serumsuz ortam (SFM)-A, SFM-B ve SFM-C kullanarak hDC'lerin kesin endoderm, pankreas endoderm/endokrin ve pankreas beta hücreleri/IPC'lere pankreas farklılaşması serisi ile sonuçlandı.
    1. Kültür ortamını atın ve transdüklenmiş hDPSC'leri 1x fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile yıkayın.
    2. Hücrelere% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C' de 1 dakika kuluçkaya yaslanın, % 5 CO2.
    3. Trypsin etkinliğini durdurmak için kültür ortamını ekleyin ve tek hücre süspansiyonunu almak için hücreleri hafifçe yıkayın. Hücreleri ve aliquot 1 x 106 hücreleri her toplama tüpüne sayın.
    4. Hücre süspansiyonu 468 x g 'da (Göreli Santrifüj Kuvveti: RCF), 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın ve hücre pelet kaydedin.
    5. Peleti ilk pankreas indüksiyon ortamının 3 mL'sinde, yani serumsuz ortamda (SFM)-A. Hücreleri düşük bir bağlanma kültürü plakasına (60 mm) yeniden koyun. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de sakla.
      NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce ters mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin.
    6. SFM-A'yı çıkarın ve ikinci indüksiyon ortamının 3 mL'si, yani SFM-B ekleyin. Hücreleri önümüzdeki 2 gün boyunca 37 °C,% 5 CO2'desakla.
      NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce ters mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin.
    7. SFM-B'yi çıkarın ve üçüncü indüksiyon ortamının 3 mL'si yani SFM-C ekleyin. %5 CO2ile 37 °C'de tutulan bir hücre kültürü inkübatöründe hücreleri önümüzdeki 5 gün boyunca koruyun. Ortamı her 48 saat değiştirin. 5 gün sonra morfolojilerini gözlemleyin.
      NOT: Her indüksiyon ortamı açıklandığı gibi farklı reaktiflerle desteklenmiştir; SFM-A: %1 sığır serum albümini (BSA), 1x insülin transferin-selenyum (ITS), 4 nM activin A, 1 nM sodyum bütirat ve 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: %1 BSA, 1x ITS ve 0,3 mM taurin; ve SFM C: %1,5 BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM glukagon benzeri peptit (GLP)-1, 1 mM nikotinamid ve 1x esansiyel olmayan amino asitler (NEAs).
    8. Her adımdan sonra hücre morfolojisini ters mikroskop altında kontrol ettiğinizi unutmayın. Hücreler daha fazla bir araya gelecek ve koloniler olarak yüzecek.
    9. Daha fazla analiz için hücre kolonilerini toplayın. Koloni morfolojisi ve büyüklüğü olup olmadığını kontrol edin. Pankreas gen belirteci ekspresyon analizi ve fonksiyonel analiz yapın (Glikoz uyarılmış C-peptit salgı tahlil).

2. Bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolü

NOT: Bütünleştirici olmayan protokol, IPC'leri mikroçevrimsel indüksiyon yaklaşımı8,9olarak üç adımlı indüksiyon işlemiyle teslim etmek için omurga protokolüdür.

  1. Pasaj 3-5 hDC'leri %70-%80 izdiahta kullanın.
  2. Kültür ortamını atın ve hDC'leri 1x PBS ile yıkayın.
  3. Hücrelere% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C, 5% CO2'de1 dakika kuluçkaya yaslayın.
  4. Tripsin aktivitesini durdurmak için kültür ortamını ekleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri hafifçe pipetleyin. Her toplama tüpüne hücreleri ve aliquot 1 x10 6 hücreleri sayın.
    1. Hücre süspansiyonu 468 x g (RCF), 4 °C, 5 dk'da santrifüj. Üstnatant atın.
    2. Peletin SFM-A'da yeniden depolanarak düşük ataşman kültür plakasına (60 mm) tohumlayın. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de kültüre edin. Hücre morfolojisini ters mikroskop altında kontrol edin.
    3. SFM-A'yı çıkarın, SFM-B (Gün 3) ekleyin ve sonraki 2 gün boyunca hücreleri 37 °C, % 5 CO2altında sakleyin.
    4. SFM-B'yi çıkarın, SFM-C (Gün 5) ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C, % 5 CO2altında önümüzdeki 5 gün boyunca koruyun. SFM-C her 48 saat değiştirilir.
      NOT: Her indüksiyon ortamı açıklandığı gibi farklı reaktiflerle desteklenmiştir; SFM-A: %1 BSA, 1x ITS, 4 nM activin A, 1 nM sodyum bütirat ve 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: %1 BSA, 1x ITS ve 0,3 mM taurin; ve SFM C: %1,5 BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM nikotinamid ve 1x NEAS.
    5. Her adımdan sonra ve 10.
      NOT: Hücreler daha toplu hale gelecek ve koloniler olarak yüzecektir.
    6. Daha fazla analiz için hücre kolonilerini toplayın. Koloni morfolojisi ve büyüklüğü olup olmadığını kontrol edin. Pankreas gen belirteci ekspresyon analizi ve fonksiyonel analiz yapın (Glikoz uyarılmış C-peptit salgı tahlil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalede, her iki indüksiyon protokolünün sonuçları karşılaştırılmıştır. Her iki indüksiyon protokolünün diyagramları Şekil 2A,C'de gösterilmiştir. Her iki protokolde de değerlendirme ışık mikroskobu altında yapıldı ve görüntüler ImageJ ile analiz edildi. hDC'ler her iki indüksiyon protokolünde de indüksiyonun ilk gününden itibaren koloni benzeri yapılar oluşturabildiler. Koloninin morfolojisi yuvarlak ve yoğundu ve tüm koloniler indüksiyon dönemi boyunca kültür damarlarında yüzdü (Şekil 2B,D). Her iki protokolün toplam koloni sayısı da belirlendi; sonuç, bütünleştirici indüksiyon protokolü durumunda toplam koloni sayısının bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolüne kıyasla biraz daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2E). Ancak aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca, her iki indüksiyon protokolündeki koloni büyüklüğü dağılımı da değerlendirildi (Şekil 2F). Sonuçlarımıza göre, koloninin içindeki nekrotik çekirdeği azaltmak için önemli olan bütünleştirici indüksiyon üzerine küçük ve orta büyüklükte koloniler kuruldu.

Pankreas gen belirteci analizi rt-qPCR kullanılarak yapıldı son yayınımıza göre10. Bu çalışmada kullanılan astarların listesi hakkında bilgi Tablo 1'de yer almaktadır. mRNA değeri, 18S ribozomal RNA'ya normalleştirilerek ve 2(-ΔΔCt)formülü kullanılarak kontrol ile göreli bir mRNA ifadesi olarak sunuldu. Bu çalışmanın sonuçları, bütünleştirici indüksiyon protokolünün, HDC'lerin IPC'lere doğru farklılaştırılmasını öneren ISL-1, MAF-A, GLUT-2, İnSÜLİnve GLP-1R dahilolmak üzere geç pankreas belirteçlerinin yüksek ekspresyonu olan koloniler sağladığını ortaya koydu. Bu çalışmada hDPSC-İp'lerin fonksiyonel değerlendirmesi de tanımlanmıştır (Şekil 4). Bir ELISA kiti kullanılarak glikoz uyarıcı C-peptid salgısı8,9 tahlil kullanılmıştır. Sonuçlar, bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokollerinin C-peptid salgılayabilen koloniler sağladığını göstermiştir.

Figure 1
Şekil 1: IPC'lere yönelik MSC farklılaşma şeması.

Figure 2
Şekil 2: Morfoloji, toplam koloni sayısı ve iki farklı protokol kullanılarak IPC'lerin koloni boyutu dağılımı. Temel transkripsiyon faktörü PDX1'in aşırı ifade ile bütünleştirici protokolün şeması ve ardından üç dik indüksiyon protokolü (A). İndüksiyonun her adımında transfected hDPSC'lerin morfolojisi (B). Omurga protokolü olarak bütünleştirici olmayan diyagram (C). Bütünleştirici olmayan iletişim kuralını kullanarak hDPSC-IPC'lerin morfolojisi (D). İki farklı protokolün toplam kolonisi (E) ve koloni büyüklüğü dağılımı (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İki farklı protokolden elde edilen hDPSC-IPC'lerin pankreas gen ekspresyon analizi. Pankreas endoderminin mRNA ekspresyonu (PDX1 ve NGN-3) (A), pankreas adacık belirteçleri (ISL-1, MAF-A, GLUT-2ve İnSÜLİn) (B) ve pankreasla ilgili belirteç (GLP-1R) (C) analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İki farklı protokolden elde edilen hDPSC-IPC'lerin fonksiyonel analizi. Her indüksiyon protokolünde C-peptid salgılanması, bütünleştirici (A) ve bütünleştirici olmayan(B) protokoller, glikoz uyarılmış C-peptit salgısı (GSCS) tahlili ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: PDX1 transdüksiyondan sonra PDX1 mRNA analizi. HDPSC'lerde MOI 20'de 48 saat PDX1 transdüksiyondan sonra PDX1 mRNA ekspresyon analizi gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Gen Katılım numarası İleri Astar Uzunluk Tm
Ters Astar (bp) (°C)
PDX-1 NM_000209.4 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999.3 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
GLUT-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
INSÜLİN NM_000207.2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062.4 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTGTGTTTG – 3' 60.25
18S NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' 54.86

Tablo 1: Astar Bilgisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MSC'lerden daha yüksek IPC üretimi elde etmek diyabet tedavisinde önemli bir rol oynar. Bütünleştirici protokolün kritik adımları, transdüksiyon için kullanılacak hücrelerin kalitesine ve transdüklenmiş hücrelerin kalitesine dayanır. Başarılı transdüksiyon için kontrol edilmesi gereken bazı hücre gereksinimleri, hücre sağlığını, hücre bankacılığı yönetimini ve hücrelerin mitotik olarak aktif bir durumda olmasını sağlamaktır. Ayrıca, transdüklenmiş hücrelerin canlılığını izlemek de önemli bir rol oynar. Daha az başarılı transdüksiyon, uyarılmış hücrelerin zayıf yaşayabilirliğinden kaynaklanır12. Bütünleştirici olmayan protokoller için, pankreas farklılaşmasının olgunlaşmasıyla ilgili oldukları için morfolojik görünüm ve yüzen koloniler elde edilmelidir9.

Bütünleştirici indüksiyon protokolü için tekniğin değiştirilmesi ve sorun giderilmesi açısından, 3-5 ve%70-%80'lik kesitlerdeki hücreler kullanılarak sağlıklı ve kaliteli hücreler elde edilebilirken, transdüklenmiş hücrelerin kalitesi bir sonraki adıma geçmeden önce uyarılan hücrelerin kalitesi rutin olarak kontrol edilerek izlenmelidir. Bu bulgu, transdüksiyonun verimliliğini etkileyen birkaç faktörün hücre sağlığına, hücre birleşmesi ve pasaj sayısına dayandığından bahseden önceki bir çalışma ile ilişkilidir13. Bu çalışmada, üç aşamalı bir indüksiyon sürecine sahip bütünleştirici olmayan protokol, esas olarak koloni büyüklüğü ve koloni sayısı oluşumu ile ilgili sınırlamalarla karşı karşıyadır. Bu sonuç önceki çalışmamızla tutarlı8,9. Bu sorunun üstesinden gelmek için, hücrelerin kalitesini ve düşük bağlanma kültürü damarlarının kalitesini kontrol etmeyi öneririz.

Bu tekniğin sınırlandırılması, ardışık iki farklı platformun kullanılmasından kaynaklanan bütünleştirici indüksiyon protokolünün karmaşıklığıdır. Ayrıca, daha yüksek MOI, transdüksiyonun daha yüksek verimliliği anlamına gelmez. Lentivirüs transdüksiyon kullanılarak yapılan benzer bir çalışmada, daha yüksek bir MOI daha iyi transdüksiyon verimliliği elde edemedi. Yazarlar protamin sülfat14gibi bir adjuvan kullanılmasını önermektedir. Bütünleştirici olmayan protokollerin kullanılmasının sınırlamaları, koloninin üretimi ve hasadı için işleme teknikleri ve üretilen IPC'lerin değişen boyutları ve morfolojik yapıları gibi teknik konularla ilgilidir.

Temel transkripsiyon faktörü, PDX1, böylece MSC indüksiyonunun olgun IPC'lere doğru taahhüdünde potansiyel bir role sahip olmak15,16,17,18. PdX1-overexpressed hDPSC'ler ve ardından üç adımlı bir indüksiyon protokolü kullanılarak omurga protokolünün değiştirilmesi esas olarak olgun ve işlevsel IPC'lerin başarılı yüksek verimli üretimine yönelikti19,20,21. Bu protokolün bulguları, olgun IPC'lere yönelik MSC indüksiyonunun PDX19'unendodermik öncesi ifadesini gerektirdiğini yansıtmıştır. Morfolojik değerlendirme, kolonilerin bağlı olmayan 3D yapısının düşük bağlanmalı damarlar kullanılarak her iki protokolde de elde edilebileceğini göstermiştir. Bu yapı pankreas farklılaşması 7 , 9,22,23olgunlaşmasını elde etmek içinönemliydi. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü değerlendirmesine göre, bütünleştirici protokol, toplam koloni sayısının ve koloninin nekrotik bir çekirdeğini önleyebilecek küçük ila orta boy koloni üretiminin olumlu bir eğilimi ile sonuçlandı. Bu nedenle, daha fazla transplantasyon için faydalı olacaktır7,19,21,24,25. Bu protokolde geç evre pankreas gen belirteçlerinin(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, İnSÜLİnve GLP-1R)yukarı yönlüluğu gözlenmiştir. Bütünleştirici indüksiyon protokolündeki geç evre pankreas gen belirteçleri omurga protokolüne göre daha yüksekti. PDX1'in aşırı ifade edilişinin pankreas progenitörlerinin sayısını artırdığı, yani orta ila geç evre pankreas gelişiminin ilerlemesi açısından daha iyi bir sonuç elde edilebileceği ortaya çıktı19,26,27,28. Ayrıca, IPC'lerin işlevini netleştirmek için bir GSCS tahlili gerçekleştirildi. Her iki protokolden üretilen hDPSC-IPC'ler C-peptit salgılayarak fonksiyonel olarak aktif kolonileri düşündürmektedir.

Bu çalışmada kullanılan tekniğin gelecekteki uygulamalarını özetlemek gerekirse, her iki pankreas indüksiyon protokolü de IPC'leri in vitro. Toplam koloni sayısı, küçük ve orta boy koloni üretimi ve pankreas belirteci ekspresyumu açısından, bütünleştirici protokol IPC oluşumu için yararlı bir eğilim göstererek, insan ve veteriner uygulamaları için kök hücre bazlı diyabet tedavilerinde daha fazla MSC uygulamasını destekledi7,29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

SK, WR ve QDL, Chulalongkorn Üniversitesi Veteriner Kök Hücre ve Biyomühendislik Araştırma Birimi, Ratchadaphiseksomphot Bağış Fonu tarafından desteklendi. TO ve PP, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi tarafından2. CS, VeterinerLik Fakültesi, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 175 insülin üreten hücreler IPC'ler pankreas soyları insan diş hamuru kök hücreleri hDPSC'ler diabetes mellitus
<em>Tüp bebek</em> pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W.,… More

Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter