Summary
Denne protokollen presenterer en sammenligning mellom to forskjellige induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCer) mot bukspyttkjertel avstamninger in vitro: den integrerende protokollen og den ikke-integrative protokollen. Den integrerte protokollen genererer flere insulinproduserende celler (IPCer).
Abstract
Fra og med 2000 sto suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen for å behandle type I diabetes mellitus fortsatt overfor noen hindringer. Disse inkluderer det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer og langvarig bruk av immundempende midler. Mesenchymale stamceller (MSCer) har blitt ansett for å være en potensiell kandidat som en alternativ kilde til holmelignende cellegenerering. Våre tidligere rapporter har med hell illustrert etableringen av induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCs) til insulinproduserende celler (IPCer). Induksjonseffektiviteten varierte imidlertid sterkt. I dette dokumentet demonstrerer vi sammenligningen av hDPSCs pankreatisk induksjonseffektivitet via integrativ (mikroenvironmental og genetisk manipulering) og ikke-integrativ (mikroenvironmental manipulering) induksjonsprotokoller for å levere hDPSC-avledede IPCer (hDPSC-IPCer). Resultatene antyder tydelig induksjonseffektivitet for både induksjonsmetodene når det gjelder 3-dimensjonal kolonistruktur, utbytte, bukspyttkjertel mRNA-markører og funksjonell egenskap ved multidosering glukoseutfordring. Disse funnene vil støtte fremtidig etablering av en klinisk anvendelig IPC og bukspyttkjertellinjeproduksjonsplattform.
Introduction
Diabetes mellitus er en pågående global bekymring. En rapport fra International Diabetes Federation (IDF) anslo at den globale forekomsten av diabetes ville øke fra 151 millioner i 2000 til 415 millioner i 20151,2. Den siste epidemiologibaserte studien har spådd at den estimerte verdensomspennende diabetesprevalensen vil øke fra 451 millioner i 2017 til 693 millioner i 20451. Suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen ble først demonstrert i 2000, da det ble vist å opprettholde endogen insulinproduksjon og stabilisere den normoglykemiske tilstanden hos type I diabetikere3. Imidlertid står anvendelsen av Edmonton-protokollen fortsatt overfor et flaskehalsproblem. Det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer er hovedproblemet siden hver pasient med type I diabetes krever minst 2-4 holmedonorer. Videre kan langvarig bruk av immundempende midler forårsake livstruende bivirkninger4,5. For å løse dette har utviklingen av en potensiell terapi for diabetes det siste tiåret hovedsakelig fokusert på generering av effektive insulinproduserende celler (IPCer) fra ulike kilder tilstamceller 6.
Stamceller ble en alternativ behandling i mange sykdommer, inkludert diabetes type I, som skyldes tap av betaceller. Transplantasjon av IPCer er den nye lovende metoden for å kontrollere blodsukker hos disse pasientene7. To tilnærminger for å generere IPCer, integrative og ikke-integrative induksjonsprotokoller, presenteres i denne artikkelen. Induksjonsprotokollen etterlignet den naturlige utviklingsprosessen for bukspyttkjertelen for å få de modne og funksjonelle IPCene8,9.
For denne studien var hDPSCer preget av strømningscytometri for MSC-overflatemarkørdeteksjon, multilineage differensieringspotensial og RT-qPCR for å bestemme uttrykket av stemnessegenskap og proliferative genmarkører (data ikke vist)8,9,10. hDPSCer ble indusert mot definitiv endoderm, bukspyttkjertel endoderm, bukspyttkjertel endokrine og bukspyttkjertel beta-celler eller IPCer (Figur 1), henholdsvis7. For å indusere cellene ble en tre-trinns induksjonstilnærming brukt som en ryggradsprotokoll. Denne protokollen ble kalt en ikke-integrativ protokoll. Når det gjelder integrativ protokoll, ble den essensielle transkripsjonsfaktoren for bukspyttkjertelen, PDX1, overekspressert i hDPSCer etterfulgt av induksjon av overutpresset PDX1 i hDPSCer ved hjelp av en tretrinns differensieringsprotokoll. Forskjellen mellom ikke-integrativ og integrativ protokoll er overekspressering av PDX1 i integrativ protokoll og ikke i den ikke-integrative protokollen. Pankreasdifferensiering ble sammenlignet mellom de integrative og ikke-integrative protokollene i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbeidet ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og godkjent av Human Research Ethics Committee, Det odontologiske fakultet, Chulalongkorn University. Humane DPSCer (hDPSCer) ble isolert fra humant tannmassevev ekstrahert fra både premolarer og molarer på grunn av visdomstenneproblemer. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene under en godkjent protokoll (HREC-DCU 2018/054).
1. Integrativ induksjonsprotokoll
- Fremstilling av lentiviral vektor som bærer PDX1
- Bruk human embryonal nyre (HEK) 293FT celler for viral emballasje. Kultur og opprettholde disse cellene i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, og 1% antibiotika-antimykotisk.
- Generer PDX1-lentivirusvektorer ved samtidig transfeksjon av 10 μg hver av emballasje- og konvoluttplasmidene og 20 μg av det målrettede genplasmidet i HEK293FT-celler ved hjelp av kalsiumfosfattransfeksjonssystem, for eksempel psPAX2, pMD2. G og menneskelig pWPT-PDX111. Forsikre deg om at cellene er 80% -90% sammenfallende i infeksjonstidspunktet.
- Samle mediet som inneholder lentivirale partikler ved 48 og 72 timer etter transfeksjon.
- Filtrer det oppsamlede mediet gjennom et 0,45 μm filter; konsentrer virusene med et sentrifugalfilter ved 100 kDa nominell molekylvektkutt (NMWCO).
- PDX1 overekspressering
- Bruk passasje 3-5 hDPSC som er 70-80% confluent. Prøv å endre navn på og telle cellene ved hjelp av en celleteller. Frø 1 x 106 hDPSCer på en 60 mm vev kulturbehandlet tallerken og inkubere over natten.
- 24 timer senere, tilsett ferske viruspartikler hentet fra trinn 1.1.4 for å transduser polybrene forhåndsbehandlede celler (4 μg/ml polybren, 30 min under 37 °C og 5 % CO2) ved ønsket multiplisitet av infeksjon (MOI). I dette tilfellet er for eksempel MOI brukt 20. Vedlikehold cellene i cellekulturinkubatoren i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Etter 24 timers infeksjonsperiode, kast mediet som inneholder viruspartikler. Legg til friske kulturmedier og fortsett å vokse cellene i 48 timer. Alle kulturer opprettholdes ved 37 °C og 5 % CO2.
- Kontroller den aggregerte morfologien til de transfekterte cellene før du går videre til induksjonstrinnet. PDX1-transduksjon bekreftes ved genuttrykksanalyse (Supplerende figur 1).
MERK: Kontroller cellemorfologien under et mikroskop før du går videre til de neste trinnene. - Høst og fortsett til en tre-trinns induksjonsprotokoll (trinn 1.3) som en mikroenvironmental induksjonstilnærming.
- Tretrinns induksjonsprotokoll
MERK: Den tre-trinns induksjonsprotokollen resulterte i serien av pankreasdifferensiering av hDPSCer for å definitivere endoderm, bukspyttkjertel endoderm / endokrine og bukspyttkjertel beta-celler / IPCer ved hjelp av henholdsvis serumfritt medium (SFM) -A, SFM-B og SFM-C.- Kast kulturmediet, og vask deretter de transinduserte hDPSCene med 1x fosfatbufret løsning (PBS).
- Tilsett 0,25% trypsin-EDTA-løsning i cellene og inkuber i 1 min ved 37 °C, 5 % CO2.
- Legg til kulturmediet for å stoppe trypsinaktiviteten og skyll cellene forsiktig for å få encellet suspensjon. Tell cellene og aliquot 1 x 106 celler i hvert samlerør.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 468 x g (Relativ sentrifugalkraft: RCF), 4 °C, i 5 minutter. Kast supernatanten og lagre cellepelleten.
- Resuspend pellet i 3 ml første bukspyttkjertelinduksjonsmedium, det vil si serumfritt medium (SFM)-A. Frø cellene på en lav festekulturplate (60 mm). Vedlikehold cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 3 dager.
MERK: Observer cellenes morfologi under et invertert mikroskop før du går videre til neste trinn. - Fjern SFM-A og tilsett 3 ml av det andre induksjonsmediet, det vil si SFM-B. Vedlikehold cellene for de neste 2 dagene ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Observer cellenes morfologi under et invertert mikroskop før du går videre til neste trinn. - Fjern SFM-B og tilsett 3 ml av det tredje induksjonsmediet, det vil si SFM-C. Vedlikehold cellene for de neste 5 dagene i en cellekulturinkubator opprettholdt ved 37 °C med 5 % CO2. Bytt medium hver 48. Observer deres morfologi etter 5 dager.
MERK: Hvert induksjonsmedium suppleres med forskjellige reagenser som beskrevet; SFM-A: 1% bovint serumalbumin (BSA), 1x insulin-transferrin-selen (ITS), 4 nM aktivin A, 1 nM natrium butyrat og 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS og 0,3 mM taurin; og SFM C: 1,5 % BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM glukagonlignende peptid (GLP)-1, 1 mM nikotinamid og 1x ikke-essensielle aminosyrer (NEAAer). - Sørg for å sjekke cellemorfologien under et invertert mikroskop etter hvert trinn. Cellene blir mer aggregerte og flyter som kolonier.
- Samle cellekolonier for videre analyse. Se etter kolonimorfologi og størrelse. Utfør pankreas genmarkøruttrykksanalyse og funksjonell analyse (glukose stimulert C-peptid sekresjonsanalyse).
2. Ikke-integrativ induksjonsprotokoll
MERK: Den ikke-integrative protokollen er ryggraden protokollen for å levere IPCene med tre-trinns induksjonsprosessen som en mikroenvironmental induksjon tilnærming8,9.
- Bruk passasje 3-5 hDPSCer med 70% -80% samløp.
- Kast kulturmediet og vask hDPSCer med 1x PBS.
- Tilsett 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning på cellene og inkuber i 1 min ved 37 °C, 5 % CO2.
- Legg til kulturmediet for å stoppe trypsinaktiviteten og rør cellene forsiktig for å oppnå encellet suspensjon. Tell celler og aliquot 1 x 106 celler i hvert oppsamlingsrør.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Kast supernatanten.
- Resuspend pelletsen i SFM-A og frø på en lav festekulturplate (60 mm). Kultur cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 3 dager. Kontroller cellemorfologien under et invertert mikroskop.
- Fjern SFM-A, tilsett SFM-B (dag 3) og vedlikehold deretter cellene for de neste 2 dagene under 37 °C, 5 % CO2.
- Fjern SFM-B, tilsett SFM-C (dag 5) og vedlikehold deretter cellene i de neste 5 dagene under 37 °C, 5 % CO2. SFM-C endres hver 48.
MERK: Hvert induksjonsmedium suppleres med forskjellige reagenser som beskrevet; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM aktivin A, 1 nM natrium butyrat og 50 μM beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS og 0,3 mM taurin; og SFM C: 1,5 % BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM nikotinamid og 1x NEAAEr. - Sørg for å sjekke cellemorfologien under det inverterte mikroskopet etter hvert trinn og på dag 10.
MERK: Cellene blir mer aggregerte og vil flyte som kolonier. - Samle cellekolonier for videre analyse. Se etter kolonimorfologi og størrelse. Utfør pankreas genmarkøruttrykksanalyse og funksjonell analyse (glukose stimulert C-peptid sekresjonsanalyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen ble resultatene av begge induksjonsprotokollene sammenlignet. Diagrammene for begge induksjonsprotokollene er illustrert i Figur 2A,C. I begge protokollene ble evalueringen utført under et lysmikroskop, og bilder ble analysert med ImageJ. hDPSCer var i stand til å danne kolonilignende strukturer fra den første induksjonsdagen i begge induksjonsprotokollene. Koloniens morfologi var rund og tett, og alle kolonier fløt i kulturfartøyene gjennom hele induksjonsperioden (Figur 2B,D). Det totale koloniantallet for begge protokollene ble også bestemt; Resultatet viste at det totale koloniantallet ved integrativ induksjonsprotokoll var litt høyere sammenlignet med den ikke-integrative induksjonsprotokollen (figur 2E). Forskjellen var imidlertid ikke statistisk signifikant. Videre ble kolonistørrelsesfordelingen i begge induksjonsprotokollene også evaluert (Figur 2F). Ifølge våre resultater ble små til mellomstore kolonier dannet på den integrerende induksjonen, noe som var viktig for å redusere den nekrotiske kjernen inne i kolonien.
Pankreas genmarkør analyse ble utført ved hjelp av RT-qPCR i henhold til vår nylige publikasjon10. Informasjon om listen over primere som brukes i denne studien er inkludert i tabell 1. mRNA-verdien ble presentert som et relativt mRNA-uttrykk ved normalisert til 18S ribosomal RNA og kontrollen ved hjelp av formelen 2(-ΔΔCt). Resultatene av denne studien viste at den integrative induksjonsprotokollen ga kolonier med høyt uttrykk for sene bukspyttkjertelmarkører, inkludert ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINog GLP-1R (figur 3), noe som tyder på differensiering av hDPSCer mot IPCer. Den funksjonelle evalueringen av hDPSC-IPCer ble også beskrevet (Figur 4) i denne studien. En glukosestimulerende C-peptidsekresjon8,9 analyse ble brukt ved hjelp av et ELISA-sett. Resultatene viste at de integrative og ikke-integrative induksjonsprotokollene ga kolonier som var i stand til å utskille C-peptid.
Figur 1: Diagram over MSC-differensiering mot IPCer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologi, totalt koloniantall og kolonistørrelsesfordeling av IPCer ved hjelp av to forskjellige protokoller. Diagram over den integrerende protokollen ved overekspressering av essensiell transkripsjonsfaktor, PDX1, etterfulgt av tre-bratte induksjonsprotokoll (A). Morfologi av transfekterte hDPSCer i hvert trinn av induksjon (B). Diagram over ikke-integrativ som ryggradsprotokoll (C). Morfologi for hDPSC-IPCer som bruker den ikke-integrative protokollen (D). Total koloni (E) og kolonistørrelsesfordeling (F) av to forskjellige protokoller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av bukspyttkjertelgenuttrykk av hDPSC-IPCer hentet fra to forskjellige protokoller. MRNA-uttrykket for bukspyttkjertel endoderm (PDX1 og NGN-3) (A), bukspyttkjertel holmemarkører (ISL-1, MAF-A, GLUT-2og INSULIN) (B), og bukspyttkjertelrelatert markør (GLP-1R) (C) ble analysert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonell analyse av hDPSC-IPCer hentet fra to forskjellige protokoller. C-peptidsekresjon i hver induksjonsprotokoll, integrative (A) og ikke-integrative (B) protokoller, ble bestemt av en glukose-stimulert C-peptid sekresjon (GSCS) analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: PDX1 mRNA-analyse etter PDX1-transduksjon. PDX1 mRNA-uttrykksanalyse etter 48 t PDX1-transduksjon ved MOI 20 i hDPSCer vises. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Gener | Tiltredelsesnummer | Fremre primer | Lengde | Tm | |
| Omvendt primer | (bp) | (°C) | |||
| PDX-1 | NM_000209,4 | 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' | 145 | 57.89 | |
| 5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' | 52.38 | ||||
| NGN-3 | NM_020999.3 | 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 | NM_002202.2 | 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' | 200 | 60.32 | |
| 5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' | 60.39 | ||||
| MAF-A | NM_201589.3 | 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' | 102 | 59.83 | |
| 5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' | 58.74 | ||||
| GLUT-2 | NM_000340.1 | 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' | 211 | 52.25 | |
| 5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' | 54.24 | ||||
| INSULIN | NM_000207.2 | 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' | 215 | 64.34 | |
| 5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062,4 | 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' | 189 | 59.38 | |
| 5' – TCACTCCCGCTGTGTTTG – 3' | 60.25 | ||||
| 18S | NR_003286.2 | 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' | 233 | 55.04 | |
| 5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' | 54.86 | ||||
Tabell 1: Primerinformasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å oppnå høyere IPC-produksjon fra MSCer spiller en viktig rolle i diabetesbehandling. De kritiske trinnene i den integrative protokollen er avhengige av kvaliteten på cellene som skal brukes til transduksjon og kvaliteten på transinduserte celler. Noen cellekrav som bør kontrolleres for vellykket transduksjon, sikrer cellehelse, cellebankstyring og celler er i mitotisk aktiv tilstand. Videre spiller overvåking av levedyktigheten til transinduserte celler også en viktig rolle. Mindre vellykket transduksjon er forårsaket av den dårlige levedyktigheten til de stimulerte cellene12. For de ikke-integrative protokollene bør det morfologiske utseendet og flytende kolonier oppnås fordi de er relatert til modning av bukspyttkjerteldifferensiering9.
Når det gjelder modifikasjon og feilsøking av teknikken for den integrerende induksjonsprotokollen, kan sunne og gode kvalitetsceller oppnås ved å bruke celler i passasjer 3-5 og 70% -80% samløp, mens kvaliteten på transinduserte celler bør overvåkes ved rutinemessig å sjekke kvaliteten på de stimulerte cellene før du går videre til neste trinn. Dette funnet er i sammenheng med en tidligere studie som nevnte at flere faktorer som påvirker effektiviteten av transduksjonen, er avhengige av cellehelse, cellesammenløp og antall passasjer13. I denne studien står den ikke-integrative protokollen med en tre-trinns induksjonsprosess fortsatt overfor begrensninger, hovedsakelig når det gjelder kolonistørrelse og koloninummerdannelse. Dette resultatet er i samsvar med vår forrige studie8,9. For å løse dette problemet foreslår vi å sjekke kvaliteten på cellene samt kvaliteten på de lave vedleggskulturfartøyene.
Begrensningen av denne teknikken er kompleksiteten til den integrative induksjonsprotokollen, som skyldtes bruk av to forskjellige påfølgende plattformer. Videre innebærer ikke høyere MOI høyere effektivitet av transduksjon. I en lignende studie ved hjelp av lentivirustransduksjon kunne en høyere MOI ikke oppnå bedre transduksjonseffektivitet. Forfatterne foreslår å bruke en adjuvans som protaminsulfat14. Begrensningene ved bruk av ikke-integrative protokoller er relatert til tekniske problemer som håndteringsteknikker for produksjon og høsting av kolonien og varierende størrelser og morfologiske strukturer av de produserte IPCene.
Den essensielle transkripsjonsfaktoren, PDX1, var betydelig, og hadde dermed en potensiell rolle i forpliktelsen til MSC-induksjon mot de modne IPCene15,16,17,18. Endringen av ryggradsprotokollen ved hjelp av PDX1-overekspresserte hDPSCer etterfulgt av en tretrinns induksjonsprotokoll var hovedsakelig rettet mot vellykket produksjon av modne og funksjonelle IPCer med høy avkastning19,20,21. Funnene i denne protokollen reflekterte at MSC-induksjonen mot modne IPCer krevde pre-endodermisk uttrykk for PDX19. Den morfologiske evalueringen viste at den ikke-tilknyttede 3D-strukturen av kolonier kunne oppnås i begge protokollene ved hjelp av lave vedleggsbeholdere. Denne strukturen var viktig for å oppnå modning av bukspyttkjerteldifferensiering7,9,22,23. I tillegg, i henhold til evaluering av kolonistørrelse, resulterte den integrerende protokollen i en positiv trend med totalt kolonitall og liten til mellomstor koloniproduksjon, noe som kan forhindre en nekrotisk kjerne av kolonien. Derfor vil det være gunstig for videretransplantasjon 7,19,21,24,25. Oppreguleringen av senfase genmarkører for bukspyttkjertelen (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINog GLP-1R) ble observert i denne protokollen. Genmarkørene i bukspyttkjertelen i den integrerte induksjonsprotokollen var høyere sammenlignet med ryggradsprotokollen. Det ble avslørt at overekspressjonen av PDX1 økte antall bukspyttkjertelforfedere, det vil si et bedre resultat når det gjelder progresjonen av midt- til senfase bukspyttkjertelutvikling kunne oppnås19,26,27,28. Videre, for å avklare funksjonen til IPCer, ble det utført en GSCS-analyse. hDPSC-IPCer produsert fra begge protokollene utskilte C-peptid, noe som tyder på de funksjonelt aktive koloniene.
For å oppsummere fremtidige anvendelser av teknikken som brukes i denne studien, var begge pankreasinduksjonsprotokollene i stand til å generere IPCene in vitro. Når det gjelder det totale kolonitallet, små til mellomstore koloniproduksjon og bukspyttkjertelmarkøruttrykk, viste den integrerende protokollen en gunstig trend for IPC-dannelse, og støttet ytterligere MSC-applikasjon i stamcellebaserte diabetesbehandlinger for menneskelig og veterinærpraksis7,29,30,31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SK, WR og QDL ble støttet av Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO og PP ble støttet av Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project. CS ble støttet av et forskningsstøttende stipend fra Fakultet for veterinærvitenskap, Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University og Government Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care.
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B.
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
