Summary

In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos

Published: September 25, 2021
doi:

Summary

Este protocolo presenta una comparación entre dos protocolos de inducción diferentes para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) hacia los linajes pancreáticos in vitro:el protocolo integrador y el protocolo no integrativo. El protocolo integrador genera más células productoras de insulina (IMIC).

Abstract

A partir de 2000, el éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton para tratar la diabetes mellitus tipo I todavía enfrentaba algunos obstáculos. Estos incluyen el número limitado de donantes de páncreas cadavérico y el uso a largo plazo de inmunosupresores. Las células madre mesenquimales (CME) se han considerado un candidato potencial como una fuente alternativa de generación de células similares a los islotes. Nuestros informes anteriores han ilustrado con éxito el establecimiento de protocolos de inducción para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) a las células productoras de insulina (IMC). Sin embargo, la eficiencia de inducción varió mucho. En este artículo, demostramos la comparación de la eficiencia de inducción pancreática de hDPSC a través de protocolos de inducción integrativos (manipulación microambiental y genética) y no integrativos (manipulación microambiental) para administrar IVC derivados de hDPSC (hDPSC-IVC). Los resultados sugieren una eficiencia de inducción distinta para ambos enfoques de inducción en términos de estructura de colonias en 3 dimensiones, rendimiento, marcadores de ARNm pancreático y propiedad funcional en el desafío de glucosa de dosis múltiples. Estos hallazgos apoyarán el establecimiento futuro de una plataforma de producción de IMIC y linaje pancreático clínicamente aplicable.

Introduction

La diabetes mellitus es una preocupación mundial constante. Un informe de la Federación Internacional de Diabetes (FID) estimó que la prevalencia mundial de la diabetes aumentaría de 151 millones en 2000 a 415 millones en 20151,2. El último estudio basado en la epidemiología ha predicho que la prevalencia mundial estimada de diabetes aumentará de 451 millones en 2017 a 693 millones en 20451. El éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton se demostró por primera vez en el año 2000, cuando se demostró que mantenía la producción endógena de insulina y estabilizaba la condición normoglucémica en pacientes diabéticos tipo I3. Sin embargo, la aplicación del protocolo de Edmonton todavía se enfrenta a un problema de cuello de botella. El número limitado de donantes de páncreas cadavérico es el problema principal, ya que cada paciente con diabetes tipo I requiere al menos 2-4 donantes de islotes. Además, el uso a largo plazo de agentes inmunosupresores puede causar efectos secundarios potencialmente mortales4,5. Para abordar esto, el desarrollo de una terapia potencial para la diabetes en la última década se ha centrado principalmente en la generación de células productoras de insulina (IMC) efectivas a partir de diversas fuentes de células madre6.

Las células madre se convirtieron en un tratamiento alternativo en muchas enfermedades, incluida la diabetes tipo I, que es causada por la pérdida de células beta. El trasplante de IPC es el nuevo método prometedor para controlar la glucosa en sangre en estos pacientes7. En este artículo se presentan dos enfoques para generar ICCI, protocolos de inducción integrativos y no integrativos. El protocolo de inducción imitó el proceso natural de desarrollo pancreático para obtener los IMIC maduros y funcionales8,9.

Para este estudio, las hDPSC se caracterizaron por citometría de flujo para la detección de marcadores de superficie MSC, potencial de diferenciación multilinaje y RT-qPCR para determinar la expresión de la propiedad de tallo y marcadores genéticos proliferativos (datos no mostrados)8,9,10. Las hDPSC fueron inducidas hacia el endodermo definitivo, el endodermo pancreático, el endocrino pancreático y las células beta o ICCI pancreáticas(Figura 1),respectivamente7. Para inducir las células, se utilizó un enfoque de inducción de tres pasos como protocolo de columna vertebral. Este protocolo se desllamó protocolo no integrador. En el caso del protocolo integrativo, el factor de transcripción pancreático esencial, PDX1,se sobreexpresó en hDPSC seguido de la inducción de PDX1 sobreexpresado en hDPSC utilizando un protocolo de diferenciación de tres pasos. La diferencia entre protocolo no integrativo e integrativo es la sobreexpresión de PDX1 en el protocolo integrativo y no en el protocolo no integrativo. La diferenciación pancreática se comparó entre los protocolos integrativos y no integrativos en este estudio.

Protocol

Este trabajo se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de investigación humana, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn. Las DPSC humanas (hDPSC) se aislaron de tejidos de pulpa dental humana extraídos de premolares y molares debido a problemas de muelas del juicio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes bajo un protocolo aprobado (HREC-DCU 2018/054). 1. Protocolo de inducción integrativa Preparaci…

Representative Results

En este artículo, se compararon los resultados de ambos protocolos de inducción. Los diagramas de ambos protocolos de inducción se ilustran en la Figura 2A,C. En ambos protocolos, la evaluación se realizó bajo un microscopio de luz, y las imágenes se analizaron con ImageJ. Las hDPSC fueron capaces de formar estructuras similares a colonias desde el primer día de inducción en ambos protocolos de inducción. La morfología de la colonia era redonda y densa, y todas las…

Discussion

Lograr una mayor producción de IMIC a partir de las CSPY juega un papel esencial en la terapia de la diabetes. Los pasos críticos del protocolo integrador se basan en la calidad de las células que se utilizarán para la transducción y la calidad de las células transducidas. Algunos requisitos celulares que deben verificarse para una transducción exitosa son garantizar la salubridad celular, el manejo del banco celular y las células estén en un estado mitóticamente activo. Además, el monitoreo de la viabilidad d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SK, WR y QDL fueron apoyados por la Unidad de Investigación de Células Madre Veterinarias y Bioingeniería, Fondo de Dotación Ratchadaphiseksomphot, Universidad de Chulalongkorn. TO y PP fueron apoyados por Chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project. CS fue apoyado por una subvención de apoyo a la investigación de la Facultad de Ciencias Veterinarias, chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University y Government Research Fund.

Materials

Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

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