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Bioengineering

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62497
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,5, 3,4, 3,4, 1,5,6
1Veterinary Stem Cell and Bioengineering Innovation Center (VSCBIC), Veterinary Pharmacology and Stem Cell Research Laboratory, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 2Department of Veterinary Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga, 3Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 4Center of Excellence in Regenerative Dentistry, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, 5Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, 6Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

Abstract

Ab dem Jahr 2000 stand der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus immer noch vor einigen Hindernissen. Dazu gehören die begrenzte Anzahl von Leichenspendern und die langfristige Verwendung von Immunsuppressiva. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als potenzieller Kandidat als alternative Quelle für inselähnliche Zellgenerierung angesehen. Unsere früheren Berichte haben erfolgreich die Etablierung von Induktionsprotokollen zur Unterscheidung von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) zu insulinproduzierenden Zellen (IPCs) veranschaulicht. Die Induktionseffizienz variierte jedoch stark. In diesem Artikel demonstrieren wir den Vergleich der Pankreasinduktionseffizienz von hDPSCs über integrative (mikroökumweltliche und genetische Manipulation) und nicht-integrative (mikroökumvimentale Manipulation) Induktionsprotokolle zur Bereitstellung von hDPSC-abgeleiteten IPCs (hDPSC-IPCs). Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Induktionseffizienz für beide Induktionsansätze in Bezug auf 3-dimensionale Koloniestruktur, Ausbeute, Pankreas-mRNA-Marker und funktionelle Eigenschaften bei Multidosis-Glukose-Herausforderung hin. Diese Ergebnisse werden die zukünftige Etablierung einer klinisch anwendbaren IPCs und einer Produktionsplattform für Pankreaslinien unterstützen.

Introduction

Diabetes mellitus ist ein anhaltendes globales Problem. Ein Bericht der International Diabetes Federation (IDF) schätzte, dass die globale Prävalenz von Diabetes von 151 Millionen im Jahr 2000 auf 415 Millionen im Jahr 2015 steigen würde1,2. Die jüngste epidemiologische Studie hat vorhergesagt, dass die geschätzte weltweite Diabetesprävalenz von 451 Millionen im Jahr 2017 auf 693 Millionen im Jahr 2045 steigen wird1. Der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll wurde erstmals im Jahr 2000 nachgewiesen, als gezeigt wurde, dass sie die endogene Insulinproduktion aufrechterhält und den normoglykämischen Zustand bei Typ-I-Diabetikern stabilisiert3. Die Anwendung des Edmonton-Protokolls steht jedoch immer noch vor einem Engpassproblem. Die begrenzte Anzahl von Leichenspendern ist das Hauptproblem, da jeder Patient mit Typ-I-Diabetes mindestens 2-4 Inselspender benötigt. Darüber hinaus kann die langfristige Anwendung von Immunsuppressiva lebensbedrohliche Nebenwirkungen verursachen4,5. Um dies zu beheben, hat sich die Entwicklung einer potenziellen Therapie für Diabetes in den letzten zehn Jahren hauptsächlich auf die Erzeugung wirksamer insulinproduzierender Zellen (IPCs) aus verschiedenen Quellen von Stammzellen konzentriert6.

Stammzellen wurden zu einer alternativen Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, der durch den Verlust von Beta-Zellen verursacht wird. Die Transplantation von IPCs ist die neue vielversprechende Methode zur Kontrolle des Blutzuckers bei diesen Patienten7. Zwei Ansätze zur Erzeugung von IPCs, integrative und nicht-integrative Induktionsprotokolle, werden in diesem Artikel vorgestellt. Das Induktionsprotokoll ahmte den natürlichen Entwicklungsprozess der Bauchspeicheldrüse nach, um die ausgereiften und funktionellen IPCs8,9zu erhalten.

Für diese Studie wurden hDPSCs durch Durchflusszytometrie für die MSC-Oberflächenmarkerdetektion, das Multilineage-Differenzierungspotenzial und RT-qPCR charakterisiert, um die Expression der Stemness-Eigenschaft und der proliferativen Genmarker zu bestimmen (Daten nicht gezeigt)8,9,10. hDPSCs wurden zu definitiven Endoderm-, Pankreasendoderm-, endokrinen Pankreas- und Pankreas-Betazellen oder IPCs induziert (Abbildung 1) bzw.7. Um die Zellen zu induzieren, wurde ein dreistufiger Induktionsansatz als Backbone-Protokoll verwendet. Dieses Protokoll wurde als nicht-integratives Protokoll bezeichnet. Im Falle des integrativen Protokolls wurde der essentielle Pankreas-Transkriptionsfaktor PDX1in hDPSCs überexprimiert, gefolgt von der Induktion von überexprimiertem PDX1 in hDPSCs unter Verwendung eines dreistufigen Differenzierungsprotokolls. Der Unterschied zwischen nicht-integrativem und integrativem Protokoll ist die Überexpression von PDX1 im integrativen Protokoll und nicht im nicht-integrativen Protokoll. Die Pankreasdifferenzierung wurde in dieser Studie zwischen den integrativen und nicht-integrativen Protokollen verglichen.

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Protocol

Diese Arbeit wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission für Humanforschung, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn University genehmigt. Humane DPSCs (hDPSCs) wurden aus menschlichem Zahnpulpagewebe isoliert, das aufgrund von Weisheitszähnenproblemen sowohl aus Prämolaren als auch aus Backenzähnen extrahiert wurde. Die Einwilligung nach Aufklärung wurde von den Patienten im Rahmen eines genehmigten Protokolls eingeholt (HREC-DCU 2018/054).

1. Integratives Induktionsprotokoll

  1. Herstellung von lentiviralen Vektoren, die PDX1 tragen
    1. Verwenden Sie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293FT für die virale Verpackung. Kultivieren und pflegen Sie diese Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Antibiotikum-Antimykotika.
    2. Erzeugen Sie PDX1-Lentivirus-Vektoren durch Co-Transfektion von jeweils 10 μg der Verpackungs- und Hüllplasmide und 20 μg des zielgerichteten Genplasmids in HEK293FT-Zellen unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionssystems, z. B. psPAX2, pMD2. G und human pWPT-PDX111. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während der Zeit der Infektion zu 80% bis 90% konfluent sind.
    3. Sammeln Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, 48 und 72 h nach der Transfektion.
    4. Filtern Sie das gesammelte Medium durch einen 0,45 μm-Filter; konzentrieren die Viren mit einem Zentrifugalfilter bei 100 kDa nominaler Molekulargewichts-Cut-off (NMWCO).
  2. PDX1-Überexpression
    1. Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSC, die zu 70-80% konfluent sind. Trypsinisieren und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. 1 x 106 hDPSCs auf eine 60 mm Gewebekultur behandelte Schale aufsäen und über Nacht inkubieren.
    2. 24 h später werden frische Viruspartikel aus Schritt 1.1.4 hinzugefügt, um vorbehandelte Polybrenzellen (4 μg/ml Polybren, 30 min unter 37 °C und 5 % CO2)bei der gewünschten Infektionsmultizität (MOI) zu transduzieren. In diesem Fall ist der verwendete MOI beispielsweise 20. Halten Sie die Zellen im Zellkulturinkubator 24 h bei 37 °C mit 5% CO2.
    3. Nach der 24- h-Infektionsphase das Medium, das Viruspartikel enthält, verwerfen. Fügen Sie frische Nährmedien hinzu und züchten Sie die Zellen 48 Stunden lang weiter. Alle Kulturen werden bei 37 °C und 5% CO2gehalten.
    4. Überprüfen Sie die aggregierte Morphologie der transfizierten Zellen, bevor Sie mit dem Induktionsschritt fortfahren. Die PDX1-Transduktion wird durch Genexpressionsanalyse bestätigt (Ergänzende Abbildung 1).
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem Mikroskop, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
    5. Ernte und fahren Sie mit einem dreistufigen Induktionsprotokoll (Schritt 1.3) als mikroumweltlichem Induktionsansatz fort.
  3. Dreistufiges Induktionsprotokoll
    HINWEIS: Das dreistufige Induktionsprotokoll führte zu einer Reihe von Pankreasdifferenzierungen von hDPSCs zu definitivem Endoderm, Pankreasendoderm / endokrinen und Pankreas-Betazellen / IPCs unter Verwendung von serumfreiem Medium (SFM) -A, SFM-B und SFM-C.
    1. Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie dann die transduced-hDPSCs mit 1x phosphatgepufferter Lösung (PBS).
    2. 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
    3. Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und spülen Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.
    4. Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (Relative Zentrifugalkraft: RCF), 4 °C, für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet auf.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL des ersten Pankreasinduktionsmediums, d.h. serumfreies Medium (SFM)-A. Säen Sie die Zellen auf einer niedrigen Bindungskulturplatte (60 mm). Halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 3 Tage.
      HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    6. Entfernen Sie SFM-A und fügen Sie 3 ml des zweiten Induktionsmediums, d. H. SFM-B, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 2 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
      HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    7. Entfernen Sie SFM-B und fügen Sie 3 ml des dritten Induktionsmediums, d. H. SFM-C, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 5 Tage in einem Zellkulturinkubator, der bei 37 °C mit 5% CO2gehalten wird. Wechseln Sie das Medium alle 48 h. Beobachten Sie ihre Morphologie nach 5 Tagen.
      HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM Glucagon-ähnliches Peptid (GLP)-1, 1 mM Nicotinamid und 1x nicht-essentielle Aminosäuren (NEAAs).
    8. Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie nach jedem Schritt unter einem invertierten Mikroskop überprüfen. Die Zellen werden stärker aggregiert und schwimmen als Kolonien.
    9. Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).

2. Nicht-integratives Induktionsprotokoll

HINWEIS: Das nicht-integrative Protokoll ist das Backbone-Protokoll zur Bereitstellung der IPCs mit dem dreistufigen Induktionsprozess als mikroumweltlicher Induktionsansatz8,9.

  1. Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSCs bei 70%-80% Konfluenz.
  2. Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie hDPSCs mit 1x PBS.
  3. 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
  4. Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und pipetieren Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.
    1. Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Verwerfen Sie den Überstand.
    2. Das Pellet in SFM-A wieder auffüllen und auf eine Kulturplatte mit niedrigem Aufsatz (60 mm) aussäen. Die Zellen werden 3 Tage lang bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop.
    3. SFM-A entfernen, SFM-B (Tag 3) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 2 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten.
    4. SFM-B entfernen, SFM-C (Tag 5) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 5 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten. SFM-C wird alle 48 h gewechselt.
      HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM Nicotinamid und 1x NEAAs.
    5. Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie unter dem invertierten Mikroskop nach jedem Schritt und an Tag 10 überprüfen.
      HINWEIS: Die Zellen werden aggregierter und schweben als Kolonien.
    6. Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).

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Representative Results

In diesem Artikel wurden die Ergebnisse beider Induktionsprotokolle verglichen. Die Diagramme beider Induktionsprotokolle sind in Abbildung 2A,Cdargestellt. In beiden Protokollen wurde die Auswertung unter einem Lichtmikroskop durchgeführt und die Bilder mit ImageJ analysiert. hDPSCs waren in der Lage, kolonieähnliche Strukturen vom ersten Tag der Induktion in beiden Induktionsprotokollen zu bilden. Die Morphologie der Kolonie war rund und dicht, und alle Kolonien schwebten während der gesamten Induktionszeit in den Kulturgefäßen (Abbildungen 2B, D). Die Gesamtzahl der Kolonien beider Protokolle wurde ebenfalls bestimmt; das Ergebnis zeigte, dass die Gesamtkoloniezahl beim integrativen Induktionsprotokoll im Vergleich zum nicht-integrativen Induktionsprotokoll etwas höher war (Abbildung 2E). Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. Des Weiteren wurde auch die Koloniegrößenverteilung in beiden Induktionsprotokollen evaluiert (Abbildung 2F). Nach unseren Ergebnissen wurden kleine bis mittelgroße Kolonien durch die integrative Induktion gebildet, die für die Verringerung des nekrotischen Kerns innerhalb der Kolonie wichtig war.

Die Pankreas-Genmarkeranalyse wurde mit RT-qPCR gemäß unserer jüngsten Veröffentlichung10durchgeführt. Informationen über die Liste der in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 enthalten. Der mRNA-Wert wurde als relative mRNA-Expression durch normalisierte zu 18S ribosomale RNA und die Kontrolle unter Verwendung der Formel von 2(-ΔΔCt)dargestellt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass das integrative Induktionsprotokoll Kolonien mit hoher Expression von späten Pankreasmarkern ergab, einschließlich ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINund GLP-1R (Abbildung 3), was auf die Differenzierung von hDPSCs gegenüber IPCs hindeutet. Auch die funktionelle Bewertung von hDPSC-IPCs wurde in dieser Studie beschrieben (Abbildung 4). Ein glukosestimulierender C-Peptid-Sekretion8,9 Assay wurde mit einem ELISA-Kit verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die integrativen und nicht-integrativen Induktionsprotokolle Kolonien ergaben, die in der Lage waren, C-Peptid abzusondern.

Figure 1
Abbildung 1: Diagramm der MSC-Differenzierung zu IPCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologie, Gesamtzahl der Kolonien und Verteilung der Koloniegröße von IPCs unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen. Diagramm des integrativen Protokolls durch Überexpression des essentiellen Transkriptionsfaktors PDX1, gefolgt von einem dreisteiligen Induktionsprotokoll (A). Morphologie der transfizierten hDPSCs in jedem Schritt der Induktion (B). Diagramm des nicht-integrativen als Backbone-Protokoll (C). Morphologie von hDPSC-IPCs unter Verwendung des nicht-integrativen Protokolls (D). Gesamtkolonie (E) und Koloniegrößenverteilung (F) von zwei verschiedenen Protokollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Pankreas-Genexpressionsanalyse von hDPSC-IPCs, die aus zwei verschiedenen Protokollen gewonnen wurden. Die mRNA-Expression von Pankreasendoderm (PDX1 und NGN-3) (A), Pankreas-Inselmarkern (ISL-1, MAF-A, GLUT-2und INSULIN) (B) und Pankreas-bezogenen Markern (GLP-1R) (C) wurde analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Funktionsanalyse von hDPSC-IPCs aus zwei verschiedenen Protokollen. Die C-Peptidsekretion in jedem Induktionsprotokoll, integrative (A) und nicht-integrative (B) Protokolle, wurden durch einen Glukose-stimulierten C-Peptid-Sekretionstest (GSCS) bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: PDX1-mRNA-Analyse nach PDX1-Transduktion. PdX1 mRNA-Expressionsanalyse nach 48 h PDX1-Transduktion bei MOI 20 in hDPSCs wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Gene Beitrittsnummer Vorwärts-Primer Länge Tm
Umgekehrte Grundierung (bp) (°C)
PDX-1 NM_000209,4 5' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3' 145 57.89
5' – GGCCGTGAGATGTACTTGTTG – 3' 52.38
NGN-3 NM_020999.3 5' – CGGTAGAAAGGATGACGCCT – 3' 138 59.54
5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' 60.11
ISL-1 NM_002202.2 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' 200 60.32
5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' 60.39
MAF-A NM_201589.3 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' 102 59.83
5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' 58.74
GLUT-2 NM_000340.1 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' 211 52.25
5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' 54.24
INSULIN NM_000207.2 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' 215 64.34
5' – TTCCACAATGCCACGCTTCTGC – 3' 64.45
GLP-1R NM_002062.4 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' 189 59.38
5' – TCACTCCCGCTCTGTGTTTG – 3' 60.25
18ER NR_003286.2 5' – GTGATGCCCTTAGATGTCC – 3' 233 55.04
5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' 54.86

Tabelle 1: Primer-Informationen.

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Discussion

Das Erreichen einer höheren IPCs-Produktion aus MSCs spielt eine wesentliche Rolle in der Diabetestherapie. Die kritischen Schritte des integrativen Protokolls hängen von der Qualität der für die Transduktion zu verwendenden Zellen und der Qualität der transduzierten Zellen ab. Einige Zellanforderungen, die auf eine erfolgreiche Transduktion überprüft werden sollten, stellen sicher, dass sich die Zellgesundheit, das Zellbankmanagement und die Zellen in einem mitotisch aktiven Zustand befinden. Darüber hinaus spielt auch die Überwachung der Lebensfähigkeit von transduzierten Zellen eine wichtige Rolle. Weniger erfolgreiche Transduktion wird durch die schlechte Lebensfähigkeit der stimulierten Zellen verursacht12. Für die nicht-integrativen Protokolle sollten das morphologische Aussehen und die schwimmenden Kolonien erreicht werden, da sie mit der Reifung der Pankreasdifferenzierung zusammenhängen9.

In Bezug auf die Modifikation und Fehlerbehebung der Technik für das integrative Induktionsprotokoll können gesunde und qualitativ hochwertige Zellen durch die Verwendung von Zellen in den Passagen 3-5 und 70% -80% Konfluenz erhalten werden, während die Qualität der transduzierten Zellen überwacht werden sollte, indem routinemäßig die Qualität der stimulierten Zellen überprüft wird, bevor mit dem nächsten Schritt fortgeht. Dieser Befund steht in Korrelation mit einer früheren Studie, in der erwähnt wurde, dass mehrere Faktoren, die die Effizienz der Transduktion beeinflussen, auf die Zellgesundheit, den Zellzusammenfluss und die Anzahl der Passagen13angewiesen sind. In dieser Studie stößt das nicht-integrative Protokoll mit einem dreistufigen Induktionsprozess immer noch an Grenzen, hauptsächlich in Bezug auf die Koloniegröße und die Koloniezahlbildung. Dieses Ergebnis stimmt mit unserer vorherigen Studie8,9überein. Um dieses Problem zu lösen, empfehlen wir, die Qualität der Zellen sowie die Qualität der Kulturgefäße mit geringer Bindung zu überprüfen.

Die Einschränkung dieser Technik ist die Komplexität des integrativen Induktionsprotokolls, die auf die Verwendung von zwei verschiedenen aufeinanderfolgenden Plattformen zurückzuführen war. Darüber hinaus bedeutet der höhere MOI keine höhere Effizienz der Transduktion. In einer ähnlichen Studie mit Lentivirus-Transduktion konnte ein höherer MOI keine bessere Transduktionseffizienz erreichen. Die Autoren schlagen vor, ein Adjuvans wie Protaminsulfat14 zuverwenden. Die Einschränkungen der Verwendung der nicht-integrativen Protokolle hängen mit technischen Fragen wie den Handhabungstechniken für die Produktion und Ernte der Kolonie und unterschiedlichen Größen und morphologischen Strukturen der produzierten IPCs zusammen.

Der wesentliche Transkriptionsfaktor, PDX1, war signifikant und spielte damit eine potenzielle Rolle bei der Verpflichtung der MSC-Induktion zu den ausgereiften IPCs15,16,17,18. Die Modifikation des Backbone-Protokolls unter Verwendung von PDX1-überexprimiertenhDPSCs gefolgt von einem dreistufigen Induktionsprotokoll zielte hauptsächlich auf die erfolgreiche ertragreiche Produktion von ausgereiften und funktionalen IPCs19,20,21ab. Die Ergebnisse dieses Protokolls spiegelten wider, dass die MSC-Induktion in Richtung reifer IPCs eine präendodermische Expression von PDX19erforderte. Die morphologische Auswertung zeigte, dass die nicht gebundene 3D-Struktur von Kolonien in beiden Protokollen unter Verwendung von Gefäßen mit niedriger Bindung erhalten werden konnte. Diese Struktur war wichtig für die Reifung der Pankreasdifferenzierung7,9,22,23. Darüber hinaus führte das integrative Protokoll nach der Bewertung der Koloniegröße zu einem positiven Trend der Gesamtkoloniezahl und der Produktion kleiner bis mittlerer Kolonien, die einen nekrotischen Kern der Kolonie verhindern können. Daher wird es für die weitere Transplantation von Vorteil sein7,19,21,24,25. Die Hochregulation von Pankreas-Genmarkern im Spätstadium (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINund GLP-1R) wurde in diesem Protokoll beobachtet. Die Pankreasgenmarker im späten Stadium des integrativen Induktionsprotokolls waren im Vergleich zum Backbone-Protokoll höher. Es zeigte sich, dass die Überexpression von PDX1 die Anzahl der Pankreasvorläufer erhöhte, d.h. ein besseres Ergebnis in Bezug auf das Fortschreiten der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse im mittleren bis späten Stadium konnte erreicht werden19,26,27,28. Um die Funktion von IPCs zu klären, wurde außerdem ein GSCS-Assay durchgeführt. hDPSC-IPCs, die aus beiden Protokollen hergestellt wurden, sezernierten C-Peptid, was auf die funktionell aktiven Kolonien hindeutet.

Um die zukünftigen Anwendungen der in dieser Studie verwendeten Technik zusammenzufassen, konnten beide Pankreasinduktionsprotokolle die IPCs in vitrogenerieren. In Bezug auf die Gesamtzahl der Kolonien, die Produktion kleiner bis mittelgroßer Kolonien und die Expression von Pankreasmarkern zeigte das integrative Protokoll einen vorteilhaften Trend für die IPC-Bildung und unterstützte die weitere MSC-Anwendung in stammzellbasierten Diabetesbehandlungen für menschliche und veterinärmedizinischePraxen 7,29,30,31,32.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

SK, WR und QDL wurden von der Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University, unterstützt. TO und PP wurden von Chulalongkorn Academic Advancement in Its2nd Century Project unterstützt. CS wurde durch ein forschungsunterstützendes Stipendium der Fakultät für Veterinärwissenschaften, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University und Government Research Fund unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific Corporation, USA 15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish Corning® 430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific Corporation 12800017
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Corporation 10270106
GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific Corporation 35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific Corporation 25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Merck Millipore, USA UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid Addgene 12256 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm Merck Millipore SLHV033RB
pMD2.G plasmid Addgene 12259 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck Millipore TR-1003-G
psPAX2 plasmid Addgene 12260 Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein Merck Millipore GF300
Beta-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Corporation 21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) Sigma-Aldrich A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1 Sigma-Aldrich G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Invitrogen 41400-045
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) Thermo Fisher Scientific Corporation 11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm Eppendorf 30701011
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>In vitro</em> Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien
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Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).

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