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Cancer Research

लिवर मेटास्टेसिस स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) ऑर्गेनोइड्स का पोर्टल शिरा इंजेक्शन स्ट्रोमा-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। सीआरसी हेपेटिक मेटास्टेसिस का यह माउस मॉडल ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने और उपन्यास स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय जैसे एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता जीन उपचार विकसित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Abstract

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) का यकृत मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्यु का एक प्रमुख कारण है। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, मेटास्टैटिक सीआरसी प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और खराब रोगी के पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं और सीएएफ के बीच क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी है। यहां, हम यह जांचने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं कि यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को मेटास्टैटिक आला द्वारा कैसे विनियमित किया जाता है और संभवतः स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन ने एक डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जिसने मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस के फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध हिस्टोलॉजी को ईमानदारी से दोहराया। यह मॉडल इंट्रा-प्लीहा इंजेक्शन मॉडल की तुलना में जिगर में एक उच्च ट्यूमर बोझ के साथ ऊतक-विशिष्ट था, जो माउस अस्तित्व के विश्लेषण को सरल बनाता है। लूसिफेरस-व्यक्त ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करके, ट्यूमर विकास कैनेटीक्स को विवो इमेजिंग में मॉनिटर किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रीक्लिनिकल मॉडल ट्यूमर मेसेनकाइम को लक्षित करने वाले चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है। हम यह जांचने के तरीकों का वर्णन करते हैं कि क्या हेपेटोसाइट्स के लिए ट्यूमर-अवरोधक स्ट्रोमल जीन के एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता वितरण ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फिर से तैयार कर सकते हैं और माउस के अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण सीआरसी के यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास और मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में कैंसर की मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। सीआरसी रोगियों के आधे से अधिक यकृत मेटास्टेसिस विकसित करते हैं जो पोर्टल शिरा प्रसार1 के माध्यम से होता है। वर्तमान में, कोई प्रभावी चिकित्सीय नहीं है जो उन्नत यकृत मेटास्टेसिस का इलाज कर सकता है, और अधिकांश रोगी मेटास्टैटिक बीमारी से पीड़ित हैं।

मेटास्टैटिक आला या ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट प्रसारित सीआरसी कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, विकास कारकों को स्रावित करने, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) को फिर से तैयार करने और प्रतिरक्षा परिदृश्य और एंजियोजेनेसिस 3,4,5 को संशोधित करने के माध्यम से कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने या रोकने के लिए। सीएएफ भी chemotherapys और immunotherapys 3 के लिए प्रतिरोध प्रदान करतेहैं। इसके अलावा, सीएएफ सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस की दीक्षा और प्रगति को विनियमित करते हैं और सीआरसी 3,6,7,8 वाले रोगियों में पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। इस प्रकार, सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए सीएएफ से संबंधित कारकों का शोषण किया जा सकता है। हालांकि, मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी स्ट्रोमा-लक्षित उपचार विकसित करने के लिए एक बड़ी बाधा रही है।

वर्तमान में, सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल में प्राथमिक सीआरसी मॉडल शामिल हैं जो अनायास यकृत मेटास्टेसिस और कैंसर सेल प्रत्यारोपण मॉडल को जिगर में विकसित करते हैं। प्राथमिक सीआरसी माउस मॉडल, जैसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल और कैंसर कोशिकाओं के कोलोनिक इंजेक्शन, शायद ही कभी जिगरको मेटास्टेसिस दिखाते हैं 9,10,11,12। इसके अलावा, यहां तक कि अगर एक जिगर मेटास्टेसिस मनाया जाता है, तो ये मॉडल प्राथमिक ट्यूमर प्रेरण से मेटास्टेसिस तक लंबी विलंबता दिखाते हैं, और संभावित रूप से प्राथमिक ट्यूमर के बोझ से मर जातेहैं। कुशलतापूर्वक सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए, सुसंस्कृत सीआरसी कोशिकाओं को तीन इंजेक्शन दृष्टिकोणों का उपयोग करके जिगर में प्रत्यारोपित किया जाता है: इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन, जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन, और पोर्टल शिरा इंजेक्शन। इंट्रा-स्प्लेनिक रूप से इंजेक्ट की गई कैंसर कोशिकाएं प्लीहा नस, पोर्टल नस, और अंततः जिगर13,14 में फैल जाती हैं। हालांकि, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन अन्य प्रत्यारोपण मॉडल15,16 की तुलना में कम ट्यूमर लेने का अनुपात पैदा करता है। इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के साथ, प्लीहा के सर्जिकल हटाने को प्लीहा में कैंसर के विकास से बचने के लिए किया जाता है, जो संभावित रूप से प्रतिरक्षा कोशिका परिपक्वता से समझौता कर सकताहै 17। इसके अलावा, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्लीहा और उदर गुहा18 में अनपेक्षित ट्यूमर की वृद्धि भी हो सकती है, जो यकृत मेटास्टेसिस विश्लेषण को जटिल बनाती है। जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन कुशलतापूर्वक यकृत मेटास्टेसिस 16,19,20 को प्रेरित करता है। फिर भी, यह दृष्टिकोण पूरी तरह से यकृत मेटास्टेसिस के जैविक चरण को दोहराता नहीं है जो स्वाभाविक रूप से पोर्टल शिरा प्रसार के माध्यम से होता है। जिगर में सीधे इंजेक्शन का उपयोग करना, एक गैर-पोर्टल में कैंसर कोशिकाओं का प्रवेश, लेकिन प्रणालीगत परिसंचरण के परिणामस्वरूप कई बड़े फेफड़ों के मेटास्टेसिस भी हो सकतेहैं। हालांकि सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस वाले अधिकांश रोगी जिगर21 में कई ट्यूमर नोड्यूल दिखाते हैं, एक विशिष्ट यकृत लोब में प्रत्यक्ष इंजेक्शन एक एकल ट्यूमर द्रव्यमान19,20 उत्पन्न करता है। पोर्टल शिरा इंजेक्शन या mesenteric शिरा इंजेक्शन, हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, जिगर में ट्यूमर कोशिकाओं के कुशल वितरण की अनुमति देता है एक तरह से है कि रोगियों में देखा विकास पैटर्न recapitulates17. यह रणनीति माध्यमिक-साइट मेटास्टेसिस की संभावना को कम कर सकती है और जिगर में कैंसर कोशिकाओं के तेजी से विकास को सक्षम बनाती है, जिससे माउस अस्तित्व विश्लेषण को सरल बनाया जा सकता है।

ऐतिहासिक रूप से, कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों जैसे माउस एमसी -38, मानव एचटी -29, और एसडब्ल्यू -620 का उपयोग यकृत मेटास्टेसिस22,23 के माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। हालांकि, ये कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनें एक डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करती हैं। ट्यूमर में कम स्ट्रोमल सामग्री कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की जैविक भूमिकाओं की जांच करना मुश्किल बनाती है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स और उनके प्रत्यारोपण में हाल की प्रगति ने कैंसर की प्रगतिमें स्ट्रोमा की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का आकलन करने के लिए उपयोगी प्लेटफार्मों की पेशकश की है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स का यकृत प्रत्यारोपण एक फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट उत्पन्न करता है और स्ट्रोमल अनुसंधान 6,25 में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। वर्तमान में, ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल या मेसेन्टेरिक शिरा इंजेक्शन सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस 6,25,26,27,28 उत्पन्न करने के लिए एक स्वर्ण मानक दृष्टिकोण बन गया है। फिर भी, हमारे ज्ञान के लिए, किसी भी पिछले कागजात ने कोलोरेक्टल ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए विस्तृत तरीकों का वर्णन नहीं किया है। यहां, हम उपन्यास एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) -मध्यस्थता स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा विकसित करने के लिए सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं।

हेपेटोसाइट्स यकृत में मेटास्टैटिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक महत्वपूर्ण घटक है और मेटास्टैटिक कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। गैर-नियोप्लास्टिक रोगियों30,31 में हेपेटोसाइट्स में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी जीन थेरेपी दृष्टिकोण की सफलता से प्रेरित होकर, हमने एक समान दृष्टिकोण की जांच की, लेकिन सीआरसी25 में यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने का उद्देश्य। इस प्रकार, हम यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने के लिए एंटी-ट्यूमरजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी 8 के पूंछ शिरा इंजेक्शन का भी वर्णन करते हैं। AAV8 serotype, वायरस उत्पादन के दौरान वायरल capsid प्रोटीन की पसंद द्वारा नामित, हेपेटोसाइट्स की विशेष रूप से उच्च transduction दक्षता की ओर जाता है (यानी, जिगर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में लक्षित जीन अभिव्यक्ति)32. हमने पहले दिखाया है कि Islr (इम्युनोग्लोबुलिन superfamily जिसमें ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव होता है) एक सीएएफ-विशिष्ट जीन है जो हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, सीआरसी ट्यूमरोइड विकास को कम करता है, और Lgr5 + आंतों के स्टेम सेल भेदभाव को बढ़ावा देताहै। हमने परीक्षण किया कि क्या एएवी 8-हेपेटोसाइट्स में कैंसर-निरोधक स्ट्रोमल जीन, इसएलआर के मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन, एएवी 8-इस्लर-उपचारित चूहों में सीआरसी ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का प्रदर्शन करके यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को क्षीण कर सकता है।

इस पेपर में, हम पहले जिगर उष्णकटिबंधीय एएवी की पूंछ शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। फिर, हम एएवी-उपचारित चूहों में ट्यूमरॉइड सेल तैयारी और पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। अंत में, हम स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए मेटास्टैटिक ट्यूमर प्रगति की निगरानी करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

इस लेख में सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और दक्षिण ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान संस्थान पशु नैतिकता समिति (अनुमोदन संख्या, SAM322) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. एडेनो से जुड़े वायरस की पूंछ नस इंजेक्शन

नोट: एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को जैव सुरक्षा स्तर 1 दिशानिर्देशों के तहत एक बायोहैजार्ड के रूप में संभाला जाना चाहिए। कृपया AAV तैयारी, शुद्धिकरण, और अनुमापन33 के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें। हेपेटोसाइट-ट्रॉपिक एएवी, एएवी 834, साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर-इस्लर जीन को एन्कोडिंग करते हुए, इस अध्ययनमें उपयोग किया गया था। एएवी-मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन को प्रेरित करने के लिए, एएवी खुराक को प्रमोटर गतिविधि, जीन और माउस वजन के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

  1. एएवी वेक्टर को 150 μL एलीकोट में पतला करें जिसमें 1.0 x 1011 वायरल जीनोम होते हैं, बाँझ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) का उपयोग करके और इसे बर्फ पर रखें। एएवी को संभालने के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने जाने चाहिए।
    नोट: बार-बार फ्रीज और पिघलने चक्र वायरस टिटर को कम कर देता है और इससे बचा जाना चाहिए। स्टॉक वायरल समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. 35 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करने के लिए एक हीट बॉक्स (पशु वार्मिंग कक्ष) को चालू करें।
  3. एक माउस पकड़ो और पूंछ नस इंजेक्शन से कम से कम 15 मिनट पहले पूंछ की पूरी लंबाई के लिए एक सामयिक संज्ञाहरण क्रीम लागू करें।
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है और आवश्यक नहीं हो सकता है यदि यह संस्थान की पशु नैतिकता समिति द्वारा आवश्यक नहीं है। स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करें। इस प्रयोग25 में, एक Rosa26-Cas9 माउस AAV इंजेक्शन और CRC organoids के बाद के पोर्टल नस इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह देखते हुए कि इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ट्यूमरोइड्स एक Rosa26-Cas9 माउस (C57BL / 6 x 129 आनुवंशिक पृष्ठभूमि) से व्युत्पन्न थे, इस माउस तनाव का उपयोग ट्यूमर प्रत्यारोपण के immunocompetent, syngeneic प्राप्तकर्ताओं के रूप में भी किया गया था। नर और मादा Rosa26-Cas9 चूहों (6- से 24 सप्ताह के पुराने) का उपयोग किया गया था।
  4. माउस को हीट बॉक्स में रखें। माउस को गर्म करने और पूंछ की नसों को फैलाने के लिए 15 मिनट तक छोड़ दें।
  5. धीरे से एक कृंतक अवरोधक में माउस को सुरक्षित. पूंछ नसों के पूर्ण फैलाव को सुनिश्चित करने के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे पूंछ रखें।
  6. पतला एएवी (चरण 1.1 में तैयार) के 150 μL को 27-30 जी सुई के साथ कम मृत स्थान बाँझ सिरिंज में तैयार करें।
  7. हीट लैंप को स्थानांतरित करें और पूंछ के किनारों पर स्थित पार्श्व पूंछ नस की पहचान करें। उंगलियों से पूंछ पर हल्का सा तनाव डालें ताकि पूंछ सीधी हो जाए।
  8. धीरे-धीरे सुई के 2-3 मिमी डालें, नस में बेवेल अप करें। सुई पूंछ के लगभग समानांतर होनी चाहिए (पूंछ से 15 डिग्री तक)।
    नोट: सिरिंज में रक्त प्रवाह देखा जा सकता है यदि सुई सफलतापूर्वक नस में स्थित है।
  9. धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। यदि एक प्रतिरोध महसूस किया जाता है या त्वचा की सूजन देखी जाती है, तो सुई को हटा दें और पहली साइट के ऊपर या अन्य पार्श्व शिरा में फिर से डालें।
  10. इंजेक्शन के पूरा होने के बाद लगभग 5 सेकंड तक प्रतीक्षा करें, और फिर धीरे-धीरे सुई को हटा दें। तुरंत एक साफ धुंध या कागज तौलिया के साथ इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए।
  11. धीरे से माउस को अपने पिंजरे में छोड़ दें। यह सुनिश्चित करने के लिए जानवर की निगरानी करें कि रक्तस्राव बंद हो गया है।
    नोट: जिगर में जीन overexpression AAV पूंछ नस इंजेक्शन के बाद 1 से 2 सप्ताह के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है। इसकी पुष्टि की जा सकती है, उदाहरण के लिए, सीटू संकरण (आईएसएच), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), पश्चिमी ब्लोटिंग, या मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) में आरएनए द्वारा; चित्रा 1A, B)। पहले प्रकाशित अध्ययन25 में, एएवी 8-इस्लर का उपयोग हेपेटोसाइट्स में माउस इस्लर जीन को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए किया गया था और आरएनए आईएसएच (चित्रा 1 ए, बी) द्वारा ओवरएक्सप्रेशन का पता लगाया गया था।

2. कोलोरेक्टल कैंसर organoids के लिए सेल तैयारी

नोट: इस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सीआरसी ऑर्गेनोइड्स में पूरी तरह से उपकला कोशिकाएं होती हैं। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और पीढ़ी को पहले25,35 वर्णित किया गया है। संक्षेप में, सामान्य कोलोनिक उपकला कोशिकाओं को एक रोसा 26-कैस 9 माउस के बृहदान्त्र से अलग किया गया था, जो बर्फ-ठंडे पीबीएस में एक क्रिप्ट अलगाव बफर (5 एमएम ईडीटीए (एथिलीनेडियामिनटेट्राएसीटेट) का उपयोग करता है), और फिर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में एम्बेडेड होता है, और संदर्भ35 में वर्णित ऑर्गेनोइड विकास माध्यम में सुसंस्कृत होता है। फिर, Apc और Trp53 उत्परिवर्तन को एकल-गाइड आरएनए को अतिरंजित करके कोलोनिक उपकला कोशिकाओं में पेश किया गया था जो Lentivirus अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल का उपयोग करके Apc और Trp53 को लक्षित करते हैं। एकल ऑर्गेनोइड क्लोनको 25 को चुना गया था। एकपीसीΠ/Πऔर Trp53Π/Π बृहदान्त्र कैंसर organoids (AP tumoroids), PBS के 100 μL में 5.0 x 105 एकल कोशिकाओं के रूप में इंजेक्ट किया गया था, जिसमें 10 μM Y-27632 माउस प्रति पोर्टल शिरा में, ऑर्गेनोइड संस्कृति और एकल-कोशिका तैयारी के साथ नीचे वर्णित किया गया था।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम गुंबदों में 24-अच्छी तरह से प्लेट या 10 सेमी डिश में सीआरसी ऑर्गेनोइड्स को 50-400 μm व्यास ऑर्गेनोइड्स प्राप्त करने के लिए पोर्टल शिरा इंजेक्शन से 3-5 दिन पहले संस्कृति करें।
  2. Y-27632 को 10 μM एकाग्रता में जोड़कर सेल टुकड़ी समाधान की पर्याप्त मात्रा तैयार करें, जो इंजेक्शन के लिए सुसंस्कृत किए जा रहे ऑर्गेनोइड्स की संख्या को पचाने के लिए पर्याप्त है। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्म.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला सेल टुकड़ी समाधान एक पुनः संयोजक सेल-पृथक्करण एंजाइम मिश्रण है और ऑर्गेनोइड संस्कृति में ट्रिप्सिन के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। यह ट्रिप्सिन36 की तुलना में सेल पृथक्करण के कारण सेलुलर क्षति को कम करता है। Y-27632 एक Rho kinase inhibitor है और पृथक्करण-प्रेरित सेल मृत्यु को रोकता है, जिससे एकल-सेल अस्तित्व37 बढ़ जाता है।
    1. पांच चूहों तक इंजेक्शन के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों के 10-24 x 50 μL को पचाने के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 40 मिलीलीटर युक्त दो ट्यूब तैयार करें, जिसमें प्रत्येक गुंबद में लगभग 300 ऑर्गेनोइड्स (50-400 μm व्यास) होते हैं, यानी, प्रत्येक माउस को ऑर्गेनोइड्स के 2-4.8 गुंबदों (लगभग 600-1440 ऑर्गेनोइड्स के बराबर) के साथ इंजेक्ट किया जाता है। पर्याप्त सेल संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक ऑर्गेनोइड्स की संख्या ऑर्गेनोइड लाइन पर निर्भर करती है, और इस प्रकार इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए।
      नोट: दूसरी 40 एमएल ट्यूब अलग-अलग एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ताजा सेल टुकड़ी समाधान के साथ एक दोहराने वाले पाचन को सक्षम बनाता है।
  3. प्रत्येक कुएं से ऑर्गेनोइड माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  4. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ-ठंडे पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। यदि 10 सेमी डिश का उपयोग किया जाता है, तो डिश में 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें।
  5. एक P1000 पिपेट टिप का उपयोग कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम से खरोंच. पीबीएस / मध्यम घोल को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स टुकड़े इकट्ठा करने के लिए पीबीएस की एक ही राशि के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला और 15 एमएल ट्यूब (ओं) में जोड़ें।
  7. बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह इनक्यूबेशन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को भंग करने में मदद करता है।
  8. 4 °C पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. छर्रेदार माध्यम और कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए सुनिश्चित करने वाले supernatant aspirate.
  10. गोली के लिए चरण 2.2 में तैयार पूर्व-गर्म सेल टुकड़ी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें, गोली को 10 बार फिर से निलंबित करें, और इसे ताजा, पूर्व-गर्म सेल टुकड़ी समाधान युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें।
  11. ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. 4 °C पर 3 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  13. चरण 2.9-2.11 दोहराएँ।
    नोट: बार-बार एंजाइमेटिक पाचन एकल कोशिकाओं में कुशल सेल पृथक्करण के लिए अनुमति देता है।
  14. जांचें कि ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेट में 100 μL को पिपेट करके और माइक्रोस्कोप के नीचे अवलोकन करके एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है या नहीं। यदि कई ऑर्गेनोइड्स चार से अधिक कोशिकाओं से मिलकर सेल क्लम्प दिखाते हैं, तो सेल डिटेचमेंट समाधान के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन और 10 एमएल पिपेट के साथ ट्राइटुरेशन द्वारा भौतिक पृथक्करण आवश्यक हो सकता है।
  15. एक बार जब अधिकांश कोशिकाएं एकल कोशिकाएं होती हैं, तो पाचन को रोकने के लिए 40 एमएल सेल निलंबन में 4 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जोड़ें। 5 एमएल पीबीएस के साथ एक 40 μm सेल छलनी कुल्ला।
  16. किसी भी सेल clumps को हटाने के लिए एक 50 mL संग्रह ट्यूब में सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें।
  17. 4 °C पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  18. Supernatant aspirate. सेल गोली के लिए ठंडा PBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें और इसे एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  19. 4 °C पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  20. Supernatant aspirate. 10 μM Y-27632 के साथ 500 μL ठंडे PBS में गोली resuspend. कोशिकाओं की गणना करें।
  21. सेल एकाग्रता को 5.0 x 105 एकल कोशिकाओं / 100 μL पर समायोजित करें, 10 μM Y-27632 के साथ PBS का उपयोग करके। ट्यूब को बर्फ पर रखें जब तक कि पोर्टल शिरा इंजेक्शन नहीं किया जाता है।
    नोट: पृथक्करण के 4 घंटे के भीतर विघटित कोशिकाओं को इंजेक्ट करने की सिफारिश की जाती है।

3. सीआरसी organoids के पोर्टल शिरा इंजेक्शन

नोट: सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों और सर्जिकल धुंधों को ऑटोक्लेव्ड या निष्फल किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉल17 से संशोधित किया गया है। इस प्रयोग25 में, पोर्टल शिरा इंजेक्शन Rosa26-Cas9 चूहों का उपयोग करके किया गया था, जो चरण 1 में AAV-mRuby2 या AAV-Islr के साथ इलाज किया गया था।

  1. हीटिंग पैड पर बाँझ ड्रेप्स का उपयोग करके एक एसेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।
  2. सर्जिकल उपकरणों (कैंची और संदंश), सर्जिकल और हेमोस्टेटिक स्पंज, 4-0 पॉलीग्लैक्टिन सीवन, कपास की कलियों, त्वचा स्टेपलर, स्टेपलर एप्लिकेटर, खारा, बुप्रेनोर्फिन, और 33 जी सुई एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी तैयार करें। हेमोस्टेटिक स्पंज को 1.0 सेमी x 1.0 सेमी टुकड़ों में काटें।
  3. सर्जिकल क्षेत्र को रोशन करने के लिए प्रकाश स्रोत की स्थिति को समायोजित करें।
  4. शल्य चिकित्सा दर्द प्रबंधन के लिए एक माउस के लिए चमड़े के नीचे buprenorphine के 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन इंजेक्ट करें।
  5. एक संज्ञाहरण कक्ष में isoflurane के साथ माउस anesthetize. प्रेरण और रखरखाव के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता आमतौर पर क्रमशः 5% और 2.5% होती है। अगली प्रक्रिया शुरू करने से पहले पैर की अंगुली चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति के लिए जाँच करें।
  6. एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ माउस के ऊपरी पेट के मध्य में शेव करें। शेविंग को साइट को दूषित करने वाले बालों से बचने के लिए एसेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र से दूर के क्षेत्र में किया जाना चाहिए।
  7. शल्य चिकित्सा क्षेत्र sterilize करने के लिए Betadine और 80% इथेनॉल के साथ बारी बारी चीरा साइट साफ. इसे तीन बार दोहराएं।
  8. रखरखाव isoflurane संज्ञाहरण के साथ एक सुपाइन स्थिति में एक हीटिंग पैड पर माउस जगह. माउस के पेट पर एक छेद के साथ एक सर्जिकल ड्रेप रखें।
  9. संदंश के साथ पेट की त्वचा को उठाएं और कैंची के साथ मिडलाइन पर 2-3 सेमी त्वचा चीरा बनाएं, केवल त्वचा को काटते हैं (अंतर्निहित पेरिटोनियम नहीं)। चीरा मध्य पेट से उरोस्थि की xiphoid प्रक्रिया तक होना चाहिए। चीरा xiphoid प्रक्रिया के निचले छोर से ऊपर नहीं जाना चाहिए।
  10. संदंश के साथ पेरिटोनियल दीवार को पूरी तरह से उठाएं और कैंची के साथ पेरिटोनियम के लिए एक समान 2-3 सेमी चीरा बनाएं। आंत और डायाफ्राम को काटने से बचें।
  11. सर्जिकल धुंध को गर्म खारा के साथ भिगोएं और इसे चीरा के बाईं ओर रखें (माउस के शरीर के बाईं ओर; सर्जन के दाईं ओर)।
  12. धीरे से आंतरिक अंगों (छोटी और बड़ी आंतों) को खारा के साथ भिगोए गए कपास की कली का उपयोग करके बाहर खींचें। आँतों को खारे से भिगोए हुए धुंध पर रखें।
    नोट: माउस की बाईं ओर की आंतों (यानी, सर्जन के दाईं ओर की आंतों) को पहले बाहर निकाला जाना चाहिए, और फिर माउस की दाईं ओर की आंतों (यानी, सर्जन के बाईं ओर की आंतों) को बाहर निकाला जा सकता है।
  13. पोर्टल नस की कल्पना करने के लिए आंतों की स्थिति को समायोजित करें। आंतों को नम रखने के लिए अतिरिक्त गीले धुंध के साथ आंतों को कवर करें।
  14. धीरे से गीले धुंध के साथ आंत को बाईं ओर खींचें और बाईं ओर कोमल तनाव लागू करें। यह पोर्टल शिरा (चित्रा 2 ए) के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है।
    नोट: यदि पोर्टल नस का विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल है, तो धीरे-धीरे एक गीली कपास की कली के साथ पेट की स्थिति को समायोजित करने से विज़ुअलाइज़ेशन में मदद मिल सकती है।
  15. धीरे पिपेट ट्यूमरॉइड निलंबन कई बार एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए। धीरे-धीरे सेल निलंबन के 100 μL को 33 जी सुई से जुड़े हैमिल्टन सिरिंज में खींचें। हवा के बुलबुले से बचें।
  16. धीरे-धीरे सुई डालें, पोर्टल नस में बेवल करें। सुई के साथ सम्मिलन गहराई 3-4 मिमी होनी चाहिए, जिसमें सुई कोण पोर्टल नस के लगभग समानांतर है।
    नोट: इंजेक्शन पोर्टल नस के अच्छी तरह से विज़ुअलाइज़ किए गए हिस्से में किया जाना चाहिए (आमतौर पर यकृत हिलम से 2 सेमी दूर तक)। पोर्टल नस में पूरी तरह से डालने के बाद सुई के आंदोलन से बचें।
  17. 30 s के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्ट करें। इंजेक्शन को धीरे-धीरे पोर्टल नस के रोड़ा को रोकने के लिए किया जाना चाहिए। यदि इंजेक्शन सफल होता है, तो जिगर का रंग अस्थायी रूप से लाल से सफेद हो जाता है।
  18. सुई को धीरे-धीरे हटा दें। तुरंत एक सूखी कपास की कली के साथ इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  19. कपास की कली को निकालें और साथ ही इंजेक्शन साइट पर एक हेमोस्टेटिक स्पंज लागू करें। एक कपास की कली या संदंश के साथ हेमोस्टेटिक स्पंज पकड़ो और 5 और मिनट के लिए कोमल दबाव लागू होते हैं।
  20. हेमोस्टैटिक स्पंज पर दबाव को हटा दें और पुष्टि करें कि इंजेक्शन साइट से कोई रक्तस्राव नहीं हुआ है।
    नोट: जैव अवशोषित हेमोस्टैटिक स्पंज को हटाने की आवश्यकता नहीं है। धुंध को हटाने की कोशिश करने से इंजेक्शन साइट से फिर से रक्तस्राव हो सकता है।
  21. यदि रक्तस्राव होता है, तो तुरंत लगभग 10 मिनट के लिए कपास की कली के साथ दबाव हेमोस्टेसिस करें। फिर, एक और 5 मिनट के लिए एक अतिरिक्त हेमोस्टेटिक स्पंज लागू करें।
    नोट: यदि बेकाबू रक्त की कमी देखी जाती है, तो माउस को संस्थान की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार euthanized किया जाना चाहिए।
  22. आंतों पर सर्जिकल धुंध को हटा दें। 5 एमएल खारा से भरा एक सिरिंज का उपयोग करना, अंग आसंजन को रोकने के लिए आंतों के लिए खारा धारा निकलना।
    नोट: पोर्टल शिरा इंजेक्शन साइट के लिए खारा लागू न करें। इससे फिर से रक्तस्राव हो सकता है।
  23. धीरे से आंतों को पेट की गुहा के अंदर वापस रखें।
  24. 4-0 polyglactin टांके का उपयोग कर पेरिटोनियम सीवन.
  25. संदंश के साथ त्वचा के दोनों किनारों को ऊपर उठाएं। त्वचा चीरा बंद करने के लिए त्वचा स्टेपलर लागू करें। सावधान रहें कि आंत को स्टेपल न करें।
  26. आइसोफ्लुरेन को बंद कर दें लेकिन ऑक्सीजन प्रवाह को चालू रखें। माउस की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। जब माउस जागता है, तो माउस को हीटिंग पैड पर एक खाली पिंजरे में रखें। माउस आमतौर पर 5 मिनट के भीतर जागता है।
  27. ध्यान से माउस की निगरानी करें जब तक कि यह सचेत न हो जाए और सामान्य रूप से एम्बुलेट न हो।
  28. चमड़े के नीचे 0.1 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine माउस को इंजेक्शन सर्जरी के 4 घंटे के बाद.
  29. बाद के 2 दिनों के लिए हर 24 घंटे में माउस को 0.1 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्ट करें।
  30. सर्जरी के बाद एक सप्ताह के लिए चूहों की दैनिक निगरानी करें। टांके और घाव भरने की जांच करें।
  31. सर्जरी के बाद के दिनों में, एक स्टेपलर रिमूवर का उपयोग करके त्वचा स्टेपलर को हटा दें।

4. विवो bioluminescent इमेजिंग में द्वारा ट्यूमर विकास कैनेटीक्स का आकलन

नोट: यदि फायरफ्लाई-व्यक्त ट्यूमरोइड्स का उपयोग इंजेक्शन के लिए किया जाता है, तो मेटास्टैटिक ट्यूमर की प्रगति को वीवो इमेजिंग में साप्ताहिक रूप से मॉनिटर किया जा सकता है जैसा कि38,39 वर्णित है। कैंसर कोशिकाओं द्वारा व्यक्त लूसिफेरस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त कर सकता है और ट्यूमर के विकासको सीमित कर सकता है। इस प्रकार, लूसिफेरस-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करके माउस मॉडल में प्रतिरक्षा फेनोटाइप और कैंसर की प्रगति का विश्लेषण करने में सावधानी बरती जाती है।

  1. बाँझ पीबीएस का उपयोग करके डी-लूसिफेरिन का 30 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें। इसे प्रकाश से बचाएं। डी-लूसिफेरिन को उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक शेवर के साथ पेट और वक्ष को शेव करें। यह वीवो इमेजिंग में 1 दिन पहले तक किया जा सकता है।
  3. चूहों में डी-लूसिफेरिन इंट्रापेरिटोनियल रूप से 150 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन को इंजेक्ट करें (यानी, यदि माउस के शरीर का वजन 30 ग्राम है, तो डी-लूसिफेरिन समाधान के 150 μL इंजेक्ट करें)।
  4. चूहों को एक संज्ञाहरण कक्ष में रखें और उन्हें एनेस्थेटिक करें। प्रेरण के लिए आइसोफ्लुरेन का 5% और रखरखाव के लिए 2% -3% का उपयोग करें।
  5. मिनट बाद में, चूहों को एक पार्श्व स्थिति में रखें (दाईं ओर ऊपर)। पहले38,39 वर्णित के रूप में एक इन विवो इमेजिंग सिस्टम (IVIS) का उपयोग करके bioluminescence छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: चूहों सुपाइन स्थिति की तुलना में एक पार्श्व स्थिति में अधिक स्थिर हैं। इसलिए, एक पार्श्व स्थिति एक सुसंगत फोकल विमान से एक luminescence छवि प्राप्त करने के लिए बेहतर है।
  6. चूहों को एक खाली पिंजरे में रखें और उनकी वसूली की निगरानी करें।
  7. 38 के रूप में वर्णित के रूप में लिविंग इमेज सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऊपरी पेट पर ब्याज के क्षेत्रों को परिभाषित करें। ट्यूमर सेल संख्या के लिए एक सरोगेट के रूप में कुल फ्लक्स की मात्रा निर्धारित करें।

5. उत्तरजीविता विश्लेषण और ऊतक संग्रह

  1. मेटास्टेसिस के नैदानिक लक्षणों के लिए चूहों की सावधानीपूर्वक निगरानी करें जैसे कि एक अव्यवस्थित पेट।
  2. एक बार जब यह मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच जाता है तो सीओ2 साँस लेना द्वारा माउस को Euthanize करें।
    नोट: संस्थान की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित एक अध्ययन समापन बिंदु का उपयोग करें। एक मानवीय समापन बिंदु निर्धारित करने के लिए, एक नैदानिक रिकॉर्ड शीट का उपयोग किया गया था; निम्नलिखित टिप्पणियों में से प्रत्येक की उपस्थिति के लिए दिए गए एक बिंदु द्वारा स्कोर की गणना की गई थी: वजन घटाने > 15%, कूबड़ मुद्रा, रफल्ड कोट, निर्जलीकरण, आंदोलन में कमी, विघटित पेट, या चेहरे की चमक। एक बार 3 का स्कोर पहुंचने के बाद, चूहों को मानवीय रूप से euthanized किया गया था।
  3. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, एक धुएं के हुड में 10% फॉर्मेलिन के 30-50 मिलीलीटर के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन फिक्सेशन करें, जैसा कि41 वर्णित है। रक्त और फॉर्मेलिन के लिए आउटलेट उत्पन्न करने के लिए परफ्यूजन से पहले जिगर के सामान्य हिस्से में कैंची के साथ कई छोटे चीरों (प्रत्येक 1 सेमी तक) बनाएं। परफ्यूजन पर, जिगर का रंग लाल से भूरे रंग में बदल जाएगा।
    नोट: यदि मैक्रोस्कोपिक रूप से सामान्य जिगर क्षेत्रों में माइक्रोमेटास्टेसिस अध्ययन का विषय हैं, तो हम शोधकर्ताओं को जिगर में कटौती नहीं करने की सलाह देते हैं, बल्कि इसके बजाय बेहतर वेना कावा को स्निप करने के लिए। हालांकि, जब हमने इस विधि का उपयोग किया है, तो जिगर को काटने की तुलना में जिगर का निर्धारण गरीब लगता है। विशेष रूप से अगर आरएनए इन सीटू संकरण (आईएसएच) को यकृत वर्गों पर किए जाने की योजना बनाई गई है, तो हम फॉर्मेलिन के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन से पहले जिगर में चीरों को बनाने की सलाह देते हैं, जैसा कि ऊपर वर्णित है। यह जिगर के ऊतकों के पर्याप्त निर्धारण को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप आईएसएच के लिए आरएनए अखंडता का संरक्षण होता है।
  4. जिगर और फेफड़ों के ऊतकों को 10% फॉर्मेलिन में रखें और रात भर ठीक करें। फॉर्मेलिन को 70% इथेनॉल के साथ बदलें, इसके बाद पैराफिन-एम्बेडिंग।
  5. हिस्टोलॉजिकल रूप से ट्यूमर क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन स्टेनिंग करें। ब्याज के स्ट्रोमल मार्करों के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करें। कोलेजन-सकारात्मक क्षेत्रों का मूल्यांकन करने के लिए पिक्रो-सिरस रेड स्टेनिंग करें।
    नोट: ImageJ सॉफ़्टवेयर42 immunohistochemistry और Picro-Sirius Res धुंधला डेटा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक रंग deconvolution समारोह और एमआरआई फाइब्रोसिस उपकरण का उपयोग क्रमशः 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-सकारात्मक क्षेत्रों और पिक्रो-सिरियस लाल-सकारात्मक क्षेत्रों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

एक ट्यूमर-निरोधक स्ट्रोमल जीन के एएवी-मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन को प्रेरित करने के लिए, हेपेटोसाइट्स में, Islr 4,25,43,44, हम अंतःशिरा रूप से Islr-एन्कोडिंग AAV8 को इंजेक्ट करते हैं। 1.0 x 1011 AAV8-Islr के वायरल जीनोम (vg), या एक नियंत्रण के रूप में, AAV8-mRuby2, वयस्क माउस पूंछ नस (चित्रा 1A) में इंजेक्ट किया गया था। पूंछ नस इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, हेपेटोसाइट्स में Islr के overexpression को मान्य करने के लिए जिगर काटा गया था। हमने सीटू संकरण45 में आरएनएस्कोप का प्रदर्शन किया और पुष्टि की कि 3,3'-डायमिनोबेंजिडीन (डीएबी) + सिग्नल पूरे जिगर (चित्रा 1 बी) में देखे गए थे। AAV8-mRuby2-उपचारित माउस से जिगर में कोई DAB + संकेत नहीं पाए गए थे।

हमने भारत स्याही (पीबीएस में 1: 1000 कमजोर पड़ने) को इंजेक्ट करके पोर्टल शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया का अभ्यास किया। ऊपरी पेट में एक चीरा बनाने के बाद, आंतों को धीरे-धीरे पेट की जगह से बाहर निकाला गया था ताकि पोर्टल नस के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिल सके (चित्रा 2 ए)। भारत स्याही के पोर्टल नस इंजेक्शन ने पूरे जिगर में स्याही को वितरित किया, लेकिन फेफड़ों को नहीं (चित्रा 2 बी)। यदि स्याही को गलती से अन्य जहाजों जैसे कि अवर वेना कावा (आईवीसी) या पेट की महाधमनी में इंजेक्ट किया जाता है, तो स्याही का प्रणालीगत परिसंचरण फेफड़ों के रंग को काले रंग में बदल देता है। भारत स्याही पोर्टल नस से रिसाव की मात्रा की पहचान करने में भी मदद करती है, जो अग्नाशय या पेरिटोनियल प्रसार को इंगित करती है।

AAV-mRuby2 की पूंछ शिरा इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, ApcΠ/Π और Trp53Π/Π बृहदान्त्र कैंसर ऑर्गेनोइड्स (AP tumoroids) को एकल कोशिकाओं से अलग कर दिया गया और माउस पोर्टल शिरा (चित्रा 3A) में इंजेक्ट किया गया। मेटास्टैटिक ट्यूमर के विकास की पुष्टि करने और हिस्टोलॉजी का मूल्यांकन करने के लिए, हमने पोर्टल शिरा इंजेक्शन के 3-4 सप्ताह बाद लिवर एकत्र किए (यानी, एक मानवीय समापन बिंदु के बजाय एक समयबद्ध बिंदु पर), इससे पहले कि प्रमुख नेक्रोसिस हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषणों को भ्रमित करता है। मैक्रोस्कोपिक रूप से, ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन के परिणामस्वरूप जिगर में कई सफेद ट्यूमर नोड्यूल (चित्रा 3 बी) हुए। हमने पाया कि ट्यूमरोइड्स की एक ही सेल संख्या के इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन ने एक बड़े मेटास्टैटिक ट्यूमर द्रव्यमान को उत्पन्न नहीं किया। इससे पता चलता है कि पोर्टल शिरा इंजेक्शन इंट्रा-प्लीहा इंजेक्शन मॉडल की तुलना में अधिक कुशलता से प्रेरित यकृत मेटास्टेसिस को प्रेरित करता है। पोर्टल शिरा इंजेक्शन द्वारा प्रेरित सीआरसी हेपेटिक मेटास्टेसिस के हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन स्टेनिंग ने एक डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया और परिगलन (चित्रा 3 सी) के साथ मध्यम विभेदित ट्यूबलर एडेनोकार्सिनोमा के हिस्टोपैथोलॉजी का प्रदर्शन किया। इस स्ट्रोमा-समृद्ध हिस्टोलॉजी ने मानव सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस (चित्रा 3 सी) के बारे में ईमानदारी से दोहराया, जिससे यह मॉडल मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा की जांच करने वाले ट्रांसलेशनल शोध के लिए उपयुक्त हो गया। इसके अलावा, अल्फा-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (αSMA) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, सीएएफ के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर, ने दिखाया कि ट्यूमर क्षेत्रों का लगभग 7% αSMA-सकारात्मक था, जो इस माउस मॉडल (चित्रा 3 डी, ई) में सीएएफ की उपस्थिति की पुष्टि करता है। पिक्रो-सिरियस लाल धुंधला है कि दाग कोलेजन46 ट्यूमर mesenchyme में प्रचुर मात्रा में ईसीएम का प्रदर्शन किया ट्यूमर क्षेत्रों के लगभग 13% कोलेजन के लिए सकारात्मक (चित्रा 3 डी, ई) के साथ. EPCAM के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एक उपकला वंश मार्कर, से पता चला कि मेटास्टैटिक सीआरसी ने ट्यूमर नवोदित (एक एकल ट्यूमर सेल या चार ट्यूमर कोशिकाओं तक का एक सेल क्लस्टर) दिखाया जो खराब रोग निदान कोलोरेक्टल कैंसर47 (चित्रा 3 एफ) की विशेषता है। मेटास्टैटिक सीआरसी में Ki67 लेबलिंग इंडेक्स लगभग 80% था, यह दर्शाता है कि अधिकांश ट्यूमर कोशिकाएं माइटोटिक रूप से सक्रिय हैं (चित्रा 3 जी, एच)।

हमने इस प्रीक्लिनिकल मॉडल में माउस उत्तरजीविता और ट्यूमर विकास कैनेटीक्स विश्लेषण किया। हमारे पहले पायलट कोहोर्ट में चूहों ने पोर्टल नस (एन = 4 चूहों) में ट्यूमरोइड इंजेक्शन के बाद 57 दिनों का एक औसत अस्तित्व दिखाया; चित्रा 4A)। यह बाद में बड़े नियंत्रण AAV8-mRuby2-injected समूहों 25 में दोहराया गया था। मानवीय समापन बिंदु पर (जैसा कि नोट, चरण 5.2 में दिखाया गया है), पायलट समूह में 4 चूहों में से 3 ने जलोदर का प्रदर्शन किया, जो उन्नत यकृत मेटास्टेसिस48 वाले रोगियों में भी मनाया जाता है। ट्यूमर के विकास का आकलन करने के लिए, विवो इमेजिंग सिस्टम (IVIS) में ट्यूमरोइड-व्युत्पन्न luminescence (चित्रा 4B, C) को मापने के लिए उपयोग किया गया था। ऊपरी पेट के भीतर बायोल्यूमिनेसेंस संकेतों को देखा गया था, जो यकृत-विशिष्ट ट्यूमर के विकास का सुझाव देता है (चित्रा 4 बी)। यदि IVIS संकेत निचले पेट में देखे जाते हैं, तो यह पेट के अंगों के लिए पेरिटोनियल प्रसार या माध्यमिक मेटास्टेसिस को इंगित करता है। वीवो इमेजिंग में साप्ताहिक ने प्रत्येक माउस (चित्रा 4 सी) में ट्यूमर के विकास के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए अनुमति दी, जिससे हमारे बाद के बड़े अध्ययन में चिकित्सीय प्रभाव की निगरानी करना आसान हो गया। ट्यूमर लेने की दर 100% (4/4 चूहों) के रूप में IVIS संकेतों द्वारा मूल्यांकन किया गया था। इस प्रयोग में, ऊतक संग्रह (0/4 चूहों) के समय कोई मैक्रोस्कोपिक रूप से स्पष्ट फेफड़ों का मेटास्टेसिस नहीं देखा गया था।

अंत में, हमने जांच की कि क्या एएवी-मध्यस्थता हेपेटोसाइट-निर्देशित प्रसव एक कैंसर-निरोधक सीएएफ जीन, Islr 4,25, इस प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में सीआरसी हेपेटिक मेटास्टेसिस विकास को रोक सकता है। विशेष रूप से, AAV8-Islr-उपचारित चूहों ने माउस के अस्तित्व में सुधार दिखाया और ट्यूमर (चित्रा 5A-C) 25 से IVIS संकेतों को कम कर दिया। फॉस्फोराइलेटेड Smad1/5/8 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने प्रदर्शित किया कि आईएसएलआर के हेपेटोसाइट ओवरएक्सप्रेशन, एक बीएमपी सिग्नलिंग पोटेंशिएटर, मेटास्टैटिक ट्यूमर में संवर्धित बीएमपी सिग्नलिंग (चित्रा 5 डी)। AAV8-Islr के साथ उपचार ने CRC हेपेटिक मेटास्टेसिस (चित्रा 5E) में Ki67 + proliferating कोशिकाओं की संख्या को कम कर दिया। परिणामों के पूर्ण विवरण के लिए, कोबायाशी एट अल. , गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, 202125 देखें। हमारे सामूहिक डेटा से संकेत मिलता है कि एएवी 8-हेपेटोसाइट्स के लिए ट्यूमर-निरोधात्मक जीन की मध्यस्थता वितरण, यकृत मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा29 का एक महत्वपूर्ण घटक, सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस (चित्रा 5 एफ) के लिए एक प्रभावी निवारक / चिकित्सीय दृष्टिकोण हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: पूंछ शिरा प्रशासित AAV8-Islr जिगर में Islr overexpression उत्पन्न करता है। (ए) एएवी 8 के टेल वेन इंजेक्शन को दर्शाने वाली प्रयोगात्मक योजना, इसके बाद कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन द्वारा पीछा किया जाता है। ISH, सीटू संकरण में; आईएचसी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; QRT-PCR, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया। (बी) प्रतिनिधि चित्र। Islr के लिए सीटू संकरण में आरएनए AAV8-Islr या AAV8-mRuby2-उपचारित चूहों से जिगर का उपयोग करके किया गया था। जिगर पूंछ नस इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद एकत्र किए गए थे। स्केल बार्स, 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: भारत स्याही के पोर्टल शिरा इंजेक्शन के परिणामस्वरूप इसकी डिलीवरी जिगर में होती है, लेकिन फेफड़े को नहीं। (ए) प्रतिनिधि चित्र लैप्रोटॉमी के बाद ऊपरी पेट की शारीरिक रचना को दिखाते हैं। ध्यान दें कि, पोर्टल नस के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, आंतों को उदर गुहा के बाहर ले जाया जाता है। दाएं हाथ की तरफ की तस्वीर प्रत्येक अंग और पोत की एक शारीरिक एनोटेशन दिखाती है। पीला तीर इंजेक्शन साइट को दर्शाता है। IVC, अवर वेना कावा. (बी) भारत स्याही के पोर्टल नस इंजेक्शन के बाद जिगर और फेफड़ों के प्रतिनिधि चित्र। पीले एरोहेड्स भारत की स्याही से सना हुआ जहाजों को इंगित करते हैं। स्केल सलाखों, 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स का पोर्टल शिरा इंजेक्शन स्ट्रोमा-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। (A) प्रयोगात्मक योजना जो ApcΠ/Π और Trp53के पोर्टल शिरा इंजेक्शन को दर्शाती है। स्केल बार, 200 μm. T, tumoroids. (बी) जिगर के प्रतिनिधि मैक्रोस्कोपिक चित्र जो पोर्टल शिरा इंजेक्शन (बाएं) या इंट्रा-प्लीहा इंजेक्शन (दाएं) के 3-4 सप्ताह बाद एकत्र किए गए थे। 5.0 x 10 एपी ट्यूमरोइड्स से5 एकल कोशिकाओं को पोर्टल नस या प्लीहा में इंजेक्ट किया गया था। इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन13 के रूप में वर्णित किया गया था। सफेद नोड्यूल ट्यूमर का संकेत देते हैं। टी, ट्यूमर; एन, सामान्य जिगर। (सी) प्रतिनिधि hematoxylin और eosin (एच एंड ई) पोर्टल शिरा इंजेक्शन माउस मॉडल (बाएं और मध्य) और मानव (दाएं) से सीआरसी जिगर मेटास्टेसिस के धुंधला चित्रों धुंधला. टी, ट्यूमर; एन, सामान्य जिगर; एस, स्ट्रोमा; नेक, नेक्रोसिस। पीली बिंदीदार रेखा ट्यूमर और सामान्य जिगर (बाएं) के बीच एक सीमा को इंगित करती है। (D और E) अल्फा-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (αSMA; बाएं) और पिक्रो-सिरियस लाल धुंधला (दाएं) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)। (d) प्रतिनिधि चित्र। (ई) αSMA-सकारात्मक क्षेत्रों (बाएं) और पिक्रो-सिरियस रेड-पॉजिटिव क्षेत्रों (दाएं) का परिमाणीकरण। एन = 4 चूहों, 5 एचपीएफ (उच्च शक्ति क्षेत्र; 400x)/ माउस। (एफ) प्रतिनिधि तस्वीर EPCAM, एक उपकला सेल मार्कर के लिए immunohistochemistry दिखा. हरे रंग की बिंदीदार रेखाएं ट्यूमर नवोदित को निरूपित करती हैं। (G और H) Ki67 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एक सेल प्रसार मार्कर। (छ) प्रतिनिधि चित्र। (एच) कुल उपकला कोशिकाओं में Ki67+ कोशिकाओं का प्रतिशत। उपकला कोशिकाओं को हेमेटोक्सिलिन काउंटरस्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी। एन = 4 चूहों, 5 एचपीएफ / माउस। (बी) - (एच) में, सभी माउस जिगर के ऊतकों को एपी ट्यूमरोइड्स के इंजेक्शन के 3-4 सप्ताह बाद एकत्र किया गया था। मतलब ± S.E.M. प्रत्येक बिंदु माउस (ई और एच) से 5 एचपीएफ के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार 1 सेमी (बी), 1 मिमी (सी; बाएं), 100 μm (C; मध्य और दाएं), और 50 μm (D, F, और G) का प्रतिनिधित्व करते हैं। ध्यान दें कि मानव ऊतकों के साथ अध्ययन को नागोया विश्वविद्यालय ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन (2017-0127) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उत्तरजीविता विश्लेषण और ट्यूमर विकास गतिज विश्लेषण विवो इमेजिंग में द्वारा। (ए) कपलान-मीयर उत्तरजीविता घटता है। एन = 4 चूहे। (B, C) विवो इमेजिंग सिस्टम (IVIS) में ट्यूमर विकास कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया था। (b) एक प्रतिनिधि चित्र। लाल बॉक्स में क्षेत्र का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया गया था। (c) विकास कैनेटीक्स। प्रत्येक माउस से लूसिफेरस सिग्नल दिखाए जाते हैं। एन = 4 चूहे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एएवी 8-हेपेटोसाइट्स के लिए आईएसएलआर की मध्यस्थता जीन वितरण बीएमपी सिग्नलिंग को बढ़ाता है, ट्यूमर प्रसार को कम करता है, और सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस के पोर्टल नस इंजेक्शन मॉडल में माउस के अस्तित्व में सुधार करता है। (ए) कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र। AAV-Islr या AAV-mRuby2 के पूंछ शिरा इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, CRC tumoroids के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का प्रदर्शन किया गया था। (B और C) ट्यूमरोइड-व्युत्पन्न लूसिफेरस संकेतों का मूल्यांकन आईवीआईएस का उपयोग करके किया गया था। (बी) प्रतिनिधि चित्र। (ग) आईवीआईएस संकेतों का परिमाणीकरण। N = 5 (AAV-mRuby2) और 8 (AAV-Islr) चूहे। मतलब ± S.E.M. (डी) प्रतिनिधि चित्रों. फॉस्फोराइलेटेड Smad1/5/8 (pSmad1/5/8) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)। Smad1/5/8 हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMP) सिग्नलिंग का एक डाउनस्ट्रीम अणु है जो BMP सिग्नलिंग सक्रियण49 पर फॉस्फोराइलेटेड है। एन = 4 चूहों प्रत्येक। (ई) प्रतिनिधि चित्र। Ki67 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। एन = 4 चूहों प्रत्येक। (च) ग्राफ़िकल सारांश। एएवी-मध्यस्थता हेपेटोसाइट-निर्देशित जीन वितरण एक कैंसर-निरोधक स्ट्रोमल जीन सीआरसी मेटास्टेजेनेसिस को बाधित करने के लिए एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में काम कर सकता है। एएवी 8-हेपेटोसाइट्स में आईएसएलआर के मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन ने बीएमपी सिग्नलिंग और सीमित सीआरसी मेटास्टेसिस प्रगति को बढ़ाकर मेटास्टैटिक आला को फिर से तैयार किया। विस्तृत जानकारी के लिए, कोबायाशी एट अल. गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, 202125 देखें। लॉग-रैंक टेस्ट (ए), और दो-तरफ़ा दोहराए जाने वाले-उपायएनोवा (विचरण का विश्लेषण) सप्ताह 3 (सी) में पोस्ट-हॉक सिदक के कई तुलना परीक्षण के साथ। स्केल बार, 50 μm. चित्रा 5A-C को गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, Vol 160(4), कोबायाशी एट अल., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 और ISLR Drives कोलोरेक्टल कार्सिनोजेनेसिस, पेज 1224-1239.e30, कॉपीराइट (2021) से पुनर्मुद्रित किया गया है, एल्सेवियर की अनुमति के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि माउस सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन को फिर से विकसित किया जाता है जो फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है जो मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं की नकल करता है। इसके अलावा, जब एएवी 8-मध्यस्थता जीन थेरेपी जैसे स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय के साथ संयुक्त किया जाता है, तो यह प्रीक्लिनिकल मॉडल माउस अस्तित्व और ट्यूमर के विकास पर चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है।

प्रोटोकॉल में कम से कम दो महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, ऑर्गेनोइड्स को पूरी तरह से ट्रिप्सिनाइज़ करके और सेल क्लंप्स को हटाने के लिए एक जाल फ़िल्टर का उपयोग करके ट्यूमरोइड्स का एक एकल-सेल निलंबन तैयार करना महत्वपूर्ण है। ट्यूमरोइड्स के अपूर्ण पृथक्करण के परिणामस्वरूप बड़े सेल एकत्रीकरण होते हैं, जिनमें से इंजेक्शन पोर्टल नस को रोक सकता है। यह जिगर और जानवरों की मृत्यु के रोधगलन का कारण बनताहै 22. दूसरे, पोर्टल शिरा इंजेक्शन के दौरान, पोर्टल नस से रक्तस्राव को कम करना आवश्यक है। सुई को पोर्टल नस में ठीक से डाला जाना चाहिए। पोर्टल नस के दूसरी तरफ के पंचर से बचने के लिए, डाली गई सुई के कोण को पोर्टल नस के लगभग समानांतर रखा जाना चाहिए। इंजेक्शन के दौरान पोर्टल नस के फाड़ने को रोकने के लिए, सुई को पोर्टल नस में पूरी तरह से डालने के बाद स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए। पोर्टल नस से सुई को हटाने के तुरंत बाद, कम से कम 5 मिनट के लिए कपास की कली के साथ इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करना महत्वपूर्ण है।

इंजेक्शन के लिए सेल नंबर को प्राप्तकर्ता माउस (जैसे, immunocompetent बनाम immunodeficient माउस) और organoid लाइन की tumorigenicity के अनुसार संशोधित करने की आवश्यकता है। हमारे प्रयोगों में, 100 μL निलंबन में5.0 x 10 5 एकल कोशिकाओं का इंजेक्शन immunocompetent चूहों में जिगर मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त था। सेल संख्या बढ़ाने से पोर्टल नस में एम्बोलिज्म के जोखिम और जानवरों की मृत्यु14 बढ़ सकती है, और इस प्रकार सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। यह देखते हुए कि पिछले कागजात पोर्टल या mesenteric नस 25,26,27,28 में tumoroid इंजेक्शन के लिए 100 μL में5 x 104 से 5 x 10 5 कोशिकाओं का उपयोग किया, हम मानते हैं कि यह सेल संख्या सीमा अनुकूलन के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु होगा।

पोर्टल शिरा इंजेक्शन दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह सीआरसी मेटास्टैजेनेसिस के पूरे कैस्केड को पूरी तरह से पुनरावृत्ति नहीं करता है। कैंसर के यकृत मेटास्टेसिस के लिए पांच प्रमुख चरणों की आवश्यकता होती है: (1) प्राथमिक साइट पर कैंसर सेल आक्रमण, (2) पोत में इंट्रावेसेशन, (3) पोर्टल परिसंचरण में सेल अस्तित्व, (4) पोर्टल शिरा से जिगर पैरेन्काइमा तक बहिष्करण, और (5) मेटास्टैटिक आला50 में उपनिवेशीकरण। पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल केवल चरणों (3) -(5) की जांच की अनुमति देता है। अन्य मेटास्टैटिक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, इन विट्रो मॉडल और / या एक Notch1-उत्परिवर्ती प्राथमिक सीआरसी माउस मॉडल जैसे अन्य मॉडलों का उपयोग करना आवश्यक है जो अक्सर जिगर51 को मेटास्टेसाइज़ करता है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में पोर्टल शिरा इंजेक्शन विधि के महत्व में यकृत-विशिष्ट विकास और उच्च ट्यूमर बोझ शामिल है। अन्य इंजेक्शन मॉडल में पेरिटोनियल प्रसार और प्राथमिक सीआरसी मॉडल में प्राथमिक ट्यूमर विकास यकृत मेटास्टेसिस प्रगति के विश्लेषण को भ्रमित कर सकता है। इसके विपरीत, हमारा पोर्टल शिरा दृष्टिकोण तेजी से यकृत-विशिष्ट ट्यूमर उत्पन्न करता है, जीवित रहने और ट्यूमर के विकास के विश्लेषण को सरल बनाता है।

सेल लाइन इंजेक्शन पर ऑर्गेनोइड प्रत्यारोपण का एक प्रमुख लाभ यह है कि ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन ने फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट उत्पन्न किया जो मानव मेटास्टैटिक सीआरसी की एक डेस्मोप्लास्टिक विशेषता को फेनोपी करता है। ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थिति ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की विशेषताओं को दोहराती है और आंतों के स्टेम सेल आबादी का समर्थन करती है, जिसमें विकास कारकों24,52 के परिभाषित संयोजन के साथ एक समृद्ध और जटिल 3 डी ईसीएम में कोशिकाओं को एम्बेड करना शामिल है। इसके परिणामस्वरूप ट्यूमर सेल प्रसार इस तरह से होता है जो स्रोत ट्यूमर52,53 के आनुवंशिक परिदृश्य को संरक्षित करता है। इसके विपरीत, ट्यूमर सेल लाइनों की पारंपरिक 2 डी संस्कृति क्लोनल चयन और अनियमित जीनोमिक / ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों से जुड़ी हुई है जो मूल कैंसरकी विशेषताओं को ईमानदारी से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। हम अनुमान लगाते हैं कि कैंसर सेल लाइनों की 2 डी संस्कृति के लिए अपेक्षाकृत कठोर संस्कृति की स्थिति कोशिकाओं को ईसीएम / विकास कारक संकेतों की कमी के अनुकूल होने के लिए मजबूर करती है जिसके परिणामस्वरूप विवो में स्ट्रोमा-गरीब ट्यूमर हो सकते हैं, क्योंकि कोशिकाओं को अब जीवित रहने के लिए स्ट्रोमा-व्युत्पन्न संकेतों की आवश्यकता नहीं होती है।

एएवी 8-मध्यस्थता जीन थेरेपी के साथ ऑर्गेनोइड पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल के संयोजन से, हमने पाया कि यकृत में कैंसर सेल उपनिवेशीकरण से पहले हेपेटोसाइट्स के लिए कैंसर-निरोधात्मक पेलोड का वितरण सीआरसी मेटास्टेसिस विकासको बाधित करने के लिए (पूर्व-) मेटास्टैटिक आला को संशोधित कर सकता है। उत्साहजनक रूप से, नैदानिक परीक्षणों ने दिखाया है कि जिगर में विवो जीन हस्तांतरण में एएवी-मध्यस्थता एक ट्रांसजीन की दीर्घकालिक अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है और गैर-नियोप्लास्टिक आनुवंशिक बीमारियों के इलाज के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित तरीका हो सकताहै 30,31,55। भविष्य में, एएवी दृष्टिकोण के माध्यम से यकृत मेटास्टेसिस को रोकने के लिए हेपेटोसाइट्स का दोहन करने से मेटास्टेसिस के उच्च जोखिम वाले कैंसर रोगियों में संभावित नैदानिक मूल्य हो सकता है।

संक्षेप में, हमारे पेपर से पता चलता है कि पोर्टल नस के माध्यम से सीआरसी ऑर्गेनोइड प्रत्यारोपण फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है, जिसे स्ट्रोमा को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए शोषण किया जा सकता है। एएवी-मध्यस्थता जीन वितरण जैसे स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा के साथ पोर्टल शिरा इंजेक्शन को युग्मन करके, कोई भी सीआरसी मेटास्टेसिस प्रगति को रोकने के लिए उपन्यास स्ट्रोमल लक्ष्यों की पहचान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (APP1156391 से D.L.W., S.L.W.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (APP1081852 करने के लिए D.L.W., APP1140236 S.L.W., APP1099283 करने के लिए D.L.W.,); कैंसर काउंसिल एसए बीट कैंसर परियोजना अपने दाताओं और स्वास्थ्य विभाग के माध्यम से दक्षिण ऑस्ट्रेलिया की राज्य सरकार की ओर से (MCF0418 S.L.W., D.L.W.) के माध्यम से; जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा कमीशन किए गए वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (20H03467 से एमटी) के लिए अनुदान-इन-एड; AMED-CREST (चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी, विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए कोर अनुसंधान (19gm0810007h0104 और 19gm1210008s0101 से A.E.); कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए परियोजना (P-CREATE) AMED से (19cm0106332h0002 से A.E.); युवा शोधकर्ताओं के लिए विज्ञान विदेशी चुनौती कार्यक्रम के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (एच.के.), टेकेडा साइंस फाउंडेशन फैलोशिप (एच.के.), ग्रेटन इंटरनेशनल पीएचडी छात्रवृत्ति (एच.के.के.के.), लायंस मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन छात्रवृत्ति (के.जी.)।

हम वेक्टर और जीनोम इंजीनियरिंग सुविधा (वीजीईएफ), बच्चों के चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (सीएमआरआई) (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) में डॉ लेज़ेक लिसोव्स्की को पुनः संयोजक एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

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References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

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कैंसर अनुसंधान अंक 175
लिवर मेटास्टेसिस स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन
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Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

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