Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Abstract

Kolorektal kanserin hepatik metastazı (KRK) kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Tümör mikroçevresinin önemli bir bileşeni olan kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'lar), metastatik KRK progresyonunda çok önemli bir rol oynar ve kötü hasta prognozunu tahmin eder. Bununla birlikte, metastatik kanser hücreleri ve CAF'lar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için tatmin edici fare modellerinin eksikliği vardır. Burada, karaciğer metastazı progresyonunun metastatik niş tarafından nasıl düzenlendiğini ve muhtemelen stroma yönelimli tedavi ile nasıl kısıtlanabileceğini araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonu, insan CRC karaciğer metastazlarının fibroblast bakımından zengin histolojisini sadık bir şekilde özetleyen desmoplastik bir reaksiyon üretti. Bu model, intra-dalak enjeksiyon modeline kıyasla karaciğerde daha yüksek bir tümör yüküne sahip dokuya özgüydü ve fare sağkalım analizlerini basitleştirdi. Lusiferaz eksprese eden tümör organoidleri enjekte edilerek, tümör büyüme kinetiği in vivo görüntüleme ile izlenebilir. Ayrıca, bu preklinik model, tümör mezenkimini hedef alan terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir platform sağlar. Tümör inhibe edici stromal genin hepatositlere adeno ilişkili virüs aracılı olarak verilmesinin tümör mikroçevresini yeniden şekillendirip şekillendiremeyeceğini ve fare sağkalımını iyileştirip iyileştiremeyeceğini incelemek için yöntemler açıklıyoruz. Bu yaklaşım, KRK'nın hepatik metastazını inhibe etmek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar.

Introduction

Kolorektal kanser (KRK) tüm dünyada kanser mortalitesinin önemli bir nedenidir1. KRK hastalarının yarısından fazlasında portal ven yayılımı yoluyla ortaya çıkan hepatik metastaz gelişir1. Günümüzde, ilerlemiş karaciğer metastazını tedavi edebilecek etkili bir terapötik yoktur ve çoğu hasta metastatik hastalığa yenik düşmektedir.

Metastatik niş veya tümör mikroçevresi, yayılmış KRK hücrelerinin engraftasyonunda ve büyümesinde anahtar rol oynar2. Tümör mikroçevresinin önemli bir bileşeni olan kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'lar), büyüme faktörlerinin salgılanması, hücre dışı matrisin (ECM) yeniden şekillendirilmesi ve bağışıklık manzaralarının ve anjiyogenezin modüle edilmesi yoluyla kanser ilerlemesini teşvik eder veya kısıtlar 3,4,5. CAF'lar ayrıca kemoterapilere ve immünoterapilere direnç kazandırır3. Ayrıca, CAF'lar KRK karaciğer metastazının başlamasını ve ilerlemesini düzenler ve KRK'lı hastalarda prognozu öngörür 3,6,7,8. Bu nedenle, KRK karaciğer metastazını inhibe etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesinde CAF ile ilişkili faktörlerden yararlanılabilir. Bununla birlikte, metastatik tümör stromasını incelemek için tatmin edici fare modellerinin bulunmaması, stroma hedefli tedavilerin geliştirilmesinde büyük bir engel olmuştur.

Şu anda, KRK karaciğer metastazını incelemek için hayvan modelleri, karaciğer metastazı ve karaciğere kanser hücresi transplantasyon modellerini kendiliğinden geliştiren birincil KRK modellerini içermektedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri ve kanser hücrelerinin kolonik enjeksiyonu gibi birincil CRC fare modelleri, nadiren karaciğere metastaz gösterir 9,10,11,12. Dahası, karaciğer metastazı gözlense bile, bu modeller primer tümör indüksiyonundan metastaza kadar uzun gecikme süresi gösterir ve potansiyel olarak primer tümör yükünden ölür12. CRC karaciğer metastazlarını verimli bir şekilde üretmek için, kültürlenmiş CRC hücreleri üç enjeksiyon yaklaşımı kullanılarak karaciğere nakledilir: intra-dalak enjeksiyonu, karaciğere doğrudan intra-parankimal enjeksiyon ve portal ven enjeksiyonu. İntra-dalak enjekte edilen kanser hücreleri dalak damarına, portal vene ve nihayetinde karaciğere yayıldı13,14. Bununla birlikte, intra-dalak enjeksiyonu, diğer transplantasyon modellerine kıyasla daha düşük bir tümör alım oranı sağlar15,16. İntra-dalak enjeksiyonu ile, dalakta kanser büyümesini önlemek için dalağın cerrahi olarak çıkarılması gerçekleştirilir, bu da potansiyel olarak bağışıklık hücresi olgunlaşmasını tehlikeye atabilir17. Ayrıca, intra-dalak enjeksiyonu, dalak ve karın boşluğu18'de istenmeyen tümör büyümesine neden olarak karaciğer metastazı analizlerini zorlaştırabilir. Karaciğere doğrudan intraparankimal enjeksiyon etkili bir şekilde hepatik metastazı indükler16,19,20. Bununla birlikte, bu yaklaşım, portal ven yayılımı yoluyla doğal olarak ortaya çıkan karaciğer metastazının biyolojik bir adımını tam olarak özetlememektedir. Karaciğere doğrudan enjeksiyon kullanılarak, kanser hücrelerinin portal olmayan bir sisteme girmesi, ancak sistemik dolaşım da çoklu büyük akciğer metastazlarına neden olabilir16. KRK karaciğer metastazı olan hastaların çoğunda karaciğer21'de birden fazla tümör nodülü göstermesine rağmen, spesifik bir karaciğer lobuna doğrudan enjeksiyon tek bir tümör kitlesi oluşturur 19,20. Portal ven enjeksiyonu veya mezenterik ven enjeksiyonu, teknik olarak zor olsa da, tümör hücrelerinin karaciğere etkili bir şekilde verilmesine izin verir ve bu da hastalarda görülen büyüme modellerini özetler17. Bu strateji, ikincil bölge metastazı olasılığını en aza indirebilir ve karaciğerdeki kanser hücrelerinin hızlı büyümesini sağlayarak fare hayatta kalma analizlerini basitleştirebilir.

Tarihsel olarak, fare MC-38, insan HT-29 ve SW-620 gibi kolorektal kanser hücre çizgileri, hepatik metastaz 22,23'ün fare modellerini oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu kolorektal kanser hücre hatları desmoplastik stromal reaksiyona neden olmaz. Tümörlerdeki düşük stromal içerik, kanserle ilişkili fibroblastların biyolojik rollerinin araştırılmasını zorlaştırmaktadır. KRK organoidleri ve transplantasyonlarındaki son gelişmeler, stromanın kanser progresyonundaki hayati rollerini değerlendirmek için yararlı platformlar sunmuştur24. KRK organoidlerinin karaciğer transplantasyonu, fibroblast bakımından zengin bir tümör mikroçevresi oluşturur ve stromal araştırmalara yeni bakış açıları sağlamıştır 6,25. Günümüzde organoidlerin portal veya mezenterik ven enjeksiyonu, KRK karaciğer metastazı 6,25,26,27,28 oluşturmak için altın standart bir yaklaşım haline gelmiştir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, daha önce hiçbir makale kolorektal tümöroidlerin portal ven enjeksiyonu için ayrıntılı yöntemler tanımlamamıştır. Burada, yeni adeno ilişkili virüs (AAV) aracılı stroma yönelimli tedavi geliştirmek için KRK organoidlerinin portal ven enjeksiyonunu kullanmak için bir metodoloji sunuyoruz.

Hepatositler karaciğerdeki metastatik tümör mikroçevresinin önemli bir bileşenidir ve metastatik kanser progresyonunda kritik bir rol oynamaktadır29. Neoplastik olmayan hastalarda hepatositlerde protein ekspresyonunu indüklemek için AAV gen tedavisi yaklaşımlarının başarısından esinlenerek30,31, benzer bir yaklaşımı araştırdık, ancak KRK25'te karaciğer tümörü mikroçevresini değiştirmeyi amaçladık. Bu nedenle, burada karaciğer tümörü mikro ortamını değiştirmek için anti-tümörojenik proteinlerin ekspresyonunu indüklemek için AAV8'in kuyruk damarı enjeksiyonunu da açıklıyoruz. Virüs üretimi sırasında viral kapsid proteininin seçimi ile belirlenen AAV8 serotipi, özellikle hepatositlerin (yani, karaciğer tümörü mikroortamında hedeflenen gen ekspresyonu) yüksek transdüksiyon verimliliğine yol açar32. Daha önce Islr'nin (lösin bakımından zengin tekrar içeren immünoglobulin süper ailesi), kemik morfogenetik protein (BMP) sinyalini indükleyen, CRC tümöroid büyümesini azaltan ve Lgr5 + bağırsak kök hücre farklılaşmasını teşvik eden CAF'ye özgü bir gen olduğunu göstermiştik25. Hepatositlerde kanseri kısıtlayan stromal gen Islr'nin AAV8 aracılı aşırı ekspresyonunun, AAV8-Islr ile tedavi edilen farelerde CRC tümöroidlerinin portal ven enjeksiyonunu gerçekleştirerek hepatik metastaz ilerlemesini azaltıp azaltamayacağını test ettik.

Bu yazıda ilk olarak karaciğer tropik AAV'nin kuyruk veni enjeksiyon yöntemi anlatılmaktadır. Daha sonra, tümöroid hücre hazırlığı ve AAV ile tedavi edilen farelere portal ven enjeksiyonu için bir yöntem tanımladık. Son olarak, stroma yönelimli terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için metastatik tümör progresyonunu izlemek için yaklaşımlar sunuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu makaledeki tüm hayvan prosedürleri, Güney Avustralya Sağlık ve Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Etiği Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Onay numarası, SAM322).

1. Adeno ilişkili virüsün kuyruk damarı enjeksiyonu

NOT: Adeno ilişkili virüs (AAV), Biyogüvenlik Seviye 1 kılavuzları kapsamında biyolojik tehlike olarak ele alınmalıdır. Lütfen AAV hazırlama, saflaştırma ve titrasyon33 için yayınlanmış protokole bakın. Bu çalışmada sitomegalovirüs (CMV) promotörü-Islr genini kodlayan hepatosit-tropik AAV, AAV8 34,25 kullanıldı. AAV aracılı aşırı ekspresyonu indüklemek için, AAV dozlaması promotör aktivitesine, gene ve fare ağırlığına bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.

  1. AAV vektörünü, steril fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak 1.0 x 1011 viral genom içeren 150 μL alikotlara seyreltin ve buz üzerinde tutun. AAV'yi tutmak için kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
    NOT: Tekrarlanan donma ve çözülme döngüsü virüs titresini azaltır ve kaçınılmalıdır. Stok viral çözeltisi -80 °C'lik bir dondurucuda saklanmalıdır.
  2. 35 ° C'ye kadar ön ısıtmak için bir ısı kutusunu (hayvan ısıtma odası) açın.
  3. Bir fare tutun ve kuyruk damarı enjeksiyonundan en az 15 dakika önce kuyruğun tüm uzunluğuna topikal bir anestezi kremi uygulayın.
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve enstitünün hayvan etiği komitesi tarafından istenmediği takdirde gerekli olmayabilir. Yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanan protokolü takip edin. Bu deneyde25, AAV enjeksiyonu ve ardından CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonu için bir Rosa26-Cas9 fare kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan tümöroidlerin bir Rosa26-Cas9 faresinden (C57BL / 6 x 129 genetik arka plan) türetildiği göz önüne alındığında, bu fare suşu aynı zamanda tümör naklinin immün yetkin, sinjenik alıcıları olarak da kullanılmıştır. Erkek ve dişi Rosa26-Cas9 fareleri (6 ila 24 haftalık) kullanıldı.
  4. Fareyi ısı kutusuna yerleştirin. Kuyruk damarlarını ısıtmak ve genişletmek için fareyi 15 dakikaya kadar bırakın.
  5. Fareyi yavaşça bir kemirgen tutucusuna sabitleyin. Kuyruk damarlarının tamamen genişlemesini sağlamak için kuyruğu bir ısı lambasının altına yerleştirin.
  6. 150 μL seyreltilmiş AAV'yi (adım 1.1'de hazırlanan) 27-30 G iğne ile düşük ölü alan steril bir şırıngaya hazırlayın.
  7. Isı lambasını hareket ettirin ve kuyruğun yanlarında bulunan yanal kuyruk damarını tanımlayın. Kuyruğun düz olması için parmaklarınızla kuyruğa hafif bir gerginlik koyun.
  8. İğnenin 2-3 mm'sini yavaşça damar içine yerleştirin, eğim yukarı doğru yerleştirin. İğne kuyruğa neredeyse paralel olmalıdır (kuyruktan 15 ° 'ye kadar).
    NOT: İğne damar içine başarılı bir şekilde yerleştirilirse, şırıngaya kan akışı gözlenebilir.
  9. Yavaşça enjekte edin. Bir direnç hissedilirse veya cilt şişmesi gözlenirse, iğneyi çıkarın ve ilk bölgenin üzerine veya diğer lateral damara tekrar yerleştirin.
  10. Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra yaklaşık 5 s bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça çıkarın. Kanama durana kadar derhal enjeksiyon bölgesine temiz bir gazlı bez veya kağıt havlu ile hafif bir basınç uygulayın.
  11. Fareyi yavaşça kafesine bırakın. Kanamanın durduğundan emin olmak için hayvanı izleyin.
    NOT: Karaciğerdeki gen aşırı ekspresyonu, AAV kuyruk damarı enjeksiyonundan 1 ila 2 hafta sonra değerlendirilebilir. Bu, örneğin, RNA in situ hibridizasyon (ISH), immünohistokimya (IHC), batı lekelenmesi veya kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR; Şekil 1A,B). Daha önce yayınlanmış bir çalışmada25, hepatositlerde fare Islr genini aşırı eksprese etmek için AAV8-Islr kullanılmış ve aşırı ekspresyon RNA ISH tarafından tespit edilmiştir (Şekil 1A, B).

2. Kolorektal kanser organoidleri için hücre hazırlığı

NOT: Bu deney için kullanılan CRC organoidleri sadece epitel hücreleri içerir. CRC organoidlerinin kültürü ve oluşumu daha önce25,35 olarak tanımlanmıştır. Kısacası, normal kolonik epitel hücreleri, bir kript izolasyon tamponu (buz gibi PBS'de 5 mM EDTA (etilendiamintetraasetat) kullanılarak bir Rosa26-Cas9 faresinin kolonundan izole edildi ve daha sonra bazal membran matris ortamına gömüldü ve referans35'te açıklandığı gibi organoid büyüme ortamında kültürlendi. Daha sonra, Apc ve Trp53 mutasyonları, lentivirüs ekspresyon protokolünü kullanarak Apc ve Trp53'ü hedef alan tek kılavuzlu RNA'ları aşırı eksprese ederek kolonik epitel hücrelerine tanıtıldı. Tek organoid klonlar25 elle seçildi. Birpc Δ / Δ ve Trp53Δ / Δ kolon kanseri organoidleri (AP tümöroidleri), 100 μM Y-27632 ile 100 μL PBS'de 5.0 x 105 tek hücre olarak fare başına portal vene, aşağıda açıklanan organoid kültür ve tek hücreli preparat ile enjekte edildi.

  1. CRC organoidlerini topluca membran matrisinde orta kubbelerde 24 delikli bir plakada veya portal ven enjeksiyonundan 3-5 gün önce 10 cm'lik bir tabakta kültüre alarak 50-400 μm çapında organoidler elde edin.
  2. Enjeksiyon için kültürlenen organoid sayısını sindirmek için yeterli miktarda Y-27632 ila 10 μM konsantrasyonu ekleyerek yeterli miktarda hücre ayrılma çözeltisi hazırlayın. 37 °C su banyosunda önceden ısıtın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan hücre ayrılma çözeltisi bir rekombinant hücre-ayrışma enzim karışımıdır ve organoid kültürde tripsin yerine kullanılır (bkz. Tripsin36'ya kıyasla hücre ayrışmasının neden olduğu hücresel hasarı azaltır. Y-27632 bir Rho kinaz inhibitörüdür ve ayrışmaya bağlı hücre ölümünü inhibe eder, böylece tek hücreli sağkalımı arttırır37.
    1. Beş fareye kadar enjeksiyon için, her kubbe yaklaşık 300 organoid (50-400 μm çapında) içeren 10-24 x 50 μL bazal membran matris kubbelerini sindirmek için 40 mL hücre ayırma çözeltisi içeren iki tüp hazırlayın, yani her fareye 2-4.8 kubbe organoid enjekte edilir (yaklaşık 600-1440 organoidlere eşdeğer). Yeterli hücre sayısını elde etmek için gerekli organoid sayısı organoid hattına bağlıdır ve bu nedenle optimize edilmelidir.
      NOT: İkinci 40 mL tüp, ayrışmış tek hücreler elde etmek için taze hücre ayrılma çözeltisi ile tekrar sindirimi mümkün kılar.
  3. Organoid ortamı her bir kuyucuktan dikkatlice aspire edin.
  4. 24 delikli bir plakada her bir kuyucuğa 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. 10 cm'lik bir çanak kullanılıyorsa, yemeğe 10 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.
  5. P1000 pipet ucu kullanarak bazal membran matris ortamını çizin. PBS/orta boy bulamacı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  6. Bodrum membran matris parçalarını toplamak ve 15 mL tüplere eklemek için her bir kuyuyu aynı miktarda PBS ile durulayın.
  7. Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Bu inkübasyon, bazal membran matris ortamının çözülmesine yardımcı olur.
  8. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
  9. Peletlenmiş ortamı ve hücreleri rahatsız etmemek için süpernatantı aspire edin.
  10. Pelet için adım 2.2'de hazırlanan 5 mL önceden ısıtılmış hücre ayrılma çözeltisi ekleyin, peleti 10 kez askıya alın ve taze, önceden ısıtılmış hücre ayrılma çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüpe geri aktarın.
  11. Tüpü 37 °C su banyosuna yerleştirin. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  12. Tüpü 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
  13. 2.9-2.11 arasındaki adımları yineleyin.
    NOT: Tekrarlanan enzimatik sindirim, tek hücrelere verimli hücre ayrışmasına izin verir.
  14. Organoidlerin, 100 μL'yi 96 delikli bir plakaya pipetleyerek ve mikroskop altında gözlemleyerek tek hücrelere ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Birçok organoid, dörtten fazla hücreden oluşan hücre kümeleri gösteriyorsa, hücre ayrılma çözeltisi ile daha uzun inkübasyon ve 10 mL'lik bir pipetle tritürasyon yoluyla fiziksel ayrışma gerekli olabilir.
  15. Çoğu hücre tek hücreli olduğunda, sindirimi durdurmak için 40 mL hücre süspansiyonuna 4 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 40 μm hücre süzgecini 5 mL PBS ile durulayın.
  16. Herhangi bir hücre kümesini çıkarmak için hücre süspansiyonunu hücre süzgecinden 50 mL'lik bir toplama tüpüne geçirin.
  17. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
  18. Süper natantı aspire edin. Hücre peletine 10 mL soğuk PBS ekleyin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  19. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
  20. Süper natantı aspire edin. Peleti 500 μL soğuk PBS'de 10 μM Y-27632 ile yeniden askıya alın. Hücreleri sayın.
  21. 10 μM Y-27632 PBS kullanarak hücre konsantrasyonunu 5,0 x 105 tek hücre/100 μL olarak ayarlayın. Portal ven enjeksiyonu yapılana kadar tüpü buz üzerine yerleştirin.
    NOT: Ayrışmış hücrelerin ayrışmadan sonraki 4 saat içinde enjekte edilmesi önerilir.

3. CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonu

NOT: Tüm cerrahi aletler ve cerrahi gazlı bezler ameliyattan önce otoklavlanmalı veya sterilize edilmelidir. Bu protokol önceki bir protokol17'den değiştirilir. Bu deneyde25, adım 1'de AAV-mRuby2 veya AAV-Islr ile tedavi edilen Rosa26-Cas9 fareleri kullanılarak portal ven enjeksiyonu gerçekleştirildi.

  1. Bir ısıtma yastığı üzerinde steril perdeler kullanarak aseptik bir cerrahi alan hazırlayın.
  2. Cerrahi aletler (makas ve forseps), cerrahi ve hemostatik sünger, 4-0 poliglactin sütür, pamuklu tomurcuklar, cilt zımbalayıcıları, zımba aplikatörü, salin, buprenorfin ve bir Hamilton şırıngasına bağlı 33 G iğne hazırlayın. Hemostatik süngeri 1,0 cm x 1,0 cm parçalar halinde kesin.
  3. Cerrahi alanı aydınlatmak için ışık kaynağının konumunu ayarlayın.
  4. Cerrahi ağrı yönetimi için 0.1 mg / kg vücut ağırlığındaki buprenorfin'i deri altından bir fareye enjekte edin.
  5. Fareyi anestezi odasında izofluran ile uyuşturun. İndüksiyon ve bakım için izofluran konsantrasyonu genellikle sırasıyla% 5 ve% 2.5'tir. Bir sonraki prosedüre başlamadan önce ayak parmağı sıkışmasına karşı bir reaksiyon olup olmadığını kontrol edin.
  6. Farenin ortasından üst karnına kadar elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin. Tıraş, saçların bölgeyi kirletmesini önlemek için aseptik cerrahi alandan uzak bir alanda yapılmalıdır.
  7. Cerrahi bölgeyi sterilize etmek için Betadine ve% 80 etanol ile dönüşümlü olarak kesi bölgesini temizleyin. Üç kez tekrarlayın.
  8. Fareyi bir ısıtma yastığına bakım izofluran anestezisi ile sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Farenin karnının üzerine delikli cerrahi bir örtü yerleştirin.
  9. Karın derisini forseps ile kaldırın ve orta hatta makasla 2-3 cm'lik bir cilt kesisi yapın, sadece cildi kesin (altta yatan periton değil). Kesi, karın ortasından sternumun ksifoid sürecine kadar değişmelidir. Kesi, ksifoid sürecin alt ucunun üzerine çıkmamalıdır.
  10. Forseps ile periton duvarını tamamen kaldırın ve makasla peritona benzer 2-3 cm'lik bir kesi yapın. Bağırsak ve diyaframı kesmekten kaçının.
  11. Cerrahi gazlı bezi ılık salinle ıslatın ve insizyonun sol tarafına yerleştirin (farenin vücudunun sol tarafına; cerrahın sağına).
  12. İç organları (ince ve kalın bağırsaklar) salinle ıslatılmış bir pamuk tomurcuğu kullanarak yavaşça çekin. Bağırsakları tuzlu suyla ıslatılmış gazlı bezin üzerine yerleştirin.
    NOT: Önce farenin sol tarafındaki bağırsaklar (yani cerrahın sağındaki bağırsaklar) dışarı çekilmeli ve daha sonra farenin sağ tarafındaki bağırsaklar (yani cerrahın solundaki bağırsaklar) dışarı çekilebilir.
  13. Portal damarı görselleştirmek için bağırsakların konumunu ayarlayın. Bağırsakları nemli tutmak için bağırsakları ek ıslak gazlı bezle örtün.
  14. Islak gazlı bezle bağırsağı yavaşça sol tarafa çekin ve sola hafif bir gerginlik uygulayın. Bu, portal venin görselleştirilmesini kolaylaştırır (Şekil 2A).
    NOT: Portal damarın görselleştirilmesi zorsa, midenin pozisyonunu ıslak bir pamuk tomurcuğuyla nazikçe ayarlamak görselleştirmeye yardımcı olabilir.
  15. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için birkaç kez hafifçe pipet tümöroid süspansiyonu. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sini yavaşça 33 G'lik bir iğneye bağlı bir Hamilton şırıngasına çekin. Hava kabarcıklarından kaçının.
  16. İğneyi yavaşça yerleştirin, eğimi yukarı kaldırın, portal damara yerleştirin. İğne boyunca yerleştirme derinliği, iğne açısı portal damara neredeyse paralel olacak şekilde 3-4 mm olmalıdır.
    NOT: Enjeksiyon, portal venin iyi görselleştirilmiş kısmına (genellikle hepatik hilumdan 2 cm uzağa kadar) yapılmalıdır. Portal damara tamamen yerleştirildikten sonra iğnenin hareketinden kaçının.
  17. 30 s için tümör hücreleri enjekte edin. Portal venin tıkanmasını önlemek için enjeksiyon yavaşça yapılmalıdır. Enjeksiyon başarılı olursa, karaciğerin rengi geçici olarak kırmızıdan beyaza değişir.
  18. İğneyi yavaşça çıkarın. Hemen kuru bir pamuk tomurcuğu ile enjeksiyon bölgesine hafif bir basınç uygulayın ve 5 dakika bekleyin.
  19. Pamuk tomurcuğu çıkarın ve aynı anda enjeksiyon bölgesine hemostatik bir sünger uygulayın. Hemostatik süngeri pamuk tomurcuk veya forseps ile tutun ve 5 dakika daha hafif basınç uygulayın.
  20. Hemostatik süngere basıncı çıkarın ve enjeksiyon bölgesinden kanama olmadığını onaylayın.
    NOT: Biyo-emilebilir hemostatik süngerin çıkarılmasına gerek yoktur. Gazlı bezi çıkarmaya çalışmak, enjeksiyon bölgesinden yeniden kanamaya neden olabilir.
  21. Kanama meydana gelirse, derhal yaklaşık 10 dakika boyunca pamuklu bir tomurcukla basınç hemostazı uygulayın. Ardından, 5 dakika daha ek bir hemostatik sünger uygulayın.
    NOT: Kontrol edilemeyen kan kaybı gözlenirse, enstitünün hayvan etik kurulu tarafından onaylanan protokole göre fare ötenazi yapılmalıdır.
  22. Bağırsaklardaki cerrahi gazlı bezleri çıkarın. 5 mL salin ile doldurulmuş bir şırınga kullanarak, organ yapışmasını önlemek için bağırsaklara salin fışkırtın.
    NOT: Portal ven enjeksiyon bölgesine salin uygulamayın. Bu yeniden kanamaya neden olabilir.
  23. Bağırsakları nazikçe karın boşluğunun içine geri yerleştirin.
  24. Peritonu 4-0 poliglactin sütür kullanarak dikiş.
  25. Forseps ile cildin her iki tarafını da kaldırın. Cilt insizyonunu kapatmak için cilt zımbalayıcıları uygulayın. Bağırsağı zımbalamamaya dikkat edin.
  26. İzofluranı kapatın, ancak oksijen akışını çalışır durumda tutun. Fareyi dikkatlice izleyin. Fare uyandığında, fareyi bir ısıtma yastığı üzerindeki boş bir kafese yerleştirin. Fare genellikle 5 dakika içinde uyanır.
  27. Fareyi bilinçli olana ve normal şekilde yürüyene kadar dikkatlice izleyin.
  28. Subkutan olarak ameliyattan 4 saat sonra fareye 0.1 mg / kg büprenorfin enjekte edilir.
  29. Sonraki 2 gün boyunca her 24 saatte bir fareye 0.1 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
  30. Fareleri ameliyattan sonra bir hafta boyunca günlük olarak dikkatlice izleyin. Dikişleri ve yara iyileşmesini kontrol edin.
  31. Ameliyattan günler sonra, bir zımba sökücü kullanarak cilt zımbalayıcılarını çıkarın.

4. Tümör büyüme kinetiğinin in vivo biyolüminesan görüntüleme ile değerlendirilmesi

NOT: Enjeksiyon için Firefly eksprese eden tümöroidler kullanılıyorsa, metastatik tümör progresyonu tarif edildiği gibi in vivo görüntüleme ile haftalık olarak izlenebilir38,39. Kanser hücreleri tarafından eksprese edilen lusiferaz, kanser hücrelerine karşı bağışıklık tepkileri ortaya çıkarabilir ve tümör büyümesini sınırlayabilir40. Bu nedenle, lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerini kullanarak bir fare modelinde immün fenotipleri ve kanser ilerlemesini analiz etmede dikkatli olunması gerekir.

  1. Steril PBS kullanarak 30 mg / mL'lik bir D-luciferin çözeltisi hazırlayın. Işıktan koruyun. D-lusiferin, kullanıma kadar -20 ° C'de alikotlarda saklanmalıdır.
  2. Karın ve göğüs kafesini elektronik tıraş makinesi ile tıraş edin. Bu, in vivo görüntülemeden 1 gün öncesine kadar yapılabilir.
  3. Farelere intraperitoneal olarak 150 mg / kg D-luciferin vücut ağırlığı enjekte edin (yani, fare vücut ağırlığı 30 g ise, D-luciferin çözeltisinin 150 μL'sini enjekte edin).
  4. Fareleri bir anestezi odasına yerleştirin ve anestezi altına alın. İndüksiyon için% 5 izofluran ve bakım için% 2-3 kullanın.
  5. dakika sonra, fareleri yanal bir konuma yerleştirin (sağ taraf yukarı). Daha önce tarif edildiği gibi bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak biyolüminesans görüntüleri elde edin38,39.
    NOT: Fareler, sırtüstü pozisyona kıyasla yanal pozisyonda daha kararlıdır. Bu nedenle, tutarlı bir odak düzleminden bir lüminesans görüntüsü elde etmek için yanal bir pozisyon tercih edilir.
  6. Fareleri boş bir kafese yerleştirin ve iyileşmelerini izleyin.
  7. Açıklanan38 Yaşayan Görüntü Yazılımını kullanarak üst karın bölgesindeki ilgi alanlarını tanımlayın. Toplam akıyı tümör hücre sayısı için bir vekil olarak sayısallaştırın.

5. Sağkalım analizi ve doku toplama

  1. Fareleri, şişmiş bir karın gibi metastazların klinik semptomları için dikkatlice izleyin.
  2. İnsancıl uç noktalara ulaştığında CO2 inhalasyonu ile bir fareyi ötenazileştirin.
    NOT: Enstitünün hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış bir çalışma bitiş noktası kullanın. İnsancıl bir son nokta belirlemek için, bir klinik kayıt sayfası kullanıldı; Puanlar, aşağıdaki gözlemlerin her birinin varlığı için verilen bir puan ile hesaplandı: kilo kaybı% 15 >, kambur duruş, karıştırılmış palto, dehidrasyon, azalmış hareket, şişkin karın veya yüz buruşması. 3 puana ulaşıldığında, fareler insani olarak ötenazi yapıldı.
  3. Ötanaziden hemen sonra, tarif edildiği gibi bir duman başlığında 30-50 mL% 10 formalin ile transkardiyal perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin. Kan ve formalin çıkışları oluşturmak için perfüzyondan önce karaciğerin normal kısmına makasla birkaç küçük kesi (her biri 1 cm'ye kadar) yapın. Perfüzyon üzerine, karaciğer rengi kırmızıdan kahverengiye değişecektir.
    NOT: Makroskopik olarak normal karaciğer bölgelerindeki mikrometastazlar bir çalışma konusuysa, araştırmacıların karaciğeri kesmemelerini, bunun yerine üstün vena kavayı kesmelerini öneririz. Bununla birlikte, bu yöntemi kullandığımızda, karaciğerin fiksasyonu, karaciğerin kesilmesine kıyasla daha zayıf görünmektedir. Özellikle RNA in situ hibridizasyonunun (ISH) karaciğer kesitlerinde yapılması planlanıyorsa, yukarıda tarif edildiği gibi intra-kardiyak formalin enjeksiyonundan önce karaciğere insizyon yapılmasını öneririz. Bu, karaciğer dokusunun yeterli fiksasyonunu sağlar ve ISH için RNA bütünlüğünün korunmasını sağlar.
  4. Karaciğer ve akciğer dokularını% 10 formalin içine yerleştirin ve gece boyunca sabitleyin. Formalini% 70 etanol ile değiştirin, ardından parafin gömün.
  5. Tümör alanını histolojik olarak değerlendirmek için hematoksilin ve eozin boyama yapın. İlgilenilen stromal belirteçler için immünohistokimya yapın. Kollajen pozitif alanları değerlendirmek için Picro-Sirus Kırmızı boyama yapın.
    NOT: ImageJ yazılımı42 , immünohistokimya ve Picro-Sirius Res boyama verilerini ölçmek için kullanılabilir. Bir renk dekonvolüsyon fonksiyonu ve MRG fibrozis aracı, sırasıyla 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) pozitif alanları ve Picro-Sirius kırmızı-pozitif alanları değerlendirmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hepatositlerde tümör kısıtlayıcı stromal gen Islr 4,25,43,44'ün AAV aracılı aşırı ekspresyonunu indüklemek için, intravenöz olarak Islr kodlayıcı AAV8'i enjekte ettik. AAV8-Islr'nin 1.0 x 10 11 viral genomu (vg) veya bir kontrol olarak AAV8-mRuby2, yetişkin fare kuyruğu damarına enjekte edildi (Şekil 1A). Kuyruk damarı enjeksiyonundan iki hafta sonra, hepatositlerde Islr'nin aşırı ekspresyonunu doğrulamak için karaciğerler toplandı. RNAscope in situ hibridizasyon45 gerçekleştirdik ve karaciğer boyunca 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)+ sinyallerinin gözlendiğini doğruladık (Şekil 1B). Karaciğerde AAV8-mRuby2 ile muamele edilmiş bir fareden DAB + sinyalleri tespit edilmedi.

Portal ven enjeksiyon prosedürünü Hindistan mürekkebi enjekte ederek uyguladık (PBS'de 1:1000 seyreltme). Üst karın içine bir kesi yapıldıktan sonra, portal venin görselleştirilmesine izin vermek için bağırsaklar karın boşluğundan nazikçe çıkarıldı (Şekil 2A). Hindistan mürekkebinin portal ven enjeksiyonu, mürekkebi karaciğere iletti, ancak akciğere vermedi (Şekil 2B). Mürekkep yanlışlıkla inferior vena kava (IVC) veya abdominal aort gibi diğer damarlara enjekte edilirse, mürekkebin sistemik dolaşımı akciğer rengini siyaha çevirir. Hindistan mürekkebi ayrıca portal damardan sızıntı miktarını belirlemeye yardımcı olur, bu da pankreas veya periton yayılımını gösterir.

AAV-mRuby2, Apc Δ/Δ ve Trp53 Δ/Δ kolon kanseri organoidlerinin (AP tümöroidleri) kuyruk damarı enjeksiyonundan iki hafta sonra tek hücrelere ayrışarak fare portal venine enjekte edildi (Şekil 3A). Metastatik tümör büyümesini doğrulamak ve histolojiyi değerlendirmek için, karaciğerleri portal ven enjeksiyonundan 3-4 hafta sonra (yani, insancıl bir son noktadan ziyade zamanlanmış bir noktada), belirgin nekroz histopatolojik analizleri karıştırmadan önce topladık. Makroskopik olarak, tümöroidlerin portal ven enjeksiyonu karaciğerde çoklu beyaz tümör nodülleri ile sonuçlandı (Şekil 3B). Aynı hücre sayısındaki tümöroidlerin intra-dalak enjeksiyonunun büyük bir metastatik tümör kitlesi oluşturmadığını bulduk. Bu, portal ven enjeksiyon yaklaşımının intra-dalak enjeksiyon modeline kıyasla karaciğer metastazlarını daha verimli bir şekilde indüklediğini göstermektedir. Portal ven enjeksiyonu ile indüklenen KRK hepatik metastazlarının hematoksilin ve eozin boyaması, orta derecede diferansiye tübüler adenokarsinomun histopatolojisini desmoplastik stromal reaksiyon ve nekroz eşliğinde gösterdi (Şekil 3C). Bu stroma bakımından zengin histoloji, insan KRK karaciğer metastazlarınınkini sadık bir şekilde özetlemiştir (Şekil 3C), bu modeli metastatik tümör stromasını araştıran translasyonel araştırmalar için uygun hale getirmiştir. Ayrıca, CAF'lar için iyi kurulmuş bir belirteç olan alfa-düz kas aktininin (αSMA) immünohistokimyası, tümör alanlarının yaklaşık% 7'sinin αSMA pozitif olduğunu ve bu fare modelinde CAF'ların varlığını doğruladığını göstermiştir (Şekil 3D, E). Kollajen46'yı boyayan Picro-Sirius kırmızı boyaması, tümör mezenkiminde bol miktarda ECM gösterdi ve tümör alanlarının yaklaşık% 13'ü kollajen için pozitif (Şekil 3D, E). Epitel soy belirteci olan EPCAM için immünohistokimya, metastatik CRC'nin, kötü prognoz kolorektal kanser 47'nin bir özelliği olan tümör tomurcuklanması (tek bir tümör hücresi veya dört tümör hücresine kadar bir hücre kümesi) gösterdiğini ortaya koymuştur47 (Şekil 3F). Metastatik KRK'daki Ki67 etiketleme indeksi yaklaşık% 80 idi, bu da çoğu tümör hücresinin mitotik olarak aktif olduğunu gösteriyordu (Şekil 3G, H).

Bu preklinik modelde fare sağkalım ve tümör büyüme kinetiği analizleri yaptık. İlk pilot kohortumuzdaki fareler, portal ven içine tümöroid enjeksiyonundan 57 gün sonra medyan sağkalım gösterdi (N = 4 fare; Şekil 4A). Bu daha sonra daha büyük kontrollü AAV8-mRuby2 enjekte edilen gruplar25'te çoğaltıldı. İnsancıl sonlanım noktasında (NOT, adım 5.2'de gösterildiği gibi), pilot gruptaki 4 fareden 3'ü, ileri karaciğer metastazı48 olan hastalarda da gözlenen asit gösterdi. Tümör büyümesini değerlendirmek için, tümöroid kaynaklı lüminesansı ölçmek için in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanıldı (Şekil 4B, C). Biyolüminesans sinyalleri üst karın bölgesinde gözlendi ve karaciğere özgü tümör büyümesini düşündürdü (Şekil 4B). Alt karın bölgesinde IVIS sinyalleri gözlenirse, bu karın organlarına periton yayılımını veya ikincil metastazları gösterir. Haftalık in vivo görüntüleme, her farede tümör büyümesinin uzunlamasına bir değerlendirmesine izin verdi (Şekil 4C), sonraki daha büyük çalışmamızda terapötik bir etkinin izlenmesini kolaylaştırdı. Tümör alım oranı, IVIS sinyalleri ile değerlendirildiği gibi% 100 (4/4 fare) idi. Bu deneyde, doku toplama sırasında makroskopik olarak belirgin akciğer metastazı gözlenmedi (0/4 fareler).

Son olarak, kanseri kısıtlayan bir CAF geni olan Islr 4,25'in AAV aracılı hepatosit yönelimli verilmesinin, bu klinik öncesi fare modelinde CRC hepatik metastaz büyümesini inhibe edip edemeyeceğini araştırdık. Özellikle, AAV8-Islr ile tedavi edilen fareler, fare sağkalımının arttığını ve tümörlerden IVIS sinyallerinin azaldığını göstermiştir (Şekil 5A-C)25. Fosforile Smad1/5/8 için immünohistokimya, bir BMP sinyal güçlendiricisi olan ISLR'nin hepatosit aşırı ekspresyonunun, metastatik tümörlerde BMP sinyallemesini arttırdığını göstermiştir (Şekil 5D). AAV8-Islr ile tedavi, KRK hepatik metastazındaki Ki67+ proliferasyon hücrelerinin sayısını azaltmıştır (Şekil 5E). Sonuçların tam açıklaması için, Kobayashi ve ark., Gastroenteroloji, 202125'e bakınız. Kolektif verilerimiz, karaciğer metastatik tümör stroma29'un hayati bir bileşeni olan hepatositlere tümör inhibitör genin AAV8 aracılı olarak verilmesinin, KRK karaciğer metastazları için etkili bir önleyici / terapötik yaklaşım olabileceğini göstermektedir (Şekil 5F).

Figure 1
Şekil 1: Kuyruk damarı tarafından uygulanan AAV8-Islr, karaciğerde Islr aşırı ekspresyonu oluşturur. (A) AAV8'in kuyruk veni enjeksiyonunu, ardından kolorektal kanser (CRC) organoidlerinin portal ven enjeksiyonunu gösteren deneysel şema. ISH, in situ hibridizasyon; IHC, immünohistokimya; qRT-PCR, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu. (B) Temsili resimler. Islr için RNA in situ hibridizasyonu, AAV8-Islr veya AAV8-mRuby2 ile tedavi edilen farelerden gelen karaciğerler kullanılarak gerçekleştirildi. Karaciğerler kuyruk damarı enjeksiyonundan 2 hafta sonra toplandı. Ölçek çubukları, 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hindistan mürekkebinin portal ven enjeksiyonu, karaciğere verilmesiyle sonuçlanır, ancak akciğere değil . (A) Laparotomi sonrası üst karın anatomisini gösteren temsili resimler. Portal venin görselleştirilmesi için bağırsakların karın boşluğunun dışına alındığını unutmayın. Sağdaki resim, her organ ve damarın anatomik bir ek açıklamasını göstermektedir. Sarı ok, enjeksiyon bölgesini gösterir. IVC, İnferior vena kava. (B) Hindistan mürekkebinin portal ven enjeksiyonunu takiben karaciğer ve akciğerin temsili resimleri. Sarı ok uçları, Hindistan mürekkebi ile lekelenmiş gemileri gösterir. Ölçek çubukları, 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kolorektal kanser organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazları oluşturur. (A) Apc Δ / Δ ve Trp53 Δ / Δ kolon kanseri organoidlerinin (AP tümöroidleri) portal ven enjeksiyonunu gösteren deneysel şema. Ölçek çubuğu, 200 μm. T, tümöroidler. (B) Portal ven enjeksiyonundan (solda) veya intra-dalak enjeksiyonundan (sağda) 3-4 hafta sonra toplanan karaciğerlerin temsili makroskopik resimleri. AP tümöroidlerinden 5.0 x 105 tek hücre portal ven veya dalağa enjekte edildi. İntra-dalak enjeksiyonu tarif edildiği gibi yapıldı13. Beyaz nodüller tümörleri gösterir. T, tümör; N, Normal karaciğer. (C) Portal ven enjeksiyon fare modelinden (sol ve orta) ve insandan (sağda) CRC karaciğer metastazlarının temsili hematoksilin ve eozin (H&E) boyama resimleri. T, tümör; N, Normal karaciğer; S, Stroma; Nec, Nekroz. Sarı noktalı çizgi, tümör ile normal karaciğer (solda) arasındaki sınırı gösterir. (D ve E) Alfa-düz kas aktininin (αSMA; solda) ve Picro-Sirius kırmızı boyaması (sağda) için immünohistokimya (IHC). (D) Temsili resimler. (E) αSMA pozitif alanların (solda) ve Picro-Sirius kırmızı-pozitif alanların (sağda) nicelleştirilmesi. N = 4 fare, 5 HPF (Yüksek Güç Alanları; 400x)/fare. (F) Epitel hücre belirteci olan EPCAM için immünohistokimyayı gösteren temsili resim. Yeşil noktalı çizgiler tümör tomurcuklanmasını gösterir. (G ve H) Bir hücre proliferasyon belirteci olan Ki67 için immünohistokimya. (G) Temsili resim. (H) Toplam epitel hücrelerinde Ki67+ hücrelerinin yüzdesi. Epitel hücreleri hematoksilin karşı boyama ile görselleştirildi. N = 4 fare, 5 HPF/fare. (B)-(H)'de, tüm fare karaciğer dokuları AP tümöroidlerinin enjeksiyonundan 3-4 hafta sonra toplandı. Ortalama ± S.E.M. Her nokta, bir fareden (E ve H) ortalama 5 HPF değerini temsil eder. Ölçek çubukları 1 cm (B), 1 mm (C; sol), 100 μm (C; orta ve sağ) ve 50 μm (D, F ve G) değerlerini temsil eder. İnsan dokuları ile yapılan çalışmanın Nagoya Üniversitesi Tıp Enstitüsü Etik Kurulu (2017-0127) tarafından onaylandığını unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İn vivo görüntüleme ile sağkalım analizi ve tümör büyüme kinetik analizi. (A) Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri. N = 4 fare. (B,C) Tümör büyüme kinetiğini değerlendirmek için in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanıldı. (B) Temsili bir resim. Kırmızı kutudaki alan niceleme için kullanılmıştır. (C) Büyüme kinetiği. Her fareden gelen Luciferase sinyalleri gösterilir. N = 4 fare. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Islr'nin hepatositlere AAV8 aracılı gen iletimi, BMP sinyalini arttırır, tümör proliferasyonunu azaltır ve KRK karaciğer metastazının portal ven enjeksiyon modelinde fare sağkalımını iyileştirir. (A) Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi. AAV-Islr veya AAV-mRuby2'nin kuyruk veni enjeksiyonundan iki hafta sonra, CRC tümöroidlerinin portal ven enjeksiyonu yapıldı. (B ve C) Tümöroid kaynaklı lusiferaz sinyalleri IVIS kullanılarak değerlendirildi. (B) Temsili resim. (C) IVIS sinyallerinin nicelleştirilmesi. N = 5 (AAV-mRuby2) ve 8 (AAV-Islr) fare. Ortalama ± S.E.M. (D) Temsili resimler. Fosforile Smad1/5/8 için immünohistokimya (IHC) (pSmad1/5/8). Smad1/5/8, BMP sinyal aktivasyonu49 üzerine fosforile edilen kemik morfogenetik protein (BMP) sinyalinin aşağı akış molekülüdür. N = her biri 4 fare. (E) Temsili resimler. Ki67 için immünohistokimya. N = her biri 4 fare. (F) Grafik özet. Kanseri kısıtlayan stromal genin AAV aracılı hepatosit yönelimli gen iletimi, KRK metastazgenezini inhibe etmek için terapötik bir strateji olarak hizmet edebilir. Hepatositlerde Islr'nin AAV8 aracılı aşırı ekspresyonu, BMP sinyallemesini ve sınırlı KRK metastaz progresyonunu artırarak metastatik nişi yeniden şekillendirdi. Ayrıntılı bilgi için Kobayashi ve ark., Gastroenteroloji, 202125'e bakınız. Log-rank testi (A) ve iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA (varyans analizi) post-hoc Sidak'ın Hafta 3'teki çoklu karşılaştırma testi ile (C). Ölçek çubukları, 50 μm. Şekil 5A-C, Gastroenterology, Cilt 160(4), Kobayashi ve ark., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021)'den Elsevier'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, fare CRC organoidlerinin portal ven enjeksiyonunun, insan KRK hepatik metastazlarının histolojik özelliklerini taklit eden fibroblasttan zengin karaciğer metastazlarını tekrarlayan bir şekilde ürettiğini gösterdik. Ayrıca, AAV8 aracılı gen terapisi gibi stroma yönelimli terapötiklerle birleştirildiğinde, bu klinik öncesi model, fare sağkalımı ve tümör büyümesi üzerindeki terapötik etkileri değerlendirmek için yararlı bir araç olarak hizmet eder.

Protokolde en azından iki kritik adım var. İlk olarak, organoidleri tamamen tripsinize ederek ve hücre kümelerini çıkarmak için bir ağ filtresi kullanarak tümöroidlerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak önemlidir. Tümöroidlerin eksik ayrışması, enjeksiyonu portal veni tıkayabilen büyük hücre agregasyonlarına neden olur. Bu, karaciğerin enfarktüsüne ve hayvan ölümüne neden olur22. İkincisi, portal ven enjeksiyonu sırasında, portal venden kanamayı en aza indirmek zorunludur. İğne portal damara düzgün bir şekilde yerleştirilmelidir. Portal venin diğer tarafının delinmesini önlemek için, yerleştirilen iğnenin açısı portal vene neredeyse paralel tutulmalıdır. Enjeksiyon sırasında portal venin yırtılmasını önlemek için, iğne portal ven içine tamamen yerleştirildikten sonra hareket ettirilmemelidir. İğneyi portal damardan çıkardıktan hemen sonra, enjeksiyon bölgesine en az 5 dakika boyunca pamuk tomurcuğu ile basınç uygulamak hayati önem taşır.

Enjeksiyon için hücre numarasının, alıcı fareye (örneğin, immünokompetan ve immün yetmezlikli fare) ve organoid hattın tümörojenisitesine göre değiştirilmesi gerekir. Deneylerimizde, 100 μL süspansiyonda 5.0 x 105 tek hücrenin enjeksiyonu, immünokompetan farelerde karaciğer metastazları üretmek için yeterliydi. Hücre sayısının arttırılması, portal vende emboli riskini ve hayvanların ölümünü artırabilir14 ve bu nedenle dikkatlice düşünülmelidir. Önceki makalelerin portal veya mezenterik ven 25,26,27,28'etümöroid enjeksiyonu için 100 μL'de 5 x 10 4 ila 5x 10 5 hücre kullandığı göz önüne alındığında, bu hücre sayısı aralığının optimizasyon için iyi bir başlangıç noktası olacağını düşünüyoruz.

Portal ven enjeksiyonu yaklaşımının bir sınırlaması, CRC metastazının tüm kaskadını tam olarak özetlememesidir. Kanserin hepatik metastazı beş ana adım gerektirir: (1) primer bölgede kanser hücresi invazyonu, (2) damara intravazasyon, (3) portal dolaşımda hücre sağkalımı, (4) portal venden karaciğer parankimine ekstravazasyon ve (5) metastatik nişkolonizasyon 50. Portal ven enjeksiyon modeli sadece (3)-(5) basamaklarının araştırılmasına izin verir. Diğer metastatik süreçler hakkında fikir edinmek için, in vitro modeller ve / veya sıklıkla karaciğere metastaz yapan bir Notch1-mutant birincil CRC fare modeli gibi diğer modellerin kullanılması gerekir51.

Portal ven enjeksiyon yönteminin mevcut yöntemlere göre önemi karaciğere özgü büyüme ve daha yüksek tümör yükünü içermektedir. Diğer enjeksiyon modellerinde periton yayılımı ve primer KRK modellerinde primer tümör büyümesi, karaciğer metastazı progresyonunun analizini karıştırabilir. Buna karşılık, portal ven yaklaşımımız hızla karaciğere özgü tümörler üreterek sağkalım ve tümör büyüme analizlerini basitleştirir.

Organoid transplantasyonunun hücre hattı enjeksiyonuna göre en büyük avantajlarından biri, tümöroidlerin portal ven enjeksiyonunun, insan metastatik CRC'sinin desmoplastik bir özelliğini fenokopyalayan fibroblast bakımından zengin tümör mikroçevresini oluşturmasıdır. Organoid kültür koşulları, tümör mikro ortamının özelliklerini özetler ve hücrelerin zengin ve karmaşık bir 3D ECM'yegömülmesi de dahil olmak üzere bağırsak kök hücre popülasyonlarını destekler 24,52. Bu, kaynak tümörün genetik manzarasını koruyacak şekilde tümör hücresi yayılımı ile sonuçlanır52,53. Buna karşılık, tümör hücre hatlarının geleneksel 2D kültürü, klonal seleksiyon ve orijinal kanserlerin özelliklerini sadık bir şekilde yansıtmayan anormal genomik / transkriptomik değişiklikler ile ilişkilidir54. Kanser hücre hatlarının 2D kültürü için nispeten sert kültür koşullarının, hücreleri ECM / büyüme faktörü sinyallerinin eksikliğine uyum sağlamaya zorladığını ve daha sonra in vivo olarak stroma bakımından fakir tümörlere neden olabileceğini, çünkü hücrelerin artık hayatta kalmak için stroma kaynaklı sinyallere ihtiyaç duymadığını tahmin ediyoruz.

Organoid portal ven enjeksiyon modelini AAV8 aracılı gen tedavisi ile birleştirerek, karaciğerde kanser hücresi kolonizasyonundan önce hepatositlere kanser inhibitör bir yükün verilmesinin, CRC metastaz büyümesini inhibe etmek için (öncesi) metastatik nişi değiştirebileceğini bulduk.25. Cesaret verici bir şekilde, klinik çalışmalar, karaciğere AAV aracılı in vivo gen transferinin bir transgenin uzun süreli ekspresyonunu indüklediğini ve neoplastik olmayan genetik hastalıkların tedavisinde etkili ve güvenli bir yöntem olabileceğini göstermiştir30,31,55. Gelecekte, AAV yaklaşımı ile karaciğer metastazlarını önlemek için hepatositlerin kullanılması, metastaz riski yüksek olan kanser hastalarında potansiyel klinik değere sahip olabilir.

Özetle, makalemiz portal ven yoluyla KRK organoid transplantasyonunun fibroblasttan zengin karaciğer metastazları oluşturduğunu ve bunun stromayı hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesi için kullanılabileceğini göstermektedir. Portal ven enjeksiyonunu AAV aracılı gen iletimi gibi stroma yönelimli tedavi ile birleştirerek, KRK metastazı ilerlemesini sınırlamak için yeni stromal hedefler belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nden (APP1156391 to D.L.W., S.L.W.) hibelerle desteklenmiştir. (APP1081852 ila D.L.W., APP1140236 ila S.L.W., APP1099283 ila D.L.W.,); Kanser Konseyi SA, bağışçıları ve Güney Avustralya Eyalet Hükümeti adına Sağlık Bakanlığı (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından görevlendirilen Bilimsel Araştırma Yardımı (B) (M.T.'ye 20H03467); AMED-CREST (Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı, Evrimsel Bilim ve Teknoloji için Temel Araştırma (19gm0810007h0104 ve 19gm1210008s0101'den A.E.'ye); AMED'den Kanser Araştırma ve Terapötik Evrim Projesi (P-CREATE) (19cm0106332h0002'den A.E.'ye); Japonya Genç Araştırmacılar için Bilimi Teşvik Yurtdışı Mücadele Programı Derneği (HK'ye), Takeda Bilim Vakfı Bursu (HK'ye), Greaton Uluslararası Doktora Bursu (HK'ye), Lions Tıbbi Araştırma Vakfı Bursu (K.G.'ye).

Rekombinant AAV vektörleri ürettiği için Vektör ve Genom Mühendisliği Tesisi'nden (VGEF), Çocuk Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden (CMRI) (NSW, AVUSTRALYA) Dr. Leszek Lisowski'ye teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 175
Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter