Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Portal veneinjektion af kolorektal cancer organoider til at studere levermetastasen Stroma

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

Portal veneinjektion af kolorektal cancer (CRC) organoider genererer stroma-rige levermetastaser. Denne musemodel af CRC-levermetastase repræsenterer et nyttigt redskab til at studere tumor-stroma-interaktioner og udvikle nye stroma-rettede terapier såsom adeno-associerede virusmedierede genterapier.

Abstract

Levermetastase af kolorektal cancer (CRC) er en førende årsag til kræftrelateret død. Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er), en vigtig bestanddel af tumormikromiljøet, spiller en afgørende rolle i metastatisk CRC-progression og forudsiger dårlig patientprognose. Der mangler dog tilfredsstillende musemodeller til at studere krydstalen mellem metastatiske kræftceller og CAF'er. Her præsenterer vi en metode til at undersøge, hvordan levermetastaseprogression reguleres af den metastatiske niche og muligvis kan begrænses af stroma-rettet terapi. Portalveneinjektion af CRC-organoider genererede en desmoplastisk reaktion, som trofast rekapitulerede den fibroblastrige histologi af humane CRC-levermetastaser. Denne model var vævsspecifik med en højere tumorbyrde i leveren sammenlignet med en intra-miltinjektionsmodel, hvilket forenklede museoverlevelsesanalyser. Ved at injicere luciferase-ekspresserende tumororganoider kunne tumorvækstkinetik overvåges ved in vivo-billeddannelse . Desuden giver denne prækliniske model en nyttig platform til at vurdere effekten af terapi rettet mod tumormesenchymet. Vi beskriver metoder til at undersøge, om adeno-associeret virusmedieret levering af et tumorhæmmende stromal-gen til hepatocytter kunne ombygge tumormikromiljøet og forbedre musens overlevelse. Denne tilgang muliggør udvikling og vurdering af nye terapeutiske strategier til at hæmme levermetastase af CRC.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) er en væsentlig årsag til kræftdødelighed på verdensplan1. Mere end halvdelen af CRC-patienterne udvikler levermetastase, der opstår gennem portalveneformidlingen1. I øjeblikket er der ingen effektive terapier, der kan helbrede avanceret levermetastase, og de fleste patienter bukker under for metastatisk sygdom.

Det metastatiske niche- eller tumormikromiljø spiller en nøglerolle i engraftment og vækst af formidlede CRC-celler2. Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er), en fremtrædende komponent i tumormikromiljøet, fremmer eller begrænser kræftprogression gennem udskillelse af vækstfaktorer, ombygning af den ekstracellulære matrix (ECM) og modulering af immunlandskaber og angiogenese 3,4,5. CAF'er giver også resistens over for kemoterapier og immunterapier3. Desuden regulerer CAF'er initiering og progression af CRC-levermetastase og forudsiger prognose hos patienter med CRC 3,6,7,8. CAF-relaterede faktorer kan således udnyttes til udvikling af terapeutiske strategier til at hæmme CRC-levermetastase. Manglen på tilfredsstillende musemodeller til at studere den metastatiske tumor stroma har imidlertid været en stor hindring for at udvikle stroma-målrettede terapier.

I øjeblikket omfatter dyremodeller til undersøgelse af CRC-levermetastase primære CRC-modeller, der spontant udvikler levermetastase og kræftcelletransplantationsmodeller i leveren. Primære CRC-musemodeller, såsom genetisk manipulerede musemodeller og koloninjektion af kræftceller, viser sjældent metastase til leveren 9,10,11,12. Desuden, selvom en levermetastase observeres, viser disse modeller lang latenstid fra den primære tumorinduktion til metastase og dør potentielt af primær tumorbyrde12. For effektivt at generere CRC-levermetastaser transplanteres dyrkede CRC-celler i leveren ved hjælp af tre injektionsmetoder: intra-miltinjektion, direkte intra-parenkym injektion i leveren og portalveneinjektion. Intra-splenisk injicerede kræftceller spredes ind i miltvenen, portalvenen og i sidste ende til leveren13,14. Den intra-miltinjektion giver imidlertid et lavere tumorudtagelsesforhold sammenlignet med andre transplantationsmodeller 15,16. Ved intra-miltinjektion udføres kirurgisk fjernelse af milten for at undgå kræftvækst i milten, hvilket potentielt kan kompromittere immuncellemodningen17. Desuden kan intra-miltinjektion også resultere i utilsigtet tumorvækst i milten og bughulen18, hvilket komplicerer levermetastaseanalyser. Direkte intra-parenkymal injektion i leveren inducerer effektivt levermetastase 16,19,20. Ikke desto mindre rekapitulerer denne tilgang ikke fuldt ud et biologisk trin af levermetastase, der naturligt forekommer gennem portalveneformidling. Ved hjælp af direkte injektion i leveren kan indtrængen af kræftceller i en ikke-portal, men systemisk cirkulation også resultere i flere store lungemetastaser16. Selvom et flertal af patienter med CRC-levermetastase viser flere tumorknuder i leveren21, genererer direkte injektion i en bestemt leverlap en enkelt tumormasse 19,20. Portal veneinjektion eller mesenterisk veneinjektion, selvom det er teknisk udfordrende, muliggør effektiv levering af tumorceller i leveren på en måde, der rekapitulerer de vækstmønstre, der ses hos patienter17. Denne strategi kan minimere muligheden for metastaser på sekundært sted og muliggør hurtig vækst af kræftceller i leveren, hvilket forenkler museoverlevelsesanalyser.

Historisk set blev kolorektal cancer cellelinjer som mus MC-38, human HT-29 og SW-620 brugt til at generere musemodeller af levermetastase22,23. Imidlertid inducerer disse kolorektale kræftcellelinjer ikke en desmoplastisk stromal reaktion. Lavt stromalindhold i tumorerne gør det vanskeligt at undersøge de biologiske roller af kræftassocierede fibroblaster. Nylige fremskridt inden for CRC-organoider og deres transplantation har tilbudt nyttige platforme til at vurdere stromaens vitale roller i kræftprogression24. Levertransplantation af CRC-organoider genererer et fibroblastrigt tumormikromiljø og har givet ny indsigt i stromal forskning 6,25. I øjeblikket er portal eller mesenterisk veneinjektion af organoider blevet en guldstandardmetode til at generere CRC-levermetastase 6,25,26,27,28. Ikke desto mindre har ingen tidligere artikler, så vidt vi ved, beskrevet detaljerede metoder til portalveneinjektion af kolorektale tumoroider. Her præsenterer vi en metode til brug af portalveneinjektion af CRC-organoider til at udvikle ny adeno-associeret virus (AAV)-medieret stroma-rettet terapi.

Hepatocytter er en vigtig bestanddel af det metastatiske tumormikromiljø i leveren og spiller en kritisk rolle i metastatisk kræftprogression29. Inspireret af succesen med AAV-genterapitilgange til at inducere proteinekspression i hepatocytter hos ikke-neoplastiske patienter 30,31 undersøgte vi en lignende tilgang, men havde til formål at ændre levertumormikromiljøet i CRC25. Som sådan beskriver vi også heri haleveneinjektionen af AAV8 for at inducere ekspression af antitumorigene proteiner for at ændre levertumormikromiljøet. AAV8-serotypen, der er udpeget ved valget af viralt capsidprotein under virusproduktion, fører til høj transduktionseffektivitet specifikt af hepatocytter (dvs. målrettet genekspression i levertumormikromiljøet)32. Vi har tidligere vist, at Islr (immunoglobulin superfamilie indeholdende leucinrig gentagelse) er et CAF-specifikt gen, der inducerer knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, reducerer CRC tumoroid vækst og fremmer Lgr5+ intestinal stamcelledifferentiering25. Vi testede, om AAV8-medieret overekspression af det kræftbegrænsende stromale gen, Islr, i hepatocytter kunne dæmpe udviklingen af levermetastase ved at udføre portalveneinjektion af CRC-tumoroider i AAV8-Islr-behandlede mus.

I dette papir beskriver vi først haleveneinjektionsproceduren for levertropisk AAV. Derefter beskriver vi en metode til tumoroid celleforberedelse og portalveneinjektion i de AAV-behandlede mus. Endelig præsenterer vi tilgange til overvågning af metastatisk tumorprogression for at vurdere effekten af stroma-rettet terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg i denne artikel blev gennemgået og godkendt af South Australian Health and Medical Research Institute Animal Ethics Committee (godkendelsesnummer, SAM322).

1. Haleveneinjektion af adeno-associeret virus

BEMÆRK: Adeno-associeret virus (AAV) bør håndteres som en biofare i henhold til retningslinjerne for biosikkerhedsniveau 1. Der henvises til den offentliggjorte protokol for AAV-forberedelse, rensning og titrering33. Hepatocyt-tropisk AAV, AAV834, der koder for cytomegalovirus (CMV) promotor-Islr-genet, blev anvendt i denne undersøgelse25. For at fremkalde AAV-medieret overekspression kan AAV-dosering kræve optimering afhængigt af promotoraktiviteten, genet og musens vægt.

  1. Fortynd AAV-vektoren til 150 μL-alikvoter indeholdende 1,0 x 1011 virale genomer ved hjælp af sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) og opbevar det på is. Personlige værnemidler skal bæres for at håndtere AAV.
    BEMÆRK: Gentagen fryse- og optøningscyklus reducerer virustiter og bør undgås. Stamvirusopløsningen skal opbevares i en -80 °C fryser.
  2. Tænd for en varmeboks (dyreopvarmningskammer) for at forvarme til 35 °C.
  3. Hold en mus og påfør en topisk anæstesicreme på hele længden af halen mindst 15 minutter før haleveneinjektionen.
    BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin og er muligvis ikke nødvendigt, hvis det ikke kræves af instituttets dyreetiske komité. Følg protokollen godkendt af den lokale dyreetiske komité. I dette eksperiment25 blev en Rosa26-Cas9-mus anvendt til AAV-injektion og efterfølgende portalveneinjektion af CRC-organoider. I betragtning af at tumoroider, der blev anvendt i denne undersøgelse, var afledt af en Rosa26-Cas9-mus (C57BL/6 x 129 genetisk baggrund), blev denne musestamme også anvendt som immunkompetente, syngeneiske modtagere af tumortransplantationen. Han- og hunmus Rosa26-Cas9 (6 til 24 uger gamle) blev brugt.
  4. Placer musen i varmeboksen. Lad musen stå i op til 15 minutter for at varme og udvide halevenerne.
  5. Fastgør forsigtigt musen i en gnaverholder. Placer halen under en varmelampe for at sikre fuld udvidelse af haleårer.
  6. 150 μL fortyndet AAV (fremstillet i trin 1.1) trækkes op i en steril sprøjte med lavt dødt rum med en 27-30 G nål.
  7. Flyt varmelampen og identificer den laterale haleven placeret på siderne af halen. Sæt let spænding på halen med fingrene, så halen bliver lige.
  8. Indsæt langsomt 2-3 mm af nålen, skrå op, i venen. Nålen skal være næsten parallel med halen (op til 15° fra halen).
    BEMÆRK: Blodtilstrømning i sprøjten kan observeres, hvis nålen med succes er placeret i venen.
  9. Injicer langsomt. Hvis der mærkes en modstand, eller der observeres hævelse af huden, skal du fjerne nålen og indsætte den igen over det første sted eller til den anden laterale vene.
  10. Vent i ca. 5 s efter afslutningen af injektionen, og fjern derefter langsomt nålen. Påfør straks blidt tryk på injektionsstedet med et rent gasbind eller papirhåndklæde, indtil blødningen stopper.
  11. Slip forsigtigt musen i buret. Overvåg dyret for at sikre, at blødningen er stoppet.
    BEMÆRK: Genoverekspression i leveren kan vurderes 1 til 2 uger efter AAV hale veneinjektion. Dette kan for eksempel bekræftes ved RNA in situ-hybridisering (ISH), immunohistokemi (IHC), western blotting eller kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qRT-PCR; Figur 1A,B). I et tidligere offentliggjort studie25 blev AAV8-Islr brugt til at overudtrykke musens Islr-gen i hepatocytter, og overekspressionen blev påvist af RNA ISH (figur 1A,B).

2. Celleforberedelse til kolorektal cancerorganoider

BEMÆRK: CRC-organoider, der anvendes til dette eksperiment, indeholder udelukkende epitelceller. Kultur og generation af CRC-organoider er tidligere beskrevet25,35. Kort sagt blev normale kolonepitelceller isoleret fra tyktarmen i en Rosa26-Cas9-mus ved hjælp af en kryptisoleringsbuffer (5 mM EDTA (ethylendiamintetraacetat) i iskold PBS) og derefter indlejret i kældermembranmatrixmedium og dyrket i organoid vækstmedium som beskrevet i reference35. Derefter blev Apc- og Trp53-mutationer introduceret til tyktarmsepitelcellerne ved at overudtrykke enkeltguide-RNA'er, der er målrettet mod Apc og Trp53 ved hjælp af lentivirusekspressionsprotokol. Enkelte organoidkloner blev håndplukket25. EnpcΔ/Δog Trp53Δ/Δ tyktarmskræftorganoider (AP-tumoroider) blev injiceret som 5,0 x 105 enkeltceller i 100 μL PBS med 10 μM Y-27632 i portalvenen pr. mus med organoidkultur og enkeltcellepræparat beskrevet nedenfor.

  1. Kultur CRC-organoiderne i kælderen membranmatrix medium kupler i en 24-brønds plade eller 10 cm skål 3-5 dage før portalveneinjektionen for at opnå organoider med en diameter på 50-400 μm.
  2. Forbered tilstrækkelig mængde celleløsningsopløsning ved at tilsætte Y-27632 til 10 μM koncentration, nok til at fordøje antallet af organoider, der dyrkes til injektionen. Forvarm i et 37 °C vandbad.
    BEMÆRK: Celleløsningsopløsningen, der anvendes i denne protokol, er en rekombinant celle-dissociationsenzymblanding og anvendes som erstatning for trypsin i organoidkultur (se Tabel over materialer). Det reducerer cellulær skade forårsaget af celle dissociation sammenlignet med trypsin36. Y-27632 er en Rho-kinasehæmmer og hæmmer dissociationsinduceret celledød og øger derved enkeltcelleoverlevelsen37.
    1. Til injektion i op til fem mus forberedes to rør indeholdende 40 ml af celleløsningsopløsningen for at fordøje 10-24 x 50 μL kældermembranmatrixkupler med hver kuppel indeholdende ca. 300 organoider (50-400 μm diameter), dvs. hver mus injiceres med 2-4,8 kupler af organoider (svarende til ca. 600-1440 organoider). Antallet af organoider, der er nødvendige for at opnå tilstrækkeligt celleantal, afhænger af organoidlinjen og bør derfor optimeres.
      BEMÆRK: Det andet 40 ml rør muliggør en gentagen fordøjelse med frisk celleløsningsopløsning for at opnå dissocierede enkeltceller.
  3. Aspirer forsigtigt organoidmediet fra hver brønd.
  4. Tilsæt 1 ml iskold PBS til hver brønd i en plade med 24 brønde. Hvis der anvendes en 10 cm skål, tilsættes 10 ml iskold PBS til skålen.
  5. Rids kældermembranmatrixmediet af ved hjælp af en P1000-pipettespids. Overfør PBS/medium gylle til et 15 ml centrifugerør.
  6. Skyl hver brønd med den samme mængde PBS for at opsamle kældermembranmatrixfragmenter og tilsæt til 15 ml røret (e).
  7. Inkuber i 5 minutter på is. Denne inkubation hjælper med at opløse kældermembranmatrixmediet.
  8. Centrifugering af røret ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  9. Aspirer supernatanten, der sikrer ikke at forstyrre det pelleterede medium og celler.
  10. Tilsæt 5 ml forvarmet celleløsningsopløsning fremstillet i trin 2.2 til pelleten, genophænd pelleten 10 gange, og overfør den tilbage til et 50 ml rør indeholdende frisk, forvarmet celleløsningsopløsning.
  11. Anbring røret i vandbadet på 37 °C. Inkuber i 5 min.
  12. Centrifugering af røret ved 400 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  13. Gentag trin 2.9-2.11.
    BEMÆRK: Gentagen enzymatisk fordøjelse muliggør effektiv cellesociation i enkeltceller.
  14. Kontroller, om organoiderne dissocieres i enkeltceller ved at pipettere 100 μL i en 96-brønds plade og observere under et mikroskop. Hvis mange organoider viser celleklumper bestående af mere end fire celler, kan længere inkubation med celleløsningsopløsningen og fysisk dissociation ved trituration med en 10 ml pipette være nødvendig.
  15. Når de fleste celler er enkeltceller, tilsættes 4 ml føtalt kvægserum (FBS) i 40 ml cellesuspensionen for at stoppe fordøjelsen. Skyl en 40 μm cellesil med 5 ml PBS.
  16. Før cellesuspensionen gennem cellesilen ind i et 50 ml opsamlingsrør for at fjerne eventuelle celleklumper.
  17. Centrifugering af røret ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  18. Aspirer supernatanten. Tilsæt 10 ml kold PBS til cellepillen og overfør den til et 15 ml centrifugerør.
  19. Centrifugering af røret ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  20. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 500 μL kold PBS med 10 μM Y-27632. Tæl cellerne.
  21. Juster cellekoncentrationen til 5,0 x 105 enkeltceller/100 μL ved hjælp af PBS med 10 μM Y-27632. Placer røret på is, indtil portalveneinjektion udføres.
    BEMÆRK: Det anbefales at injicere dissocierede celler inden for 4 timer efter dissociation.

3. Portalveneinjektion af CRC-organoider

BEMÆRK: Alle kirurgiske instrumenter og kirurgiske gasbind skal autoklaveres eller steriliseres inden operationen. Denne protokol er ændret fra en tidligere protokol17. I dette eksperiment25 blev portalveneinjektion udført under anvendelse af Rosa26-Cas9-mus behandlet med AAV-mRuby2 eller AAV-Islr i trin 1.

  1. Forbered et aseptisk kirurgisk område ved hjælp af sterile gardiner på en varmepude.
  2. Forbered kirurgiske instrumenter (saks og tang), kirurgisk og hæmostatisk svamp, 4-0 polyglactinsutur, bomuldsknopper, hudhæftemaskine, hæftemaskineapplikator, saltvand, buprenorphin og 33 G nål fastgjort til en Hamilton-sprøjte. Skær den hæmostatiske svamp i stykker på 1,0 cm x 1,0 cm.
  3. Juster lyskildens position for at belyse det kirurgiske område.
  4. Injektion af 0,1 mg/kg legemsvægt af buprenorphin subkutant til en mus til kirurgisk smertebehandling.
  5. Bedøvelse musen med isofluran i et anæstesikammer. Isoflurankoncentrationen til induktion og vedligeholdelse er normalt henholdsvis 5% og 2,5%. Kontroller, om der ikke er en reaktion på tåklemme, inden du påbegynder den næste procedure.
  6. Barber midten til musens øvre del med en elektrisk barbermaskine. Barbering skal udføres i et område fjernt fra det aseptiske kirurgiske område for at undgå, at hår forurener stedet.
  7. Rengør snitstedet skiftevis med Betadin og 80% ethanol for at sterilisere det kirurgiske område. Gentag tre gange.
  8. Placer musen på en varmepude i liggende stilling med vedligeholdelsesisofluranbedøvelse. Placer en kirurgisk drapering med et hul over musens underliv.
  9. Løft mavehuden med tang og lav et 2-3 cm hudsnit ved midterlinjen med en saks, og skær kun huden (ikke underliggende bughinden). Snittet skal variere fra midten af maven til brystbenets xiphoide proces. Snittet bør ikke gå over den nedre ende af xiphoidprocessen.
  10. Løft peritonealvæggen fuldt ud med tang og lav et lignende snit på 2-3 cm til bughinden med en saks. Undgå at skære tarmen og membranen.
  11. Sug den kirurgiske gasbind med varmt saltvand og læg det på venstre side af snittet (på venstre side af musens krop; til kirurgens højre).
  12. Træk forsigtigt de indre organer (små og tyktarmen) ud ved hjælp af en vatpind gennemblødt med saltvand. Placer tarmene på gasbindet gennemblødt med saltvand.
    BEMÆRK: Musens venstre tarme (dvs. tarmene på kirurgens højre) skal først trækkes ud, og derefter kan musens højre tarm (dvs. tarmene på kirurgens venstre) trækkes ud.
  13. Juster tarmens position for at visualisere portalvenen. Dæk tarmene med yderligere våd gasbind for at holde tarmene fugtige.
  14. Træk forsigtigt tarmen til venstre side med den våde gasbind og påfør blid spænding til venstre. Dette letter visualisering af portalvenen (figur 2A).
    BEMÆRK: Hvis visualisering af portalvenen er vanskelig, kan forsigtig justering af mavens position med en våd vatpind hjælpe visualiseringen.
  15. Forsigtigt pipette tumoroid suspension flere gange for at opnå en homogen celle suspension. Træk langsomt 100 μL af cellesuspensionen op i en Hamilton-sprøjte, der er fastgjort til en 33 G-nål. Undgå luftbobler.
  16. Indsæt langsomt nålen, skrå op, i portalvenen. Indsættelsesdybden langs nålen skal være 3-4 mm, med nålevinklen næsten parallelt med portalvenen.
    BEMÆRK: Injektion skal udføres i den velvisualiserede del af portalvenen (normalt op til 2 cm væk fra leveralum). Undgå bevægelse af nålen, når den er helt indsat i portalvenen.
  17. Injicer tumorceller i 30 s. Injektionen skal udføres langsomt for at forhindre okklusion af portalvenen. Hvis injektionen er vellykket, ændres leverens farve midlertidigt fra rød til hvid.
  18. Fjern nålen langsomt. Påfør straks blidt tryk på injektionsstedet med en tør vatpind og vent i 5 minutter.
  19. Fjern vatpindet og påfør samtidig en hæmostatisk svamp på injektionsstedet. Hold hæmostatisk svamp med en vatpind eller tang og påfør blidt tryk i 5 minutter mere.
  20. Fjern trykket til den hæmostatiske svamp og bekræft, at der ikke er blødning fra injektionsstedet.
    BEMÆRK: Den bioabsorberbare hæmostatiske svamp behøver ikke fjernes. Forsøg på at fjerne gasbindet kan forårsage genblødning fra injektionsstedet.
  21. Hvis der opstår blødning, skal du straks udføre trykhæmostase med en vatpind i ca. 10 minutter. Påfør derefter en ekstra hæmostatisk svamp i yderligere 5 minutter.
    BEMÆRK: Hvis der observeres ukontrollabelt blodtab, skal musen aflives i henhold til den protokol, der er godkendt af instituttets dyreetiske komité.
  22. Fjern de kirurgiske gasbind på tarmene. Brug en sprøjte fyldt med 5 ml saltvand, sprøjt saltvand til tarmene for at forhindre organadhæsion.
    BEMÆRK: Påfør ikke saltvand på portalvenens injektionssted. Dette kan forårsage genblødning.
  23. Placer forsigtigt tarmene tilbage inde i bukhulen.
  24. Sutur peritoneum ved hjælp af 4-0 polyglactin suturer.
  25. Løft begge sider af huden op med tang. Påfør hudhæfteklammer for at lukke hudsnittet. Pas på ikke at hæfte tarmen.
  26. Sluk for isofluranen, men hold iltstrømmen kørende. Overvåg musen omhyggeligt. Når musen vågner, skal du placere musen i et tomt bur på en varmepude. Musen vågner typisk inden for 5 min.
  27. Overvåg forsigtigt musen, indtil den er bevidst og ambulerer normalt.
  28. Subkutant injicere 0,1 mg/kg buprenorphin til musen 4 timer efter operationen.
  29. Musen injiceres 0,1 mg/kg buprenorphin hver 24. time i de efterfølgende 2 dage.
  30. Overvåg omhyggeligt musene dagligt i en uge efter operationen. Kontroller suturer og sårheling.
  31. dage efter operationen skal du fjerne hudhæfteklammer ved hjælp af en hæftemaskinefjerner.

4. Vurdering af tumorvækstkinetik ved in vivo bioluminescerende billeddannelse

BEMÆRK: Hvis Firefly-ekspressoroider anvendes til injektion, kan metastatisk tumorprogression overvåges ugentligt ved in vivo-billeddannelse som beskrevet38,39. Luciferase udtrykt af kræftceller kan fremkalde immunresponser mod kræftcellerne og begrænse tumorvækst40. Således er forsigtighed berettiget til at analysere immunfænotyper og kræftprogression i en musemodel ved hjælp af luciferase-ekspresserende tumorceller.

  1. Der fremstilles en 30 mg/ml opløsning af D-luciferin ved hjælp af steril PBS. Beskyt det mod lys. D-luciferin bør opbevares i alikvoter ved -20 °C indtil brug.
  2. Barber maven og brystkassen med en elektronisk barbermaskine. Dette kan gøres op til 1 dag før in vivo-billeddannelse .
  3. 150 mg/kg legemsvægt af D-luciferin intraperitonealt injiceres i mus (dvs. hvis musens kropsvægt er 30 g, injiceres 150 μL af D-luciferinopløsningen).
  4. Placer musene i et anæstesikammer og bedøve dem. Brug 5% isofluran til induktion og 2% -3% til vedligeholdelse.
  5. min. senere skal musene placeres i en lateral position (højre side op). Anskaf bioluminescensbilleder ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS) som beskrevet tidligere38,39.
    BEMÆRK: Mus er mere stabile i en lateral position sammenlignet med liggende stilling. Derfor foretrækkes en lateral position for at opnå et luminescensbillede fra et konsistent brændplan.
  6. Placer musene i et tomt bur og overvåg deres genopretning.
  7. Definer områder af interesse på den øvre del af maven ved hjælp af Living Image Software som beskrevet38. Kvantificer total flux som surrogat for tumorcelleantal.

5. Overlevelsesanalyse og vævsindsamling

  1. Overvåg mus omhyggeligt for kliniske symptomer på metastaser, såsom en udspilet mave.
  2. Afliv en mus ved CO2 - indånding, når den når humane endepunkter.
    BEMÆRK: Brug et undersøgelsesendepunkt, der er godkendt af instituttets dyreetiske komité. For at bestemme et humant endepunkt blev der anvendt et klinisk diagramark; score blev beregnet ved et punkt, der blev givet for tilstedeværelsen af hver af følgende observationer: vægttab > 15%, bøjet kropsholdning, flæset frakke, dehydrering, nedsat bevægelse, udspilet mave eller ansigtsgrimasse. Når en score på 3 var nået, blev musene humant aflivet.
  3. Umiddelbart efter eutanasi udføres transkardial perfusionsfiksering med 30-50 ml 10% formalin i en stinkhætte som beskrevet41. Lav flere små snit (op til 1 cm hver) med en saks ind i den normale del af leveren før perfusion for at generere afsætningsmuligheder for blod og formalin. Ved perfusion vil leverfarven ændre sig fra rød til brun.
    BEMÆRK: Hvis mikrometastaser i makroskopisk normale leverområder er genstand for undersøgelse, anbefaler vi forskere ikke at skære leveren, men at klippe den overlegne vena cava i stedet. Men når vi har brugt denne metode, virker fiksering af leveren dårligere sammenlignet med at skære leveren. Især hvis RNA in situ-hybridisering (ISH) er planlagt til at blive udført på leversektioner, anbefaler vi at lave snit i leveren før intra-hjerteinjektion af formalin, som beskrevet ovenfor. Dette muliggør tilstrækkelig fiksering af levervævet, hvilket resulterer i bevarelse af RNA-integritet for ISH.
  4. Placer lever- og lungevævet i 10% formalin og fikser natten over. Udskift formalinen med 70% ethanol efterfulgt af paraffinindlejring.
  5. Udfør hæmatoxylin og eosinfarvning for histologisk at evaluere tumorområdet. Udfør immunhistokemi for stromale markører af interesse. Udfør Picro-Sirus Red farvning for at evaluere kollagen-positive områder.
    BEMÆRK: ImageJ-softwaren42 kan bruges til at kvantificere immunhistokemi og Picro-Sirius Res-farvningsdata. En farvedekonvolutionsfunktion og MR-fibroseværktøjet kan bruges til at evaluere henholdsvis 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-positive områder og Picro-Sirius rød-positive områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at inducere AAV-medieret overekspression af et tumorbegrænsende stromalgen, Islr 4,25,43,44, i hepatocytter, injicerede vi intravenøst Islr-kodende AAV8. 1,0 x 1011 virale genomer (vg) af AAV8-Islr eller som en kontrol, AAV8-mRuby2, blev injiceret i den voksne musehalevene (figur 1A). To uger efter haleveneinjektionen blev lever høstet for at validere overekspressionen af Islr i hepatocytter. Vi udførte RNAscope in situ hybridisering45 og bekræftede, at der blev observeret 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)+ signaler i hele leveren (figur 1B). Der blev ikke påvist DAB+-signaler i leveren fra en AAV8-mRuby2-behandlet mus.

Vi praktiserede portalveneinjektionsproceduren ved at injicere indisk blæk (1:1000 fortynding i PBS). Efter at have lavet et snit i den øvre del af maven blev tarmene forsigtigt taget ud fra abdominalrummet for at muliggøre visualisering af portalvenen (figur 2A). Portalveneinjektion af indisk blæk leverede blækket gennem leveren, men ikke til lungen (figur 2B). Hvis blækket fejlagtigt injiceres i andre kar, såsom den ringere vena cava (IVC) eller abdominal aorta, ændrer den systemiske cirkulation af blækket lungefarven til sort. Indien blæk hjælper også med at identificere mængden af lækage fra portalvenen, hvilket indikerer pancreas eller peritoneal formidling.

To uger efter haleveneinjektionen af AAV-mRuby2 blev ApcΔ/Δ og Trp53Δ/Δ tyktarmskræftorganoider (AP-tumoroider) dissocieret til enkeltceller og injiceret i museportalvenen (figur 3A). For at bekræfte metastatisk tumorvækst og evaluere histologi indsamlede vi leverne 3-4 uger efter portalveneinjektionen (dvs. på et tidsindstillet tidspunkt snarere end ved et humant endepunkt), før fremtrædende nekrose forvirrer histopatologiske analyser. Makroskopisk resulterede portalveneinjektionen af tumoroider i flere hvide tumorknuder i leveren (figur 3B). Vi fandt ud af, at intra-miltinjektion af det samme celleantal tumoroider ikke genererede en stor metastatisk tumormasse. Dette tyder på, at portalveneinjektionsmetoden mere effektivt inducerede levermetastaser sammenlignet med den intra-miltinjektionsmodel. Hæmatoxylin og eosinfarvning af CRC-levermetastaserne induceret af portalveneinjektionen viste histopatologi af moderat differentieret rørformet adenocarcinom ledsaget af en desmoplastisk stromal reaktion og nekrose (figur 3C). Denne stroma-rige histologi rekapitulerede trofast humane CRC-levermetastaser (figur 3C), hvilket gjorde denne model egnet til translationel forskning, der undersøgte den metastatiske tumorstroma. Desuden viste immunhistokemi for alfa-glat muskel actin (αSMA), en veletableret markør for CAF'er, at ca. 7% af tumorområderne var αSMA-positive, hvilket bekræftede tilstedeværelsen af CAF'er i denne musemodel (figur 3D,E). Picro-Sirius rød farvning, der pletter kollagen46, viste rigelig ECM i tumormesenchymet med ca. 13% af tumorområderne positive for kollagen (figur 3D,E). Immunohistokemi for EPCAM, en epitelafstamningsmarkør, afslørede, at den metastatiske CRC viste tumor spirende (en enkelt tumorcelle eller en celleklynge på op til fire tumorceller), der er karakteristisk for dårlig prognose kolorektal cancer47 (figur 3F). Ki67-mærkningsindekset i den metastatiske CRC var ca. 80%, hvilket indikerer, at de fleste tumorceller er mitotisk aktive (figur 3G,H).

Vi udførte museoverlevelses- og tumorvækstkinetikanalyser i denne prækliniske model. Musene i vores første pilotkohorte viste en median overlevelse på 57 dage efter tumoroid injektion i portalvenen (N = 4 mus; Figur 4A). Dette blev senere replikeret i AAV8-mRuby2-injicerede grupper25 med større kontrol. Ved humant endepunkt (som vist i NOTE, trin 5.2) viste 3 ud af 4 mus i pilotgruppen ascites, hvilket også observeres hos patienter med avanceret levermetastase48. For at vurdere tumorvæksten blev in vivo imaging system (IVIS) anvendt til at måle tumoroidafledt luminescens (figur 4B,C). Bioluminescenssignalerne blev observeret i den øvre del af maven, hvilket tyder på leverspecifik tumorvækst (figur 4B). Hvis IVIS-signaler observeres i underlivet, indikerer dette peritoneal formidling eller sekundære metastaser til abdominale organer. Den ugentlige in vivo-billeddannelse gav mulighed for en langsgående vurdering af tumorvækst i hver mus (figur 4C), hvilket gjorde det lettere at overvåge en terapeutisk effekt i vores efterfølgende større undersøgelse. Tumorens hastighed var 100% (4/4 mus) som vurderet af IVIS-signaler. I dette eksperiment blev der ikke observeret makroskopisk tilsyneladende lungemetastase på tidspunktet for vævsindsamling (0/4 mus).

Endelig undersøgte vi, om AAV-medieret hepatocytstyret levering af et kræftbegrænsende CAF-gen, Islr 4,25, kunne hæmme CRC-levermetastasevækst i denne prækliniske musemodel. Især viste AAV8-Islr-behandlede mus forbedret museoverlevelse og nedsat IVIS-signaler fra tumorer (figur 5A-C) 25. Immunohistokemi til fosforyleret Smad1/5/8 viste, at hepatocytoverekspression af ISLR, en BMP-signalpotentiator, forstærket BMP-signalering i metastatiske tumorer (figur 5D). Behandling med AAV8-Islr reducerede antallet af Ki67+ prolifererende celler i CRC-levermetastasen (figur 5E). For fuld beskrivelse af resultaterne henvises til Kobayashi et al., Gastroenterologi, 202125. Vores kollektive data indikerer, at AAV8-medieret levering af et tumorhæmmende gen til hepatocytter, en vital bestanddel af levermetastatisk tumor stroma29, kunne være en effektiv forebyggende / terapeutisk tilgang til CRC-levermetastaser (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Haleveneadministreret AAV8-Islr genererer Islr-overekspression i leveren. (A) Forsøgsskema, der viser haleveneinjektion af AAV8, efterfulgt af portalveneinjektion af kolorektal cancer (CRC) organoider. ISH, in situ hybridisering; IHC, immunhistokemi; qRT-PCR, kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid. (B) Repræsentative billeder. RNA in situ-hybridisering for Islr blev udført under anvendelse af lever fra AAV8-Islr eller AAV8-mRuby2-behandlede mus. Leverne blev indsamlet 2 uger efter injektion af halevenen. Skalabjælker, 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Portal veneinjektion af indien blæk resulterer i levering til leveren, men ikke lungen. (A) Repræsentative billeder, der viser anatomi af den øvre del af maven efter laparotomi. Bemærk, at tarmene tages uden for bukhulen til visualisering af portalvenen. Billedet til højre viser en anatomisk anmærkning af hvert organ og kar. Den gule pil angiver injektionsstedet. IVC, Inferior vena cava. (B) Repræsentative billeder af leveren og lungen efter portalveneinjektion af indisk blæk. De gule pilespidser angiver kar, der er farvet med Indien-blækket. Skalabjælker, 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Portal veneinjektion af kolorektal cancer organoider genererer stroma-rige levermetastaser. (A) Eksperimentelt skema, der viser portalveneinjektion af ApcΔ / Δ og Trp53Δ / Δ tyktarmskræftorganoider (AP-tumoroider). Skala bar, 200 μm. T, tumoroider. (B) Repræsentative makroskopiske billeder af leveren, der blev indsamlet 3-4 uger efter portalveneinjektion (venstre) eller intra-miltinjektion (højre). 5,0 x 105 enkeltceller fra AP-tumoroider blev injiceret i portalvenen eller milten. Intra-splenisk injektion blev udført som beskrevet13. Hvide knuder indikerer tumorer. T, Tumor; N, Normal lever. (C) Repræsentative hæmatoxylin- og eosin (H&E) farvningsbilleder af CRC-levermetastaserne fra portalveneinjektionsmusemodellen (venstre og midten) og mennesker (højre). T, Tumor; N, Normal lever; S, Stroma; Nec, nekrose. Den gule prikkede linje angiver en grænse mellem tumoren og normal lever (venstre). (D og E) Immunhistokemi (IHC) til alfa-glat muskel actin (αSMA; venstre) og Picro-Sirius rød farvning (højre). (D) Repræsentative billeder. (E) Kvantificering af αSMA-positive områder (venstre) og Picro-Sirius rød-positive områder (højre). N = 4 mus, 5 HPF'er (High Power Fields; 400x)/mus. (F) Repræsentativt billede, der viser immunhistokemi for EPCAM, en epitelcellemarkør. De grønne prikkede linjer betegner tumor spirende. (G og H) Immunohistokemi til Ki67, en celleproliferationsmarkør. (G) Repræsentativt billede. (H) Procentdel af Ki67+ celler i samlede epitelceller. Epitelceller blev visualiseret ved hæmatoxylin modbeholdning. N = 4 mus, 5 HPF'er/mus. I (B)-(H) blev alle muselevervæv opsamlet 3-4 uger efter injektion af AP-tumoroider. Gennemsnitlig ± S.E.M. Hver prik repræsenterer en gennemsnitsværdi på 5 HPF'er fra en mus (E og H). Skalastænger repræsenterer 1 cm (B), 1 mm (C; venstre), 100 μm (C; midt og højre) og 50 μm (D, F og G). Bemærk, at undersøgelsen med humant væv blev godkendt af den etiske komité for Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Overlevelsesanalyse og tumorvækstkinetisk analyse ved in vivo-billeddannelse . (A) Kaplan-Meier overlevelseskurver. N = 4 mus. (B,C) In vivo imaging system (IVIS) blev brugt til at evaluere tumorvækstkinetik. (B) Et repræsentativt billede. Området i den røde boks blev brugt til kvantificering. C) Vækstkinetik. Luciferase signaler fra hver mus vises. N = 4 mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: AAV8-medieret genlevering af Islr til hepatocytter øger BMP-signalering, reducerer tumorproliferation og forbedrer musens overlevelse i en portalveneinjektionsmodel af CRC-levermetastase. (A) Kaplan-Meier overlevelseskurve. To uger efter haleveneinjektion af AAV-Islr eller AAV-mRuby2 blev portalveneinjektion af CRC-tumoroider udført. (B og C) Tumoroidafledte luciferasesignaler blev evalueret ved hjælp af IVIS. (B) Repræsentativt billede. C) Kvantificering af IVIS-signaler. N = 5 (AAV-mRuby2) og 8 (AAV-Islr) mus. Gennemsnitlige ± S.E.M. (D) Repræsentative billeder. Immunhistokemi (IHC) til fosforyleret Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 er et nedstrøms molekyle af knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, der fosforyleres ved BMP-signalaktivering49. N = 4 mus hver. (E) Repræsentative billeder. Immunohistokemi til Ki67. N = 4 mus hver. (F) Grafisk resumé. AAV-medieret hepatocytstyret genlevering af et kræftbegrænsende stromalt gen kan tjene som en terapeutisk strategi til at hæmme CRC-metastagenese. AAV8-medieret overekspression af Islr i hepatocytter ombyggede den metastatiske niche ved at øge BMP-signalering og begrænset CRC-metastaseprogression. For detaljerede oplysninger henvises til Kobayashi et al., Gastroenterologi, 202125. Log-rank test (A) og tovejs gentagne målinger ANOVA (analyse af varians) med post-hoc Sidaks multiple sammenligningstest i uge 3 (C). Figur 5A-C er blevet genoptrykt fra Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse har vi vist, at portalveneinjektion af mus CRC-organoider reproducerbart genererer fibroblastrige levermetastaser, der efterligner histologiske træk ved humane CRC-levermetastaser. Når den kombineres med stroma-rettet terapi såsom AAV8-medieret genterapi, tjener denne prækliniske model desuden som et nyttigt redskab til at vurdere terapeutiske virkninger på museoverlevelse og tumorvækst.

Der er mindst to kritiske trin i protokollen. For det første er det vigtigt at forberede en enkeltcellesuspension af tumoroider ved fuldt ud at trypsinisere organoiderne og bruge et maskefilter til at fjerne celleklumper. Ufuldstændig dissociation af tumoroider resulterer i storcelleaggregeringer, hvis injektion kan okkludere portalvenen. Dette forårsager infarkt i leveren og dyredød22. For det andet er det under portalveninjektion bydende nødvendigt at minimere blødning fra portalvenen. Nålen skal indsættes korrekt i portalvenen. For at undgå punktering af den anden side af portalvenen skal vinklen på den indsatte nål holdes næsten parallel med portalvenen. For at forhindre rive i portalvenen under injektionen bør nålen ikke flyttes, når den er helt indsat i portalvenen. Umiddelbart efter fjernelse af nålen fra portalvenen er det vigtigt at lægge pres på injektionsstedet med en vatpind i mindst 5 minutter.

Cellenummeret til injektion skal ændres i henhold til modtagermusen (f.eks. Immunkompetent vs. immundefekt mus) og tumorigenicitet af organoidlinjen. I vores forsøg var injektion af 5,0 x 105 enkeltceller i 100 μL suspension tilstrækkelig til at generere levermetastaser i immunkompetente mus. Forøgelse af celleantallet kan øge risikoen for emboli i portalvenen og dyrs død14 og bør derfor overvejes nøje. I betragtning af at tidligere papirer brugte 5 x 104 til 5 x 105 celler i 100 μL til tumoroidinjektion i portalen eller mesenterisk vene 25,26,27,28, mener vi, at dette cellenummerområde ville være et godt udgangspunkt for optimering.

En begrænsning af portalveneinjektionsmetoden er, at den ikke fuldt ud rekapitulerer hele kaskaden af CRC-metastagenese. Levermetastase af kræft kræver fem hovedtrin: (1) kræftcelleinvasion på det primære sted, (2) intravasation i karret, (3) celleoverlevelse i portalcirkulationen, (4) ekstravasation fra portalvenen til leverparenchymen og (5) kolonisering i den metastatiske niche50. Portalveneinjektionsmodellen tillader kun undersøgelse af trin (3)-(5). For at få indsigt i de andre metastatiske processer er det nødvendigt at anvende andre modeller såsom in vitro-modeller og/eller en Notch1-mutant primær CRC-musemodel, der ofte metastaserer til leveren51.

Betydningen af portalveneinjektionsmetoden i forhold til de eksisterende metoder omfatter leverspecifik vækst og højere tumorbyrde. Peritoneal formidling i andre injektionsmodeller og primær tumorvækst i primære CRC-modeller kan forvirre analysen af levermetastaseprogression. I modsætning hertil genererer vores portalvenetilgang hurtigt leverspecifikke tumorer, hvilket forenkler overlevelses- og tumorvækstanalyser.

En stor fordel ved organoidtransplantation i forhold til cellelinjeinjektion er, at portalveneinjektion af tumoroider genererede det fibroblastrige tumormikromiljø, der fænokopier et desmoplastisk træk ved human metastatisk CRC. Organoidkulturbetingelser rekapitulerer træk ved tumormikromiljøet og understøtter intestinale stamcellepopulationer, herunder indlejring af celler i en rig og kompleks 3D ECM med en defineret kombination af vækstfaktorer 24,52. Dette resulterer i tumorcelleudbredelse på en måde, der bevarer det genetiske landskab af kildetumoren52,53. I modsætning hertil er traditionel 2D-kultur af tumorcellelinjer forbundet med klonal selektion og afvigende genomiske / transkriptomiske ændringer, der ikke trofast afspejler karakteristika ved de oprindelige kræftformer54. Vi spekulerer i, at de relativt barske dyrkningsbetingelser for 2D-dyrkning af kræftcellelinjer tvinger cellerne til at tilpasse sig manglende ECM/vækstfaktorsignaler, som så kan resultere i stromafattige tumorer in vivo, da cellerne ikke længere kræver stroma-afledte signaler for at overleve.

Ved at kombinere organoidportalveneinjektionsmodellen med AAV8-medieret genterapi fandt vi, at levering af en kræfthæmmende nyttelast til hepatocytter før kræftcellekolonisering i leveren kunne ændre den (præ-) metastatiske niche for at hæmme CRC-metastasevækst25. Opmuntrende nok har kliniske forsøg vist, at AAV-medieret in vivo-genoverførsel til leveren inducerer langsigtet ekspression af et transgen og kan være en effektiv og sikker modalitet til behandling af ikke-neoplastiske genetiske sygdomme 30,31,55. I fremtiden kan udnyttelse af hepatocytter til forebyggelse af levermetastaser gennem AAV-tilgangen have potentiel klinisk værdi hos kræftpatienter med høj risiko for metastaser.

Sammenfattende viser vores papir, at CRC-organoidtransplantation via portalvenen genererer fibroblastrige levermetastaser, som kan udnyttes til udvikling af terapeutiske strategier rettet mod stroma. Ved at koble portalveneinjektionen med stroma-rettet terapi såsom AAV-medieret genlevering kan man identificere nye stromale mål for at begrænse CRC-metastaseprogression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Health and Medical Research Council (APP1156391 til D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 til D.L.W., APP1140236 til S.L.W., APP1099283 til D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project på vegne af sine donorer og delstatsregeringen i South Australia gennem Department of Health (MCF0418 til S.L.W., D.L.W.); et tilskud til videnskabelig forskning (B) (20H03467 til M.T.) bestilt af Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi AMED-CREST (Japans agentur for medicinsk forskning og udvikling, kerneforskning for evolutionær videnskab og teknologi (19gm0810007h0104 og 19gm1210008s0101 til AE); projektet for kræftforskning og terapeutisk udvikling (P-CREATE) fra AMED (19cm0106332h0002 til AE); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (til H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (til H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (til H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (til K.G.).

Vi takker Dr. Leszek Lisowski ved Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) for at producere rekombinante AAV-vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Tags

Kræftforskning udgave 175
Portal veneinjektion af kolorektal cancer organoider til at studere levermetastasen Stroma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter