Summary
Portalveneninjektion von Darmkrebs (CRC) Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. Dieses Mausmodell der CRC-Lebermetastasierung stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Tumor-Stroma-Interaktionen zu untersuchen und neuartige Stroma-gerichtete Therapeutika wie Adeno-assoziierte virusvermittelte Gentherapien zu entwickeln.
Abstract
Die Lebermetastasierung von Darmkrebs (CRC) ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), ein Hauptbestandteil der Tumormikroumgebung, spielen eine entscheidende Rolle bei der metastasierenden CRC-Progression und prognostizieren eine schlechte Patientenprognose. Es fehlt jedoch an zufriedenstellenden Mausmodellen, um das Crosstalk zwischen metastasierenden Krebszellen und CAFs zu untersuchen. Hier stellen wir eine Methode vor, um zu untersuchen, wie das Fortschreiten der Lebermetastasierung durch die metastasierende Nische reguliert wird und möglicherweise durch eine stromagerichtete Therapie eingeschränkt werden könnte. Die Injektion von CRC-Organoiden in die Portalvene erzeugte eine desmoplastische Reaktion, die die fibroblastenreiche Histologie der menschlichen CRC-Lebermetastasen getreu rekapitulierte. Dieses Modell war gewebespezifisch mit einer höheren Tumorlast in der Leber im Vergleich zu einem intra-Milz-Injektionsmodell, was die Überlebensanalysen der Maus vereinfachte. Durch die Injektion von Luciferase-exprimierenden Tumororganoiden konnte die Kinetik des Tumorwachstums durch In-vivo-Bildgebung überwacht werden. Darüber hinaus bietet dieses präklinische Modell eine nützliche Plattform, um die Wirksamkeit von Therapeutika zu bewerten, die auf das Tumormesenchym abzielen. Wir beschreiben Methoden, um zu untersuchen, ob die adenoassoziierte virusvermittelte Abgabe eines tumorhemmenden Stroma-Gens an Hepatozyten die Tumormikroumgebung umgestalten und das Überleben der Maus verbessern könnte. Dieser Ansatz ermöglicht die Entwicklung und Bewertung neuartiger therapeutischer Strategien zur Hemmung der Lebermetastasierung von CRC.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist weltweit eine der Hauptursachen für die Krebssterblichkeit1. Mehr als die Hälfte der CRC-Patienten entwickeln eine Lebermetastase, die durch die Verbreitung der Pfortaderauftritt 1. Derzeit gibt es keine wirksamen Therapeutika, die fortgeschrittene Lebermetastasen heilen können, und die meisten Patienten erliegen einer metastasierenden Erkrankung.
Die metastasierende Nische oder Tumormikroumgebung spielt eine Schlüsselrolle bei der Transplantation und dem Wachstum von disseminierten CRC-Zellen2. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), eine prominente Komponente der Tumormikroumgebung, fördern oder hemmen das Fortschreiten von Krebs durch Sekretion von Wachstumsfaktoren, Umgestaltung der extrazellulären Matrix (ECM) und Modulation von Immunlandschaften und Angiogenese 3,4,5. CAFs verleihen auch Resistenz gegen Chemotherapien und Immuntherapien3. Darüber hinaus regulieren CAFs den Beginn und das Fortschreiten der CRC-Lebermetastasierung und prognostizieren die Prognose bei Patienten mit CRC 3,6,7,8. So könnten CAF-bezogene Faktoren für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Hemmung der CRC-Lebermetastasierung genutzt werden. Das Fehlen zufriedenstellender Mausmodelle zur Untersuchung des metastasierenden Tumorstromas war jedoch ein großes Hindernis für die Entwicklung von stroma-zielgerichteten Therapien.
Derzeit umfassen Tiermodelle zur Untersuchung von CRC-Lebermetastasen primäre CRC-Modelle, die spontan Lebermetastasen und Krebszelltransplantationsmodelle in die Leber entwickeln. Primäre CRC-Mausmodelle, wie gentechnisch veränderte Mausmodelle und die Koloninjektion von Krebszellen, zeigen selten Metastasen in der Leber 9,10,11,12. Selbst wenn eine Lebermetastasierung beobachtet wird, zeigen diese Modelle eine lange Latenz von der primären Tumorinduktion bis zur Metastasierung und sterben möglicherweise an der primären Tumorlast12. Um CRC-Lebermetastasen effizient zu erzeugen, werden kultivierte CRC-Zellen mit drei Injektionsansätzen in die Leber transplantiert: Intra-Milz-Injektion, direkte intraparenchymale Injektion in die Leber und Pfortader-Injektion. Intra-splenal injizierte Krebszellen breiten sich in die Milzvene, die Pfortader, und schließlich in die Leberaus 13,14. Die intra-Milzinjektion ergibt jedoch ein niedrigeres Tumorentnahmeverhältnis im Vergleich zu anderen Transplantationsmodellen15,16. Bei der intra-Milzinjektion wird eine chirurgische Entfernung der Milz durchgeführt, um ein Krebswachstum in der Milz zu vermeiden, das möglicherweise die Reifung der Immunzellen beeinträchtigen kann17. Darüber hinaus kann die intra-splenische Injektion auch zu einem unbeabsichtigten Tumorwachstum in der Milz und der Bauchhöhle18 führen, was die Lebermetastasenanalysen erschwert. Direkte intraparenchymale Injektion in die Leber induziert effizient Lebermetastasen16,19,20. Nichtsdestotrotz rekapituliert dieser Ansatz einen biologischen Schritt der Lebermetastasierung, der natürlich durch die Verbreitung von Pfortaden auftritt, nicht vollständig. Durch direkte Injektion in die Leber kann der Eintritt von Krebszellen in ein Nicht-Portal, aber systemische Zirkulation auch zu mehreren großen Lungenmetastasen führen16. Obwohl eine Mehrheit der Patienten mit CRC-Lebermetastasen mehrere Tumorknoten in der Leberzeigt 21, erzeugt die direkte Injektion in einen spezifischen Leberlappen eine einzige Tumormasse 19,20. Die Injektion von Portalvenen oder Mesenterialvenen ist zwar technisch anspruchsvoll, ermöglicht jedoch eine effiziente Abgabe von Tumorzellen in die Leber auf eine Weise, die die bei Patienten beobachteten Wachstumsmuster rekapituliert17. Diese Strategie kann die Möglichkeit von Metastasen an der Sekundärstelle minimieren und ermöglicht ein schnelles Wachstum von Krebszellen in der Leber, was die Überlebensanalysen der Maus vereinfacht.
Historisch gesehen wurden Darmkrebszelllinien wie Maus MC-38, humanes HT-29 und SW-620 verwendet, um Mausmodelle der Lebermetastasierung22,23 zu erzeugen. Diese Darmkrebs-Zelllinien induzieren jedoch keine desmoplastische Stromareaktion. Der niedrige Stromagehalt in den Tumoren macht es schwierig, die biologische Rolle von Krebs-assoziierten Fibroblasten zu untersuchen. Jüngste Fortschritte bei CRC-Organoiden und ihrer Transplantation haben nützliche Plattformen geboten, um die lebenswichtige Rolle des Stromas bei der Krebsprogressionzu beurteilen 24. Die Lebertransplantation von CRC-Organoiden erzeugt eine fibroblastenreiche Tumormikroumgebung und hat neue Einblicke in die Stromaforschunggegeben 6,25. Derzeit ist die Injektion von Organoiden in portale oder mesenterische Venen zu einem Goldstandardansatz geworden, um CRC-Lebermetastasen zu erzeugen 6,25,26,27,28. Nichtsdestotrotz haben unseres Wissens keine früheren Arbeiten detaillierte Methoden zur Pfortaderinjektion von kolorektalen Tumoroiden beschrieben. Hier stellen wir eine Methodik zur Verwendung der Portalveneninjektion von CRC-Organoiden zur Entwicklung einer neuartigen Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Stroma-gerichteten Therapie vor.
Hepatozyten sind ein wichtiger Bestandteil der metastasierenden Tumormikroumgebung in der Leber und spielen eine entscheidende Rolle bei der Progression von metastasierendem Krebs29. Inspiriert vom Erfolg von AAV-Gentherapieansätzen zur Induktion der Proteinexpression in Hepatozyten bei nicht-neoplastischen Patienten30,31 untersuchten wir einen ähnlichen Ansatz, der jedoch darauf abzielte, die Mikroumgebung des Lebertumors im SFB25 zu modifizieren. Als solche beschreiben wir hierin auch die Schwanzveneninjektion von AAV8, um die Expression von antitumorigenen Proteinen zu induzieren, um die Mikroumgebung des Lebertumors zu modifizieren. Der AAV8-Serotyp, der durch die Wahl des viralen Kapsidproteins während der Virusproduktion bestimmt wird, führt zu einer hohen Transduktionseffizienz speziell von Hepatozyten (d.h. gezielte Genexpression in der Mikroumgebung des Lebertumors)32. Wir haben bereits gezeigt, dass Islr (Immunglobulin-Superfamilie mit Leucin-reicher Wiederholung) ein CAF-spezifisches Gen ist, das die Signalgebung von Knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP) induziert, das Wachstum von CRC-Tumoroiden reduziert und die Differenzierung von Lgr5+ intestinalen Stammzellen fördert25. Wir testeten, ob eine AAV8-vermittelte Überexpression des krebshemmenden Stroma-Gens Islr in Hepatozyten die Progression der hepatischen Metastasierung abschwächen könnte, indem bei AAV8-Islr-behandelten Mäusen eine Pfortveneninjektion von CRC-Tumoroiden durchgeführt wurde.
In diesem Artikel beschreiben wir zunächst das Injektionsverfahren für die Heckvene von lebertropischem AAV. Dann beschreiben wir eine Methode zur Vorbereitung tumoroider Zellen und zur Injektion von Pfortader in die AAV-behandelten Mäuse. Schließlich stellen wir Ansätze zur Überwachung der Progression metastasierender Tumore vor, um die Wirksamkeit von stromagerichteten Therapeutika zu bewerten.
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Protocol
Alle Tierverfahren in diesem Artikel wurden von der Tierethikkommission des South Australian Health and Medical Research Institute (Zulassungsnummer, SAM322) überprüft und genehmigt.
1. Tailveneninjektion des Adeno-assoziierten Virus
HINWEIS: Adeno-assoziiertes Virus (AAV) sollte als Biogefahr gemäß den Richtlinien der Biosicherheitsstufe 1 behandelt werden. Bitte beachten Sie das veröffentlichte Protokoll für die AAV-Vorbereitung, -Reinigung und -Titration33. Hepatozyten-tropisches AAV, AAV834, kodiert für das Cytomegalievirus (CMV) Promotor-Islr-Gen , wurde in dieser Studieverwendet 25. Um eine AAV-vermittelte Überexpression zu induzieren, kann die AAV-Dosierung je nach Promotoraktivität, Gen und Mausgewicht optimiert werden.
- Verdünnen Sie den AAV-Vektor in 150-μL-Aliquote, die 1,0 x 1011 virale Genome enthalten, indem Sie sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) verwenden und auf Eis halten. Persönliche Schutzausrüstung sollte getragen werden, um das AAV zu handhaben.
HINWEIS: Wiederholtes Einfrieren und Auftauen verringert den Virustiter und sollte vermieden werden. Die Viruslösung sollte in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. - Schalten Sie eine Heizbox (Tierwärmekammer) ein, um auf 35 °C vorzuheizen.
- Halten Sie eine Maus und tragen Sie mindestens 15 Minuten vor der Injektion der Schwanzvene eine topische Anästhesiecreme auf die gesamte Länge des Schwanzes auf.
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt und möglicherweise nicht erforderlich, wenn dies nicht von der Tierethikkommission des Instituts verlangt wird. Befolgen Sie das Protokoll, das von der örtlichen Tierethikkommission genehmigt wurde. In diesem Experiment25 wurde eine Rosa26-Cas9-Maus zur AAV-Injektion und anschließenden Pfortveneninjektion von CRC-Organoiden verwendet. Da die in dieser Studie verwendeten Tumoroide von einer Rosa26-Cas9-Maus (C57BL/6 x 129 genetischer Hintergrund) abgeleitet wurden, wurde dieser Mausstamm auch als immunkompetente, syngene Empfänger der Tumortransplantation eingesetzt. Männliche und weibliche Rosa26-Cas9-Mäuse (6 bis 24 Wochen alt) wurden verwendet. - Legen Sie die Maus in die Wärmebox. Lassen Sie die Maus bis zu 15 Minuten warten, um die Schwanzvenen zu erwärmen und zu erweitern.
- Befestigen Sie die Maus vorsichtig in einem Nagetier-Rückhaltebecken. Legen Sie den Schwanz unter eine Wärmelampe, um eine vollständige Erweiterung der Heckvenen zu gewährleisten.
- Ziehen Sie 150 μL verdünntes AAV (hergestellt in Schritt 1.1) in eine sterile Spritze mit niedrigem Totraum mit einer Nadel von 27-30 G.
- Bewegen Sie die Wärmelampe und identifizieren Sie die seitliche Heckvene an den Seiten des Schwanzes. Legen Sie mit den Fingern eine leichte Spannung auf den Schwanz, so dass der Schwanz gerade wird.
- Langsam 2-3 mm der Nadel einführen, nach oben abschrägen, in die Vene. Die Nadel sollte fast parallel zum Schwanz sein (bis zu 15° vom Schwanz entfernt).
HINWEIS: Ein Bluteinstrom in die Spritze kann beobachtet werden, wenn die Nadel erfolgreich in der Vene lokalisiert wird. - Langsam injizieren. Wenn ein Widerstand zu spüren ist oder eine Hautschwellung beobachtet wird, entfernen Sie die Nadel und setzen Sie sie erneut über der ersten Stelle oder in die andere laterale Vene ein.
- Warten Sie nach Abschluss der Injektion etwa 5 s und entfernen Sie dann langsam die Nadel. Üben Sie sofort mit einer sauberen Gaze oder einem Papiertuch sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufhört.
- Lassen Sie die Maus vorsichtig in ihren Käfig. Überwachen Sie das Tier, um sicherzustellen, dass die Blutung aufgehört hat.
HINWEIS: Die Genüberexpression in der Leber kann 1 bis 2 Wochen nach der AAV-Tailveneninjektion beurteilt werden. Dies kann beispielsweise durch RNA-in-situ-Hybridisierung (ISH), Immunhistochemie (IHC), Western Blotting oder quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR; Abbildung 1A,B). In einer zuvor veröffentlichten Studie25 wurde AAV8-Islr verwendet, um das Islr-Gen der Maus in Hepatozyten zu überexprimieren, und die Überexpression wurde durch RNA ISH nachgewiesen (Abbildung 1A, B).
2. Zellpräparation für Darmkrebs-Organoide
HINWEIS: CRC-Organoide, die für dieses Experiment verwendet werden, enthalten ausschließlich Epithelzellen. Kultur und Erzeugung von CRC-Organoiden wurde zuvor beschrieben25,35. Kurz gesagt, normale Dickdarmepithelzellen wurden aus dem Dickdarm einer Rosa26-Cas9-Maus unter Verwendung eines Kryptenisolationspuffers (5 mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat) in eiskaltem PBS) isoliert und dann in Basalmembranmatrixmedium eingebettet und in organoidem Wachstumsmedium kultiviert, wie in Referenz35 beschrieben. Dann wurden Apc- und Trp53-Mutationen in die Dickdarmepithelzellen eingeführt, indem Single-Guide-RNAs, die Apc und Trp53 unter Verwendung des Lentivirus-Expressionsprotokolls angreifen, überexprimiert wurden. Einzelne Organoid-Klone wurdenhandverlesen 25. Apc Δ/Δ und Trp53 Δ/Δ Darmkrebs-Organoide (AP-Tumoroide) wurden als 5,0 x 105 Einzelzellen in 100 μL PBS mit 10 μM Y-27632 in die Pfortader pro Maus injiziert, mit Organoidkultur und Einzelzellpräparation, wie unten beschrieben.
- Messen Sie die CRC-Organoide in den Matrix-Medium-Kuppeln der Basalmembran in einer 24-Well-Platte oder einer 10-cm-Schale 3-5 Tage vor der Pfortaderinjektion, um Organoide mit einem Durchmesser von 50-400 μm zu erhalten.
- Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Zellablösungslösung vor, indem Sie Y-27632 bis 10 μM-Konzentration hinzufügen, genug, um die Anzahl der Organoide zu verdauen, die für die Injektion kultiviert werden. Vorwärmen in einem 37 °C warmen Wasserbad.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Zellablösungslösung ist eine rekombinante Zelldissoziationsenzymmischung und wird als Ersatz für Trypsin in Organoidkultur verwendet (siehe Materialtabelle). Es reduziert Zellschäden, die durch Zelldissoziation verursacht werden, im Vergleich zuTrypsin 36. Y-27632 ist ein Rho-Kinase-Inhibitor und hemmt den durch Dissoziation induzierten Zelltod, wodurch das Einzelzellüberlebenerhöht wird 37.- Für die Injektion in bis zu fünf Mäuse bereiten Sie zwei Röhrchen mit 40 ml der Zellablösungslösung vor, um 10-24 x 50 μL Basalmembran-Matrixkuppeln mit jeder Kuppel mit etwa 300 Organoiden (50-400 μm Durchmesser) zu verdauen, d.h. jeder Maus werden 2-4,8 Schnappschüsse von Organoiden injiziert (entspricht etwa 600-1440 Organoiden). Die Anzahl der Organoide, die notwendig sind, um eine ausreichende Zellzahl zu erhalten, hängt von der Organoidlinie ab und sollte daher optimiert werden.
HINWEIS: Das zweite 40-ml-Röhrchen ermöglicht eine wiederholte Verdauung mit frischzellablösender Lösung, um dissoziierte Einzelzellen zu erhalten.
- Für die Injektion in bis zu fünf Mäuse bereiten Sie zwei Röhrchen mit 40 ml der Zellablösungslösung vor, um 10-24 x 50 μL Basalmembran-Matrixkuppeln mit jeder Kuppel mit etwa 300 Organoiden (50-400 μm Durchmesser) zu verdauen, d.h. jeder Maus werden 2-4,8 Schnappschüsse von Organoiden injiziert (entspricht etwa 600-1440 Organoiden). Die Anzahl der Organoide, die notwendig sind, um eine ausreichende Zellzahl zu erhalten, hängt von der Organoidlinie ab und sollte daher optimiert werden.
- Aspirieren Sie das Organoidmedium vorsichtig aus jeder Vertiefung.
- Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS zu jedem Bohrloch in einer 24-Well-Platte hinzu. Wenn eine 10-cm-Schale verwendet wird, fügen Sie 10 ml eiskaltes PBS in die Schüssel hinzu.
- Kratzen Sie das Basalmembranmatrixmedium mit einer P1000-Pipettenspitze ab. Die PBS/Medium-Gülle in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
- Spülen Sie jede Vertiefung mit der gleichen Menge an PBS, um Basalmembranmatrixfragmente zu sammeln und zu den 15 ml Röhrchen hinzuzufügen.
- 5 min auf Eis inkubieren. Diese Inkubation hilft, das Basalmembranmatrixmedium aufzulösen.
- Zentrieren Sie das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand ab, um das pelletierte Medium und die Zellen nicht zu stören.
- Geben Sie 5 ml vorgewärmte Zellablösungslösung, die in Schritt 2.2 vorbereitet wurde, in das Pellet, suspendieren Sie das Pellet 10 Mal und geben Sie es zurück in ein 50-ml-Röhrchen, das frische, vorgewärmte Zellablösungslösung enthält.
- Legen Sie die Tube in das 37 °C warme Wasserbad. 5 min inkubieren
- Zentrieren Sie das Rohr bei 400 x g für 3 min bei 4 °C.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.9 bis 2.11.
HINWEIS: Die wiederholte enzymatische Verdauung ermöglicht die effiziente Zelldissoziation in einzelne Zellen. - Überprüfen Sie, ob die Organoide in einzelne Zellen dissoziiert werden, indem Sie 100 μL in eine 96-Well-Platte pipettieren und unter dem Mikroskop beobachten. Wenn viele Organoide Zellklumpen zeigen, die aus mehr als vier Zellen bestehen, kann eine längere Inkubation mit der Zellablösungslösung und eine physikalische Dissoziation durch Verreibung mit einer 10 ml Pipette erforderlich sein.
- Sobald die meisten Zellen einzelne Zellen sind, fügen Sie 4 ml fetales Rinderserum (FBS) in die 40 ml Zellsuspension hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Spülen Sie ein 40 μm Zellsieb mit 5 ml PBS ab.
- Führen Sie die Zellsuspension durch das Zellsieb in ein 50-ml-Sammelrohr, um Zellklumpen zu entfernen.
- Zentrieren Sie das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand. Geben Sie 10 ml kaltes PBS in das Zellpellet und geben Sie es in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Zentrieren Sie das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendiert das Pellet in 500 μL kaltem PBS mit 10 μM Y-27632. Zählen Sie die Zellen.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5,0 x 105 Einzelzellen/100 μL ein, wobei Sie PBS mit 10 μM Y-27632 verwenden. Legen Sie den Schlauch auf Eis, bis eine Pfortaderinjektion durchgeführt wird.
HINWEIS: Es wird empfohlen, dissoziierte Zellen innerhalb von 4 h nach der Dissoziation zu injizieren.
3. Injektion von Darmkrebs-Organoiden in die Portalvene
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente und chirurgischen Gazen müssen vor der Operation autoklaviert oder sterilisiert werden. Dieses Protokoll wurde gegenüber einem früheren Protokoll17 geändert. In diesem Experiment25 wurde die Pfortaderinjektion mit Rosa26-Cas9-Mäusen durchgeführt, die in Schritt 1 mit AAV-mRuby2 oder AAV-Islr behandelt wurden.
- Bereiten Sie einen aseptischen Operationsbereich mit sterilen Vorhängen auf einem Heizkissen vor.
- Bereiten Sie chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette), chirurgischen und hämostatischen Schwamm, 4-0 Polyglatinnaht, Wattestäbchen, Hauthefter, Hefterapplikator, Kochsalzlösung, Buprenorphin und 33 G Nadel vor, die an einer Hamilton-Spritze befestigt sind. Schneiden Sie den hämostatischen Schwamm in 1,0 cm x 1,0 cm große Stücke.
- Stellen Sie die Position der Lichtquelle ein, um den Operationsbereich zu beleuchten.
- Injizieren Sie 0,1 mg/kg Körpergewicht von Buprenorphin subkutan an eine Maus zur chirurgischen Schmerzbehandlung.
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran in einer Anästhesiekammer. Die Isoflurankonzentration für Induktion und Aufrechterhaltung beträgt in der Regel 5% bzw. 2,5%. Überprüfen Sie, ob keine Reaktion auf das Zusammendrücken der Zehen vorliegt, bevor Sie mit dem nächsten Eingriff beginnen.
- Rasieren Sie die Mitte bis zum Oberbauch der Maus mit einem Elektrorasierer. Die Rasur sollte in einem vom aseptischen Operationsbereich entfernten Bereich durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass Haare den Standort kontaminieren.
- Reinigen Sie die Inzisionsstelle abwechselnd mit Betadin und 80% Ethanol, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in Rückenlage mit Isofluran-Erhaltungsanästhesie. Legen Sie einen chirurgischen Vorhang mit einem Loch über den Bauch der Maus.
- Heben Sie die Bauchhaut mit einer Pinzette an und machen Sie einen 2-3 cm langen Hautschnitt an der Mittellinie mit einer Schere, wobei Sie nur die Haut schneiden (nicht darunter Peritoneum). Der Schnitt sollte vom Mittelbauch bis zum xiphoiden Prozess des Brustbeins reichen. Der Einschnitt sollte nicht über das untere Ende des Xiphoidprozesses hinausgehen.
- Heben Sie die Peritonealwand mit einer Pinzette vollständig an und machen Sie mit der Schere einen ähnlichen 2-3 cm großen Schnitt wie das Peritoneum. Vermeiden Sie es, den Darm und das Zwerchfell zu schneiden.
- Tränken Sie die chirurgische Gaze mit warmer Kochsalzlösung und legen Sie sie auf die linke Seite des Einschnitts (auf der linken Seite des Mauskörpers; rechts vom Chirurgen).
- Ziehen Sie die inneren Organe (Dünn- und Dickdarm) vorsichtig mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen heraus. Legen Sie den Darm auf die mit Kochsalzlösung getränkte Gaze.
HINWEIS: Der linke Darm der Maus (dh der Darm auf der rechten Seite des Chirurgen) sollte zuerst herausgezogen werden, und dann kann der rechte Darm der Maus (dh der Darm auf der linken Seite des Chirurgen) herausgezogen werden. - Passen Sie die Position des Darms an, um die Portalvene zu visualisieren. Bedecken Sie den Darm mit zusätzlicher feuchter Gaze, um den Darm feucht zu halten.
- Ziehen Sie den Darm vorsichtig mit der nassen Gaze auf die linke Seite und üben Sie eine sanfte Spannung nach links aus. Dies erleichtert die Visualisierung der Portalader (Abbildung 2A).
HINWEIS: Wenn die Visualisierung der Pfortader schwierig ist, kann die sanfte Anpassung der Position des Magens mit einem nassen Wattestäbchen die Visualisierung erleichtern. - Pipettieren Sie die tumoroide Suspension mehrmals vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Ziehen Sie langsam 100 μL der Zellsuspension in eine Hamilton-Spritze, die an einer 33-G-Nadel befestigt ist. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Führen Sie die Nadel langsam in die Pfortader ein. Die Einführtiefe entlang der Nadel sollte 3-4 mm betragen, wobei der Nadelwinkel fast parallel zur Pfortader verlaufen sollte.
HINWEIS: Die Injektion sollte in den gut visualisierten Teil der Pfortader durchgeführt werden (normalerweise bis zu 2 cm vom Leberhilum entfernt). Vermeiden Sie eine Bewegung der Nadel, nachdem sie vollständig in die Pfortader eingeführt wurde. - Injizieren Sie Tumorzellen für 30 s. Die Injektion sollte langsam durchgeführt werden, um einen Verschluss der Pfortader zu verhindern. Wenn die Injektion erfolgreich ist, ändert sich die Farbe der Leber vorübergehend von Rot zu Weiß.
- Entfernen Sie die Nadel langsam. Üben Sie sofort mit einem trockenen Wattestäbchen sanften Druck auf die Injektionsstelle aus und warten Sie 5 min.
- Entfernen Sie die Wattestäbchen und tragen Sie gleichzeitig einen hämostatischen Schwamm auf die Injektionsstelle auf. Hämostatischen Schwamm mit Wattestäbchen oder Pinzetten halten und für weitere 5 Minuten sanften Druck ausüben.
- Entfernen Sie den Druck auf den hämostatischen Schwamm und bestätigen Sie, dass keine Blutungen von der Injektionsstelle vorliegen.
HINWEIS: Der bioabsorbierbare hämostatische Schwamm muss nicht entfernt werden. Der Versuch, die Gaze zu entfernen, könnte zu erneuten Blutungen an der Injektionsstelle führen. - Wenn Blutungen auftreten, führen Sie sofort eine Druckhämostase mit einem Wattestäbchen für ca. 10 min durch. Tragen Sie dann einen zusätzlichen hämostatischen Schwamm für weitere 5 Minuten auf.
HINWEIS: Wenn ein unkontrollierbarer Blutverlust beobachtet wird, sollte die Maus gemäß dem von der Tierethikkommission des Instituts genehmigten Protokoll eingeschläfert werden. - Entfernen Sie die chirurgische Gaze am Darm. Mit einer Spritze, die mit 5 ml Kochsalzlösung gefüllt ist, spritzen Sie Kochsalzlösung in den Darm, um eine Organadhäsion zu verhindern.
HINWEIS: Tragen Sie keine Kochsalzlösung auf die Injektionsstelle der Pfortader auf. Dies könnte zu erneuten Blutungen führen. - Legen Sie den Darm vorsichtig wieder in die Bauchhöhle.
- Nähen Sie das Peritoneum mit 4-0 Polyglactin-Nähten.
- Heben Sie beide Seiten der Haut mit einer Pinzette an. Tragen Sie Hauthefter auf, um den Hautschnitt zu schließen. Achten Sie darauf, den Darm nicht zu klammern.
- Schalten Sie das Isofluran aus, aber halten Sie den Sauerstofffluss am Laufen. Überwachen Sie die Maus sorgfältig. Wenn die Maus erwacht, legen Sie die Maus in einen leeren Käfig auf einem Heizkissen. Die Maus erwacht typischerweise innerhalb von 5 min.
- Überwachen Sie die Maus sorgfältig, bis sie bei Bewusstsein ist und normal schlendert.
- Subkutan 0,1 mg/kg Buprenorphin 4 h nach der Operation in die Maus injizieren.
- Injizieren Sie der Maus alle 24 Stunden 0,1 mg/kg Buprenorphin für die folgenden 2 Tage.
- Überwachen Sie die Mäuse sorgfältig täglich für eine Woche nach der Operation. Überprüfen Sie Nähte und Wundheilung.
- Tage nach der Operation entfernen Sie Hauthefter mit einem Hefterentferner.
4. Beurteilung der Kinetik des Tumorwachstums durch in vivo biolumineszierende Bildgebung
HINWEIS: Wenn Firefly-exprimierende Tumoroide zur Injektion verwendet werden, kann die metastasierende Tumorprogression wöchentlich durch In-vivo-Bildgebung überwachtwerden, wie beschrieben 38,39. Luciferase, die von Krebszellen exprimiert wird, könnte Immunantworten gegen die Krebszellen auslösen und das Tumorwachstum begrenzen40. Daher ist Vorsicht geboten bei der Analyse von Immunphänotypen und Krebsprogression in einem Mausmodell unter Verwendung von Luciferase-exprimierenden Tumorzellen.
- Bereiten Sie eine 30 mg / ml Lösung von D-Luciferin mit sterilem PBS vor. Schützen Sie es vor Licht. D-Luciferin sollte bis zur Verwendung in Aliquots bei -20 °C gelagert werden.
- Rasieren Sie den Bauch und den Thorax mit einem elektronischen Rasierer. Dies kann bis zu 1 Tag vor der In-vivo-Bildgebung erfolgen.
- 150 mg/kg Körpergewicht D-Luciferin intraperitoneal in Mäuse injizieren (d. h. wenn das Körpergewicht der Maus 30 g beträgt, injizieren Sie 150 μL der D-Luciferin-Lösung).
- Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiekammer und betäuben Sie sie. Verwenden Sie 5% Isofluran für die Induktion und 2% -3% für die Wartung.
- Legen Sie die Mäuse Minuten später in eine seitliche Position (rechte Seite nach oben). Erfassen Sie Biolumineszenzbilder mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS), wie zuvor beschrieben38,39.
HINWEIS: Mäuse sind in einer seitlichen Position stabiler als in Rückenlage. Daher ist eine seitliche Position vorzuziehen, um ein Lumineszenzbild von einer konsistenten Fokusebene zu erhalten. - Legen Sie die Mäuse in einen leeren Käfig und überwachen Sie ihre Genesung.
- Definieren Sie Regionen von Interesse am Oberbauch mit der Living Image Software wie beschrieben38. Quantifizieren Sie den Gesamtfluss als Surrogat für die Tumorzellzahl.
5. Überlebensanalyse und Gewebeentnahme
- Überwachen Sie Mäuse sorgfältig auf klinische Symptome von Metastasen wie einem aufgeblähten Bauch.
- Euthanasieren Sie eine Maus durch CO 2-Inhalation, sobald sie humane Endpunkte erreicht hat.
HINWEIS: Verwenden Sie einen Studienendpunkt, der von der Tierethikkommission des Instituts genehmigt wurde. Um einen humanen Endpunkt zu bestimmen, wurde ein klinisches Aktenblatt verwendet; Die Punktzahlen wurden berechnet, indem ein Punkt für das Vorhandensein jeder der folgenden Beobachtungen gegeben wurde: Gewichtsverlust > 15%, gebeugte Haltung, gerüschtes Fell, Dehydrierung, verminderte Bewegung, aufgeblähter Bauch oder Gesichtsgrimasse. Sobald eine Punktzahl von 3 erreicht war, wurden die Mäuse auf humane Weise eingeschläfert. - Unmittelbar nach der Euthanasie führen Sie eine transkardiale Perfusionsfixierung mit 30-50 ml 10% Formalin in einem Abzug durch, wie beschrieben41. Machen Sie mehrere kleine Schnitte (jeweils bis zu 1 cm) mit einer Schere in den normalen Teil der Leber vor der Perfusion, um Ausgänge für Blut und Formalin zu erzeugen. Bei der Perfusion ändert sich die Leberfarbe von rot zu braun.
HINWEIS: Wenn Mikrometastasen in makroskopisch normalen Leberbereichen Gegenstand von Studien sind, empfehlen wir Forschern, die Leber nicht zu schneiden, sondern stattdessen die obere Hohlvene zu schneiden. Wenn wir jedoch diese Methode angewendet haben, scheint die Fixierung der Leber im Vergleich zum Schneiden der Leber schlechter zu sein. Insbesondere wenn eine RNA-in-situ-Hybridisierung (ISH) an Leberschnitten geplant ist, empfehlen wir, vor der intrakardialen Injektion von Formalin, wie oben beschrieben, Schnitte in die Leber zu machen. Dies ermöglicht eine ausreichende Fixierung des Lebergewebes, was zur Erhaltung der RNA-Integrität für ISH führt. - Legen Sie die Leber und das Lungengewebe in 10% Formalin und fixieren Sie es über Nacht. Ersetzen Sie das Formalin durch 70% Ethanol, gefolgt von Paraffin-Einbettung.
- Führen Sie Hämatoxylin- und Eosinfärbungen durch, um den Tumorbereich histologisch zu bewerten. Führen Sie Immunhistochemie für Stromamarker von Interesse durch. Führen Sie eine Picro-Sirus Red-Färbung durch, um kollagenpositive Bereiche zu bewerten.
HINWEIS: Die ImageJ-Software42 kann zur Quantifizierung von Immunhistochemie- und Picro-Sirius-Res-Färbedaten verwendet werden. Eine Farbdekonvolutionsfunktion und das MRT-Fibrose-Tool können verwendet werden, um 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-positive Bereiche bzw. Picro-Sirius-rot-positive Bereiche zu bewerten.
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Representative Results
Um eine AAV-vermittelte Überexpression eines tumorhemmenden Stroma-Gens, Islr 4,25,43,44, in Hepatozyten zu induzieren, injizierten wir intravenös Islr-kodierendes AAV8. 1,0 x10 11 virale Genome (vg) von AAV8-Islr oder als Kontrolle AAV8-mRuby2 wurden in die adulte Mausschwanzvene injiziert (Abbildung 1A). Zwei Wochen nach der Injektion der Schwanzvene wurden Lebern entnommen, um die Überexpression der Islr in Hepatozyten zu validieren. Wir führten eine RNAscope-in-situ-Hybridisierung45 durch und bestätigten, dass 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)+-Signale in der gesamten Leber beobachtet wurden (Abbildung 1B). Von einer mit AAV8-mRuby2 behandelten Maus wurden keine DAB+-Signale in der Leber detektiert.
Wir praktizierten das Pfortaderinjektionsverfahren durch Injektion von indischer Tinte (1:1000 Verdünnung in PBS). Nach einem Schnitt in den Oberbauch wurde der Darm schonend aus dem Bauchraum herausgenommen, um eine Visualisierung der Pfortader zu ermöglichen (Abbildung 2A). Die Injektion von Tusche in die Portalvene lieferte die Tinte durch die Leber, aber nicht in die Lunge (Abbildung 2B). Wenn die Tinte versehentlich in andere Gefäße wie die untere Vena cava (IVC) oder die Bauchaorta injiziert wird, verändert die systemische Zirkulation der Tinte die Lungenfarbe in Schwarz. Indientinte hilft auch, die Menge der Leckage aus der Pfortader zu identifizieren, die auf eine Pankreas- oder Peritonealverteilung hinweist.
Zwei Wochen nach der Injektion von AAV-mRuby2 in die Schwanzvene wurden die Darmkrebsorganoide Apc Δ/Δ und Trp53 Δ/Δ (AP-Tumoroide) zu einzelnen Zellen dissoziiert und in die Vena des Mausportals injiziert (Abbildung 3A). Um das metastasierende Tumorwachstum zu bestätigen und die Histologie zu bewerten, sammelten wir die Lebern 3-4 Wochen nach der Pfortaderinjektion (d.h. zu einem bestimmten Zeitpunkt und nicht zu einem humanen Endpunkt), bevor prominente Nekrose histopathologische Analysen verwirrt. Makroskopisch führte die Pfortaderinjektion von Tumoroiden zu mehreren weißen Tumorknoten in der Leber (Abbildung 3B). Wir fanden heraus, dass die intra-splenische Injektion der gleichen Zellanzahl von Tumoroiden keine große metastasierende Tumormasse erzeugte. Dies deutet darauf hin, dass der Portalveneninjektionsansatz Lebermetastasen im Vergleich zum Intra-Milzinjektionsmodell effizienter induziert. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung der durch die Pfortaderinjektion induzierten Lebermetastasen des CRC zeigte eine Histopathologie des mäßig differenzierten tubulären Adenokarzinoms, begleitet von einer desmoplastischen Stromareaktion und Nekrose (Abbildung 3C). Diese stromareiche Histologie rekapitulierte getreu die der menschlichen CRC-Lebermetastasen (Abbildung 3C), wodurch sich dieses Modell für die translationale Forschung zur Untersuchung des metastasierenden Tumorstromas eignet. Darüber hinaus zeigte die Immunhistochemie für Alpha-glattes Muskelaktin (αSMA), einen gut etablierten Marker für CAFs, dass etwa 7% der Tumorbereiche αSMA-positiv waren, was das Vorhandensein von CAFs in diesem Mausmodell bestätigt (Abbildung 3D, E). Picro-Sirius rote Färbung, die Kollagen46 färbt, zeigte reichlich ECM im Tumormesenchym, wobei etwa 13% der Tumorbereiche positiv auf Kollagen waren (Abbildung 3D, E). Die Immunhistochemie für EPCAM, einen epithelialen Linienmarker, zeigte, dass der metastasierende CRC eine Tumorknospe (eine einzelne Tumorzelle oder ein Zellcluster von bis zu vier Tumorzellen) zeigte, die ein Merkmal einer schlechten Prognose für Darmkrebs 47 ist (Abbildung 3F). Der Ki67-Markierungsindex im metastasierten CRC betrug etwa 80%, was darauf hindeutet, dass die meisten Tumorzellen mitotisch aktiv sind (Abbildung 3G, H).
Wir haben Kinetikanalysen für das Überleben und das Tumorwachstum von Mäusen in diesem präklinischen Modell durchgeführt. Die Mäuse in unserer ersten Pilotkohorte zeigten ein medianes Überleben von 57 Tagen nach der tumoroiden Injektion in die Pfortader (N = 4 Mäuse; Abbildung 4A). Dies wurde später in größeren Kontrollgruppen AAV8-mRuby2-injiziert25 repliziert. Am humanen Endpunkt (wie in NOTE, Schritt 5.2 gezeigt) zeigten 3 von 4 Mäusen in der Pilotgruppe Aszites, was auch bei Patienten mit fortgeschrittener Lebermetastasierung48 beobachtet wird. Zur Beurteilung des Tumorwachstums wurde ein In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) zur Messung der von Tumoroiden abgeleiteten Lumineszenz verwendet (Abbildung 4B, C). Die Biolumineszenzsignale wurden im Oberbauch beobachtet, was auf ein leberspezifisches Tumorwachstum hindeutet (Abbildung 4B). Wenn IVIS-Signale im Unterbauch beobachtet werden, deutet dies auf eine peritoneale Verbreitung oder sekundäre Metastasen in die Bauchorgane hin. Die wöchentliche In-vivo-Bildgebung ermöglichte eine longitudinale Beurteilung des Tumorwachstums bei jeder Maus (Abbildung 4C), was die Überwachung einer therapeutischen Wirkung in unserer anschließenden größeren Studie erleichterte. Die Tumorentnahmerate betrug 100% (4/4 Mäuse), wie durch IVIS-Signale beurteilt. In diesem Experiment wurde zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme keine makroskopisch scheinbare Lungenmetastasierung beobachtet (0/4 Mäuse).
Schließlich untersuchten wir, ob die AAV-vermittelte Hepatozyten-gerichtete Verabreichung eines krebshemmenden CAF-Gens, Islr 4,25, das Wachstum der CRC-Lebermetastasierung in diesem präklinischen Mausmodell hemmen könnte. Insbesondere zeigten AAV8-Islr-behandelte Mäuse ein verbessertes Überleben der Maus und verringerten die IVIS-Signale von Tumoren (Abbildung 5A-C)25. Die Immunhistochemie für phosphoryliertes Smad1/5/8 zeigte, dass die Hepatozytenüberexpression von ISLR, einem BMP-Signalpotenzator, die BMP-Signalgebung bei metastasierenden Tumoren verstärkte (Abbildung 5D). Die Behandlung mit AAV8-Islr verringerte die Anzahl der Ki67+-proliferierenden Zellen in der CRC-Lebermetastasierung (Abbildung 5E). Eine vollständige Beschreibung der Ergebnisse finden Sie in Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Unsere kollektiven Daten deuten darauf hin, dass die AAV8-vermittelte Abgabe eines tumorhemmenden Gens an Hepatozyten, einem lebenswichtigen Bestandteil des metastasierenden Lebertumorstromas29, ein wirksamer präventiver/therapeutischer Ansatz für CRC-Lebermetastasen sein könnte (Abbildung 5F).
Abbildung 1: Schwanzvenen-verabreichte AAV8-Islr erzeugt eine Islr-Überexpression in der Leber. (A) Versuchsschema, das die Injektion von AAV8 in die Heckvene zeigt, gefolgt von einer Pfortaderinjektion von Organoiden für Darmkrebs (CRC). ISH, In-situ-Hybridisierung; IHC, Immunhistochemie; qRT-PCR, quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion. (B) Repräsentative Bilder. Die RNA-in-situ-Hybridisierung für Islr wurde unter Verwendung von Lebern von AAV8-Islr- oder AAV8-mRuby2-behandelten Mäusen durchgeführt. Die Lebern wurden 2 Wochen nach der Injektion der Heckvene gesammelt. Maßstabsstäbe, 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Injektion von Tusche in die Pfortader führt zu einer Abgabe an die Leber, aber nicht an die Lunge . (A) Repräsentative Bilder, die die Anatomie des Oberbauchs nach der Laparotomie zeigen. Beachten Sie, dass zur Visualisierung der Pfortader der Darm außerhalb der Bauchhöhle entnommen wird. Das Bild auf der rechten Seite zeigt eine anatomische Annotation jedes Organs und Gefäßes. Der gelbe Pfeil kennzeichnet die Injektionsstelle. IVC, Hohlvene inferior. (B) Repräsentative Bilder der Leber und der Lunge nach der Injektion von Tusche in die Pfortadere. Die gelben Pfeilspitzen zeigen Gefäße an, die mit der Tusche gefärbt sind. Maßstabsstangen, 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Pfortaderinjektion von Darmkrebs-Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. (A) Versuchsschema zur Darstellung der Pfortaderinjektion von Apc Δ/Δ und Trp53 Δ/Δ Darmkrebs-Organoiden (AP-Tumoroide). Maßstabsstab, 200 μm. T, Tumoroide. (B) Repräsentative makroskopische Bilder der Lebern, die 3-4 Wochen nach der Pfortaderinjektion (links) oder der intra-Milzinjektion (rechts) gesammelt wurden. 5,0 x 105 Einzelzellen aus AP-Tumoroiden wurden in die Pfortader oder Milz injiziert. Die intra-Milzinjektion wurde wie beschriebendurchgeführt 13. Weiße Knötchen weisen auf Tumore hin. T, Tumor; N, Normale Leber. (C) Repräsentative Hämatoxylin und Eosin (H & E) färbende Bilder der CRC-Lebermetastasen aus dem Portalveneninjektions-Mausmodell (links und Mitte) und dem Menschen (rechts). T, Tumor; N, Normale Leber; S, Stroma; Nec, Nekrose. Die gelb gepunktete Linie zeigt eine Grenze zwischen dem Tumor und der normalen Leber an (links). (D und E) Immunhistochemie (IHC) für alpha-glattes Muskelaktin (αSMA; links) und Picro-Sirius-Rotfärbung (rechts). (D) Repräsentative Bilder. (E) Quantifizierung von αSMA-positiven Flächen (links) und Picro-Sirius-rot-positiven Flächen (rechts). N = 4 Mäuse, 5 HPFs (High Power Fields; 400x)/Maus. (F) Repräsentatives Bild, das die Immunhistochemie für EPCAM, einen Epithelzellmarker, zeigt. Die grün gepunkteten Linien kennzeichnen die Tumorknospe. (G und H) Immunhistochemie für Ki67, einen Zellproliferationsmarker. (G) Repräsentatives Bild. (H) Prozentsatz der Ki67+-Zellen in den gesamten Epithelzellen. Epithelzellen wurden durch Hämatoxylin-Gegenfärbung visualisiert. N = 4 Mäuse, 5 HPFs/Maus. Bei (B)-(H) wurden alle Lebergewebe der Maus 3-4 Wochen nach der Injektion von AP-Tumoroiden gesammelt. Mittlere ± S.E.M. Jeder Punkt stellt einen Durchschnittswert von 5 HPFs von einer Maus (E und H) dar. Maßstabsstäbe stellen 1 cm (B), 1 mm (C; links), 100 μm (C; Mitte und rechts) und 50 μm (D, F und G) dar. Beachten Sie, dass die Studie mit menschlichem Gewebe von der Ethikkommission der Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127) genehmigt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Überlebensanalyse und kinetische Analyse des Tumorwachstums mittels In-vivo-Bildgebung . (A) Kaplan-Meier-Überlebenskurven. N = 4 Mäuse. (B,C) Das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) wurde verwendet, um die Kinetik des Tumorwachstums zu bewerten. (B) Ein repräsentatives Bild. Die Fläche in der roten Box wurde zur Quantifizierung verwendet. (C) Wachstumskinetik. Luziferase-Signale von jeder Maus werden angezeigt. N = 4 Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: AAV8-vermittelte Genabgabe von Islr an Hepatozyten erhöht die BMP-Signalgebung, reduziert die Tumorproliferation und verbessert das Überleben der Maus in einem Pfortaderinjektionsmodell der CRC-Lebermetastase. (A) Kaplan-Meier-Überlebenskurve. Zwei Wochen nach der Injektion von AAV-Islr oder AAV-mRuby2 in die Heckveneninjektion von CRC-Tumoroiden wurde eine Pfortaderinjektion durchgeführt. (B und C) Tumoroid-abgeleitete Luciferase-Signale wurden mittels IVIS ausgewertet. (B) Repräsentatives Bild. (C) Quantifizierung von IVIS-Signalen. N = 5 (AAV-mRuby2) und 8 (AAV-Islr) Mäuse. Mittlere ± S.E.M. (D) Repräsentative Bilder. Immunhistochemie (IHC) für phosphoryliertes Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 ist ein nachgeschaltetes Molekül der Signalgebung des morphogenetischen Knochenproteins (BMP), das bei der BMP-Signalaktivierung49 phosphoryliert wird. N = je 4 Mäuse. (E) Repräsentative Bilder. Immunhistochemie für Ki67. N = je 4 Mäuse. (F) Grafische Zusammenfassung. AAV-vermittelte Hepatozyten-gerichtete Genabgabe eines krebshemmenden Stroma-Gens könnte als therapeutische Strategie zur Hemmung der CRC-Metastastenase dienen. AAV8-vermittelte Überexpression von Islr in Hepatozyten modellierte die metastasierende Nische um, indem sie die BMP-Signalgebung und die begrenzte CRC-Metastasenprogression verbesserte. Detaillierte Informationen finden Sie in Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Log-Rank-Test (A) und Zwei-Wege-ANOVA (Varianzanalyse) mit Post-hoc-Sidak-Mehrfachvergleichstest in Woche 3 (C). Maßstabsstäbe, 50 μm. Abbildung 5A-C wurde aus Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), mit Genehmigung von Elsevier nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Pfortaderinjektion von Maus-CRC-Organoiden reproduzierbar fibroblastenreiche Lebermetastasen erzeugt, die histologische Merkmale menschlicher CRC-Lebermetastasen nachahmen. Darüber hinaus dient dieses präklinische Modell in Kombination mit stromagerichteten Therapeutika wie der AAV8-vermittelten Gentherapie als nützliches Werkzeug, um therapeutische Wirkungen auf das Überleben der Maus und das Tumorwachstum zu bewerten.
Es gibt mindestens zwei kritische Schritte im Protokoll. Erstens ist es wichtig, eine einzellige Suspension von Tumoroiden vorzubereiten, indem die Organoide vollständig trypsinisiert und ein Netzfilter verwendet wird, um Zellklumpen zu entfernen. Eine unvollständige Dissoziation von Tumoroiden führt zu großzelligen Aggregationen, deren Injektion die Pfortader verschließen kann. Dies verursacht einen Leberinfarkt und den Tod von Tieren22. Zweitens ist es während der Pfortveneninjektion unerlässlich, Blutungen aus der Pfortader zu minimieren. Die Nadel sollte richtig in die Pfortader eingeführt werden. Um eine Punktion der anderen Seite der Pfortader zu vermeiden, sollte der Winkel der eingeführten Nadel fast parallel zur Pfortader gehalten werden. Um ein Reißen der Pfortader während der Injektion zu verhindern, sollte die Nadel nicht bewegt werden, sobald sie vollständig in die Pfortader eingeführt wurde. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel aus der Pfortader ist es wichtig, mit einem Wattestäbchen für mindestens 5 Minuten Druck auf die Injektionsstelle auszuüben.
Die Zellzahl für die Injektion muss entsprechend der Empfängermaus (z. B. immunkompetente vs. immundefiziente Maus) und der Tumorigenität der Organoidlinie modifiziert werden. In unseren Experimenten reichte die Injektion von 5,0 x 105 Einzelzellen in 100 μL Suspension aus, um Lebermetastasen bei immunkompetenten Mäusen zu erzeugen. Eine Erhöhung der Zellzahl könnte das Risiko einer Embolie in der Pfortader und des Todes von Tierenerhöhen 14 und sollte daher sorgfältig abgewogen werden. Angesichts der Tatsache, dass frühere Arbeiten 5 x 104 bis 5 x 105 Zellen in 100 μL für die tumoroide Injektion in das Portal oder die Mesenterialvene25,26,27,28 verwendeten, sind wir der Ansicht, dass dieser Zellnummernbereich ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung wäre.
Eine Einschränkung des Portalveneninjektionsansatzes besteht darin, dass er nicht die gesamte Kaskade der CRC-Metastastenese vollständig rekapituliert. Die Lebermetastasierung von Krebs erfordert fünf Hauptschritte: (1) Krebszellinvasion an der primären Stelle, (2) Intravasation in das Gefäß, (3) Zellüberleben im Pfortenzirkulation, (4) Extravasation von der Pfortader zum Leberparenchym und (5) Besiedlung in der metastasierenden Nische50. Das Pfortaderinjektionsmodell erlaubt nur die Untersuchung der Schritte (3)-(5). Um Einblicke in die anderen metastatischen Prozesse zu erhalten, ist es notwendig, andere Modelle wie In-vitro-Modelle und/oder ein Notch1-mutiertes primäres CRC-Mausmodell zu verwenden, das häufig in die Lebermetastasiert 51.
Die Bedeutung der Pfortveneninjektionsmethode im Vergleich zu den bestehenden Methoden umfasst das leberspezifische Wachstum und eine höhere Tumorbelastung. Die peritoneale Verbreitung in anderen Injektionsmodellen und das Wachstum des primären Tumors in primären CRC-Modellen können die Analyse der Lebermetastasenprogression erschüttern. Im Gegensatz dazu generiert unser Portalvenenansatz schnell leberspezifische Tumore, was Überlebens- und Tumorwachstumsanalysen vereinfacht.
Ein großer Vorteil der Organoidtransplantation gegenüber der Zelllinieninjektion besteht darin, dass die Pfortaderinjektion von Tumoroiden die fibroblastenreiche Tumormikroumgebung erzeugte, die ein desmoplastisches Merkmal des menschlichen metastasierenden CRC phänokopiert. Organoide Kulturbedingungen rekapitulieren Merkmale der Tumormikroumgebung und unterstützen intestinale Stammzellpopulationen, einschließlich der Einbettung von Zellen in ein reichhaltiges und komplexes 3D-ECM mit einer definierten Kombination von Wachstumsfaktoren24,52. Dies führt zu einer Tumorzellvermehrung in einer Weise, die die genetische Landschaft des Quelltumors52,53 bewahrt. Im Gegensatz dazu ist die traditionelle 2D-Kultur von Tumorzelllinien mit klonaler Selektion und aberranten genomischen / transkriptomischen Veränderungen verbunden, die die Merkmale der ursprünglichen Krebsarten nicht genau widerspiegeln54. Wir spekulieren, dass die relativ harten Kulturbedingungen für die 2D-Kultur von Krebszelllinien die Zellen zwingen, sich an das Fehlen von ECM / Wachstumsfaktorsignalen anzupassen, die dann in vivo zu stromaarmen Tumoren führen können, da die Zellen keine stromaabgeleiteten Signale mehr für das Überleben benötigen.
Durch die Kombination des Organoid-Portalvenen-Injektionsmodells mit einer AAV8-vermittelten Gentherapie fanden wir heraus, dass die Abgabe einer krebshemmenden Nutzlast an Hepatozyten vor der Besiedlung von Krebszellen in der Leber die (prä-)metastasierende Nische modifizieren könnte, um das CRC-Metastasenwachstum zu hemmen25. Ermutigend ist, dass klinische Studien gezeigt haben, dass AAV-vermittelter In-vivo-Gentransfer in die Leber die langfristige Expression eines Transgens induziert und eine wirksame und sichere Modalität zur Behandlung nicht-neoplastischer genetischer Erkrankungensein könnte 30,31,55. In Zukunft könnte die Nutzung von Hepatozyten zur Verhinderung von Lebermetastasen durch den AAV-Ansatz einen potenziellen klinischen Wert bei Krebspatienten mit hohem Metastasenrisiko haben.
Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass die CRC-Organoidtransplantation über die Pfortader fibroblastenreiche Lebermetastasen erzeugt, die für die Entwicklung therapeutischer Strategien gegen das Stroma genutzt werden können. Durch die Kopplung der Pfortaderinjektion mit einer stromagerichteten Therapie wie AAV-vermittelter Genabgabe können neuartige Stromaziele identifiziert werden, um das Fortschreiten der CRC-Metastasierung einzudämmen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council (APP1156391 an D.L.W., S.L.W.) unterstützt. (APP1081852 zu D.L.W., APP1140236 zu S.L.W., APP1099283 zu D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project im Namen seiner Spender und der Regierung des Bundesstaates Südaustralien über das Gesundheitsministerium (MCF0418 an S.L.W., D.L.W.); ein Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03467 to M.T.), das vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Auftrag gegeben wurde; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 und 19gm1210008s0101 bis A.E.); das Projekt für Krebsforschung und therapeutische Evolution (P-CREATE) von AMED (19cm0106332h0002 bis A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (zu H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (zu H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (zu H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (zu K.G.).
Wir danken Dr. Leszek Lisowski von der Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), dem Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIEN) für die Herstellung rekombinanter AAV-Vektoren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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