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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

結腸直腸癌(CRC)オルガノイドの門脈注入は、間質に富む肝転移を生じる。CRC肝転移のこのマウスモデルは、腫瘍間質相互作用を研究し、アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子治療などの新規間質指向性治療薬を開発するための有用なツールである。

Abstract

結腸直腸癌(CRC)の肝転移は、癌関連死の主要な原因である。腫瘍微小環境の主要成分であるがん関連線維芽細胞(CAF)は、転移性CRCの進行に重要な役割を果たし、患者の予後不良を予測します。しかしながら、転移性癌細胞とCAFとの間のクロストークを研究するための満足のいくマウスモデルが不足している。ここでは、肝転移の進行が転移ニッチによってどのように調節され、間質指向性治療によって抑制される可能性があるかを調べる方法を提示する。CRCオルガノイドの門脈注入はデスモプラスティック反応を生じ、ヒトCRC肝転移の線維芽細胞に富む組織像を忠実に再現した。このモデルは、脾臓内注射モデルと比較して肝臓の腫瘍量が高い組織特異的であり、マウスの生存率解析を簡素化した。ルシフェラーゼ発現腫瘍オルガノイドを注入することにより、腫瘍増殖動態を in vivo イメージングによってモニターすることができた。さらに、この前臨床モデルは、腫瘍間葉系を標的とする治療薬の有効性を評価するための有用なプラットフォームを提供する。我々は、アデノ随伴ウイルス媒介性腫瘍阻害間質遺伝子の肝細胞への送達が腫瘍微小環境を再構築し、マウスの生存率を改善できるかどうかを調べる方法について説明する。このアプローチは、CRCの肝転移を阻害するための新規治療戦略の開発および評価を可能にする。

Introduction

結腸直腸癌(CRC)は、世界中の癌死亡率の主要な原因である1。CRC患者の半数以上が門脈播種1を介して起こる肝転移を発症する。現在、進行した肝転移を治すことができる有効な治療法はなく、ほとんどの患者は転移性疾患に屈する。

転移性ニッチまたは腫瘍微小環境は、播種性CRC細胞2の生着および増殖において重要な役割を果たす。腫瘍微小環境の顕著な構成要素である癌関連線維芽細胞(CAF)は、増殖因子の分泌、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、免疫ランドスケープおよび血管新生の調節を通じて癌の進行を促進または抑制する3、4、5。CAFはまた、化学療法および免疫療法に対する耐性を付与する3.さらに、CAFはCRC肝転移の開始および進行を調節し、CRC3、6、7、8患者の予後を予測する。したがって、CAF関連因子は、CRC肝転移を阻害する治療戦略の開発のために利用され得る。しかしながら、転移性腫瘍間質を研究するための満足のいくマウスモデルの欠如は、間質標的療法を開発する上で大きな障害となってきた。

現在、CRC肝転移を研究する動物モデルには、肝臓への肝転移を自発的に発症する原発性CRCモデルおよび癌細胞移植モデルが含まれる。遺伝子操作されたマウスモデルおよび癌細胞の結腸注射などの初代CRCマウスモデルは、肝臓への転移をめったに示さない9、10、11、12。さらに、肝転移が観察されたとしても、これらのモデルは原発性腫瘍誘導から転移までの潜伏時間が長く、原発性腫瘍量で死亡する可能性がある12。CRC肝転移を効率的に生成するために、培養したCRC細胞を、脾臓内注射、肝臓への直接実質内注射、門脈注射の3つの注射アプローチを用いて肝臓に移植する。脾臓内注射された癌細胞は、脾静脈、門脈、そして最終的には肝臓に広がった13、14。しかしながら、脾臓内注射は、他の移植モデルと比較して低い腫瘍採取比をもたらす15、16。脾臓内注射では、脾臓における癌の増殖を避けるために脾臓の外科的除去が行われ、これは潜在的に免疫細胞成熟を損なう可能性がある17。さらに、脾臓内注射はまた、脾臓および腹腔18において意図しない腫瘍増殖をもたらし得、肝転移分析を複雑にする。肝臓への直接実質内注射は、効率的に肝転移を誘導する16、19、20。それにもかかわらず、このアプローチは、門脈播種を介して自然に起こる肝転移の生物学的ステップを完全には再現しない。肝臓への直接注射を用いて、癌細胞の非門脈への侵入、しかし全身循環はまた、複数の大きな肺転移をもたらし得る16。CRC肝転移を有する患者の大多数は肝臓21に複数の腫瘍結節を示すが、特定の肝葉への直接注射は単一の腫瘍塊19、20を生成する。門脈注射または腸間膜静脈注射は、技術的には困難であるが、患者17において見られる成長パターンを反復する様式で肝臓への腫瘍細胞の効率的な送達を可能にする。この戦略は、二次部位転移の可能性を最小限に抑え、肝臓における癌細胞の急速な増殖を可能にし、マウスの生存率分析を簡素化する。

歴史的に、マウスMC-38、ヒトHT-29、およびSW-620などの結腸直腸癌細胞株は、肝転移22、23のマウスモデルを作製するために使用されていた。しかしながら、これらの結腸直腸癌細胞株は、デスモプラスティック間質反応を誘導しない。腫瘍中の間質含有量が低いと、がん関連線維芽細胞の生物学的役割を調べることが困難になります。CRCオルガノイドとその移植における最近の進歩は、がんの進行における間質の重要な役割を評価するための有用なプラットフォームを提供している24。CRCオルガノイドの肝移植は、線維芽細胞に富む腫瘍微小環境を生成し、間質研究に新たな洞察を提供してきた6,25。現在、オルガノイドの門脈または腸間膜静脈注射は、CRC肝転移を発生させるためのゴールドスタンダードアプローチとなっている6、25、26、27、28。それにもかかわらず、我々の知る限り、結腸直腸腫瘍イドの門脈注入のための詳細な方法を記載した以前の論文はない。ここでは、CRCオルガノイドの門脈注入を用いて、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介間質指向療法を開発するための方法論を提示する。

肝細胞は、肝臓における転移性腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、転移性癌の進行において重要な役割を果たす29。非腫瘍性患者30、31の肝細胞におけるタンパク質発現を誘導するAAV遺伝子治療アプローチの成功に触発され、我々は同様のアプローチを調査したが、CRC25における肝腫瘍微小環境を改変することを目指した。そのようにして、我々はまた、肝腫瘍微小環境を改変する抗腫瘍化タンパク質の発現を誘導するAAV8の尾静脈注射を本明細書に記載する。ウイルス産生中のウイルス性カプシドタンパク質の選択によって指定されるAAV8血清型は、肝細胞の特異的な高い形質導入効率(すなわち、肝腫瘍微小環境における標的遺伝子発現)をもたらす32。我々は以前、Islr(ロイシンリッチリピートを含む免疫グロブリンスーパーファミリー)が、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達を誘導し、CRC腫瘍様増殖を減少させ、Lgr5+腸幹細胞分化を促進するCAF特異的遺伝子であることを示した25。我々は、AAV8-Islr治療マウスにおいてCRC腫瘍イドの門脈注射を行うことによって、肝細胞における癌抑制間質遺伝子IslrのAAV8媒介性過剰発現が肝転移進行を減弱させることができるかどうかを試験した。

本稿では、まず肝熱帯性AAVの尾静脈注射手順について説明する。次に、AAV処理マウスへの腫瘍様細胞調製および門脈注入の方法について説明する。最後に、間質指向性治療薬の有効性を評価するために転移性腫瘍の進行をモニターするためのアプローチを提示する。

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Protocol

この記事のすべての動物手順は、南オーストラリア州保健医療研究所動物倫理委員会(承認番号、SAM322)によってレビューおよび承認されました。

1. アデノ随伴ウイルスの尾静脈注射

注:アデノ随伴ウイルス(AAV)は、バイオセーフティレベル1ガイドラインの下でバイオハザードとして扱われるべきです。AAVの調製、精製、および滴定に関する公開プロトコル33を参照してください。肝細胞指向性AAV、AAV834、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター−Islr 遺伝子をコードする、本研究25に使用した。AAV媒介性過剰発現を誘導するために、AAV投与は、プロモーター活性、遺伝子、およびマウス体重に応じて最適化を必要とするかもしれない。

  1. AAVベクターを1.0 x 1011ウイルスゲノムを含む150 μLアリコートに希釈し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用し、氷上に保管する。AAVを取り扱うために個人用保護具を着用する必要があります。
    注:凍結と解凍のサイクルを繰り返すと、ウイルス力価が低下するため、避けてください。ストックウイルス溶液は、-80°Cの冷凍庫に保存する必要があります。
  2. ヒートボックス(動物温暖化室)の電源を入れて35°Cに予熱します。
  3. マウスを保持し、尾静脈注射の少なくとも15分前に尾の全長に局所麻酔クリームを塗布する。
    注:これはオプションのステップであり、研究所の動物倫理委員会によって要求されていない場合は、必要でない場合があります。地元の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってください。この実験25では、Rosa26-Cas9マウスをCRCオルガノイドのAAV注射およびその後の門脈注射に使用した。この研究で使用された腫瘍イドがRosa26-Cas9マウス(C57BL/6 x 129の遺伝的背景)に由来することを考えると、このマウス株は腫瘍移植の免疫能力のある同系レシピエントとしても使用された。雄および雌のRosa26-Cas9マウス(6〜24週齢)を用いた。
  4. マウスをヒートボックスに入れます。マウスを最大15分間放置して、尾静脈を温めて拡張します。
  5. マウスをげっ歯類の拘束具に静かに固定します。尾を熱ランプの下に置き、尾静脈が完全に拡張されるようにします。
  6. 150μLの希釈AAV(ステップ1.1で調製)を27〜30G針で低デッドスペース滅菌シリンジに引き込む。
  7. ヒートランプを動かし、尾の側面にある側方尾静脈を特定します。尾がまっすぐになるように指で尾に少し緊張をかけます。
  8. 2〜3mmの針をゆっくりと挿入し、斜めにして静脈に入れます。針は尾とほぼ平行でなければなりません(尾から最大15°)。
    注:注射器への血液流入は、針が静脈に正常に配置されている場合に観察されることがあります。
  9. ゆっくりと注入する。抵抗が感じられたり、皮膚の腫れが観察された場合は、針を外し、最初の部位の上または他の側静脈に再挿入してください。
  10. 注射の完了後約5秒待ってから、ゆっくりと針を抜く。出血が止まるまで、清潔なガーゼまたはペーパータオルで注射部位に直ちに穏やかな圧力をかけてください。
  11. マウスをケージにそっと放します。出血が止まったことを確認するために動物を監視します。
    注:肝臓における遺伝子の過剰発現は、AAV尾静脈注射の1〜2週間後に評価することができる。これは、例えば、RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)、免疫組織化学(IHC)、ウェスタンブロッティング、または定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR;図1A、B)。以前に発表された研究25では、AAV8-Islrを用いて肝細胞においてマウスIslr遺伝子を過剰発現させ、その過剰発現をRNA ISHによって検出した(図1A、B)。

2. 結腸直腸癌オルガノイドの細胞製剤

注:この実験に使用したCRCオルガノイドは、上皮細胞のみを含む。CRCオルガノイドの培養および生成は、以前に記載されている25、35。要するに、正常な結腸上皮細胞を、陰窩単離緩衝液(氷冷PBS中の5mM EDTA(エチレンジアミンテトラアセテート))を用いてRosa26−Cas9マウスの結腸から単離し、次いで基底膜マトリックス培地に包埋し、そして参考文献35に記載されるようにオルガノイド増殖培地中で培養した。次いで、ApcおよびTrp53変異を、レンチウイルス発現プロトコルを用いてApcおよびTrp53を標的とするシングルガイドRNAを過剰発現させることによって結腸上皮細胞に導入した。単一のオルガノイドクローンを厳選した25個。pc Δ/ΔおよびTrp53 Δ/Δ結腸癌オルガノイド(AP腫瘍イド)を、10 μM Y-27632を含む100 μLのPBS中の5.0 x 105個の単一細胞としてマウス1匹当たり門脈に注射し、以下に示すオルガノイド培養および単一細胞調製物を用いた。

  1. 門脈注入の3〜5日前に基底膜マトリックス培地ドーム内のCRCオルガノイドを24ウェルプレートまたは10cmディッシュで培養し、直径50〜400μmのオルガノイドを得た。
  2. 注射のために培養されているオルガノイドの数を消化するのに十分な量のY-27632を10μM濃度に添加して、十分な量の細胞剥離溶液を調製する。37°Cの水浴中で予備加温する。
    注:このプロトコルで使用される細胞剥離溶液は、組換え細胞解離酵素ミックスであり、オルガノイド培養におけるトリプシンの代替物として使用される( 材料表を参照)。これは、トリプシン36と比較して細胞解離によって引き起こされる細胞損傷を減少させる。Y-27632はRhoキナーゼ阻害剤であり、解離誘導細胞死を阻害し、それによって単一細胞生存率を増加させる37。
    1. 最大5匹のマウスに注射するために、約300個のオルガノイド(直径50〜400μm)を含む各ドームを有する10〜24 x 50μLの基底膜マトリックスドームを消化するために、40mLの細胞剥離溶液を含む2本のチューブを調製する、すなわち、各マウスに2〜4.8個のオルガノイド(約600〜1440個のオルガノイドに相当)を注射する。十分な細胞数を得るために必要なオルガノイドの数は、オルガノイド株に依存するため、最適化されるべきである。
      注:2番目の40mLチューブは、解離した単一細胞を得るために、新鮮な細胞剥離溶液による反復消化を可能にする。
  3. 各ウェルからオルガノイド培地を慎重に吸引する。
  4. 24ウェルプレートの各ウェルに1mLの氷冷PBSを加える。10cmの皿を使用する場合は、10mLの氷冷PBSを皿に加える。
  5. P1000ピペットチップを用いて基底膜マトリックス培地を引っ掻き落とす。PBS/培地スラリーを15mL遠沈管に移す。
  6. 各ウェルを同量のPBSですすぎ、基底膜マトリックス断片を収集し、15mLチューブに加えます。
  7. 氷上で5分間インキュベートする。このインキュベーションは、基底膜マトリックス培地を溶解するのに役立つ。
  8. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  9. 上清を吸引し、ペレット状の培地や細胞を乱さないようにする。
  10. ステップ2.2で調製した5 mLの加温済み細胞剥離液をペレットに加え、ペレットを10回再懸濁し、新鮮な予め加温した細胞剥離溶液を含む50 mLチューブに戻した。
  11. チューブを37°Cの水槽に入れる。5分間インキュベートする。
  12. チューブを400 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
  13. 手順 2.9 ~ 2.11 を繰り返します。
    注:酵素消化を繰り返すことで、単一細胞への効率的な細胞解離が可能になります。
  14. オルガノイドが単一細胞に解離しているかどうかを確認するには、96穴プレートに100μLをピペッティングし、顕微鏡で観察します。多くのオルガノイドが4つ以上の細胞からなる細胞凝集塊を示す場合、細胞剥離溶液とのより長いインキュベーションおよび10mLピペットによる摩砕による物理的解離が必要な場合がある。
  15. ほとんどの細胞が単一細胞になったら、40mL細胞懸濁液に4mLのウシ胎児血清(FBS)を加えて消化を停止します。40 μm のセルストレーナーを 5 mL PBS ですすいでください。
  16. 細胞懸濁液をセルストレーナーに通して50mLの収集チューブに通し、細胞凝集塊を除去します。
  17. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  18. 上清を吸引する。細胞ペレットに10 mLの冷たいPBSを加え、それを15 mL遠沈管に移す。
  19. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  20. 上清を吸引する。ペレットを10μM Y-27632を含む500μLの冷PBSに再懸濁する。セルを数えます。
  21. 10 μM Y-27632 の PBS を使用して、細胞濃度を5.0 x 105 個の単一細胞/100 μL に調整します。門脈注入が行われるまで、チューブを氷の上に置きます。
    注:解離から4時間以内に解離した細胞を注入することをお勧めします。

3. CRCオルガノイドの門脈注入

注:すべての手術器具および手術用ガーゼは、手術前にオートクレーブ処理または滅菌する必要があります。このプロトコルは、以前のプロトコル17から変更される。この実験25では、ステップ1においてAAV−mRuby2 またはAAV−Islr で処置したRosa26−Cas9マウスを用いて門脈注入を行った。

  1. 加熱パッド上の滅菌ドレープを使用して無菌手術領域を準備する。
  2. 手術器具(はさみと鉗子)、手術用および止血スポンジ、4-0ポリグラクチン縫合糸、綿芽、皮膚ステープラー、ステープラーアプリケーター、生理食塩水、ブプレノルフィン、およびハミルトンシリンジに取り付けられた33G針を準備します。止血スポンジを1.0 cm x 1.0 cmに切ります。
  3. 手術領域を照らすために光源の位置を調整します。
  4. 0.1mg/kg体重のブプレノルフィンをマウスの皮下に注射し、外科的疼痛管理を行う。
  5. 麻酔室でイソフルランでマウスを麻酔する。誘導および維持のためのイソフルラン濃度は、通常、それぞれ5%および2.5%である。次の手順を開始する前に、つま先のピンチに対する反応がないことを確認してください。
  6. マウスの中央から上腹部を電気シェーバーで剃ります。剃毛は、無菌手術領域から離れた領域で行い、毛が部位を汚染するのを避けるべきである。
  7. 切開部位をベタジンと80%エタノールで交互に清掃し、手術領域を滅菌します。これを3回繰り返します。
  8. 維持イソフルラン麻酔で仰臥位で加熱パッド上にマウスを置きます。マウスの腹部に穴の開いた外科用ドレープを置きます。
  9. 鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、はさみで正中線に2〜3cmの皮膚切開を行い、皮膚のみを切断する(腹膜の下ではない)。切開部は、中腹部から胸骨の剣状突起までの範囲であるべきである。切開部は、剣状突起の下端より上であってはならない。
  10. 腹膜壁を鉗子で完全に持ち上げ、はさみで腹膜に同様の2〜3cmの切開を行います。腸や横隔膜を切らないでください。
  11. 手術用ガーゼを温かい生理食塩水で浸し、切開部の左側(マウスの体の左側、外科医の右側)に置きます。
  12. 生理食塩水で浸した綿棒を使って内臓(小腸と大腸)をやさしく引き抜きます。生理食塩水で浸したガーゼの上に腸を置きます。
    注:マウスの左側の腸(すなわち、外科医の右側の腸)を最初に引き抜く必要があり、次にマウスの右側の腸(すなわち、外科医の左側の腸)を引き出すことができる。
  13. 腸の位置を調整して門脈を視覚化します。腸を湿らせておくために、追加の湿ったガーゼで腸を覆います。
  14. 濡れたガーゼで腸を左側にそっと引っ張り、左にやさしい緊張を加えます。これにより、門脈の可視化が容易になる(図2A)。
    注:門脈の視覚化が困難な場合は、濡れた綿棒で胃の位置を優しく調整すると、視覚化に役立つ場合があります。
  15. 腫瘍様懸濁液を数回穏やかにピペットし、均質な細胞懸濁液を得た。33G針に取り付けられたハミルトンシリンジに100μLの細胞懸濁液をゆっくりと引き込む。気泡を避けてください。
  16. 針をゆっくりと挿入し、斜めにして門脈に挿入します。針に沿った挿入深さは3〜4mmで、針の角度は門脈とほぼ平行であるべきである。
    注:注射は、門脈のよく視覚化された部分(通常、肝ヒルムから最大2cm離れた部分)に行うべきである。針が門脈に完全に挿入された後は、針の動きを避けてください。
  17. 腫瘍細胞を30秒間注射する。注射は、門脈の閉塞を防ぐためにゆっくりと行うべきである。注射が成功すると、肝臓の色は一時的に赤から白に変わります。
  18. 針をゆっくりと外します。すぐに乾いた綿芽で注射部位に穏やかな圧力をかけ、5分間待ちます。
  19. 綿棒を取り除き、同時に止血スポンジを注射部位に塗布する。綿棒または鉗子で止血スポンジを保持し、さらに5分間穏やかな圧力をかけます。
  20. 止血スポンジへの圧力を取り外し、注射部位からの出血がないことを確認する。
    注:生体吸収性止血スポンジは取り外す必要はありません。ガーゼを取り除こうとすると、注射部位から再出血する可能性があります。
  21. 出血が発生した場合は、直ちに綿棒で約10分間加圧止血を行う。その後、追加の止血スポンジをさらに5分間塗布する。
    注:制御不能な失血が観察された場合、マウスは研究所の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って安楽死させるべきです。
  22. 腸の外科用ガーゼを取り除く。5mLの生理食塩水を充填した注射器を用いて、生理食塩水を腸に噴き出し、臓器の癒着を防止する。
    注:門脈注入部位に生理食塩水を塗布しないでください。これは、再出血を引き起こす可能性があります.
  23. 腸を腹腔内にそっと戻します。
  24. 4-0ポリグラクチン縫合糸を用いて腹膜を縫合する。
  25. 鉗子で皮膚の両側を持ち上げます。皮膚の切開部を閉じるために皮膚のステープラーを塗布する。腸をホチキス止めしないように注意してください。
  26. イソフルランをオフにしますが、酸素の流れは流れ続けます。マウスを注意深く監視します。マウスが目を覚ましたら、加熱パッドの空のケージにマウスを置きます。マウスは通常5分以内に目を覚ます。
  27. マウスが意識を持ち、正常に歩行できるようになるまで、マウスを注意深く監視します。
  28. 手術後4時間で0.1mg/kgのブプレノルフィンをマウスに皮下注射する。
  29. 0.1mg/kgのブプレノルフィンを24時間ごとにマウスに注射し、その後2日間投与する。
  30. 手術後1週間、マウスを毎日注意深く監視する。縫合糸と創傷治癒を確認してください。
  31. 手術の数日後、ステープラーリムーバーを使用して皮膚のホッチキスを取り除きます。

4. in vivo 生物発光イメージングによる腫瘍増殖動態の評価

注:ホタル発現ポノノイドを注射に使用する場合、転移性腫瘍の進行は、38、39に記載されているように、in vivoイメージングによって毎週モニターすることができる。癌細胞によって発現されるルシフェラーゼは、癌細胞に対する免疫応答を惹起し、腫瘍増殖を制限する可能性がある40。したがって、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を用いたマウスモデルにおける免疫表現型および癌進行の解析には注意が必要である。

  1. 滅菌PBSを用いてD-ルシフェリンの30mg/mL溶液を調製する。光から守ってください。D-ルシフェリンは、使用時まで-20°Cのアリコートで保存する必要があります。
  2. 電子シェーバーで腹部と胸部を剃ります。これは、 インビボ イメージングの1日前まで行うことができる。
  3. 150mg/kg体重のD-ルシフェリンをマウス腹腔内に注射する(すなわち、マウスの体重が30gの場合、150μLのD-ルシフェリン溶液を注入する)。
  4. マウスを麻酔室に入れ、麻酔をかける。誘導には5%のイソフルランを使用し、メンテナンスには2%〜3%を使用してください。
  5. 数分後、マウスを横方向の位置(右側を上に)に置きます。先に記載したように インビボ イメージングシステム(IVIS)を用いて生物発光画像を取得する38、39。
    注:マウスは、仰臥位と比較して横方向の位置でより安定している。したがって、横方向の位置は、一貫した焦点面から発光画像を得るのに好ましい。
  6. マウスを空のケージに入れ、回復を監視します。
  7. 38で説明したように、リビングイメージソフトウェアを使用して上腹部の関心領域を定義する。腫瘍細胞数の代理として全フラックスを定量化する。

5. 生存期間解析と組織採取

  1. マウスを注意深く監視して、腹部の露出がずれているような転移の臨床症状を注意深く観察する。
  2. マウスが人道的なエンドポイントに到達したら、CO2 吸入によってマウスを安楽死させる。
    注:研究所の動物倫理委員会によって承認された研究エンドポイントを使用してください。人道的なエンドポイントを決定するために、臨床記録シートが使用された。スコアは、以下の観察のそれぞれの存在について与えられた1点によって計算された:体重減少>15%、直感した姿勢、フリルのあるコート、脱水、運動の減少、腹部の露出、または顔の恨み。スコア3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。
  3. 安楽死の直後に、41に記載されているように、ヒュームフード内の10%ホルマリン30〜50mLで経心経灌流固定を行う。灌流する前に肝臓の正常な部分にハサミでいくつかの小さな切開(それぞれ最大1cm)を行い、血液とホルマリンの出口を生成します。灌流すると、肝臓の色は赤から茶色に変わります。
    注:巨視的に正常な肝臓領域における微小転移が研究対象である場合、研究者は肝臓を切断するのではなく、代わりに上大静脈を刈り取ることをお勧めします。しかし、この方法を使用した場合、肝臓を切断することと比較すると、肝臓の固定が悪いようです。特にRNA in situ ハイブリダイゼーション(ISH)を肝臓切片で行う予定の場合は、前述のようにホルマリンの心臓内注射前に肝臓に切開することをお勧めします。これにより、肝臓組織の十分な固定が可能になり、ISHに対するRNA完全性の保存をもたらす。
  4. 肝臓および肺組織を10%ホルマリンに入れ、一晩固定する。ホルマリンを70%エタノールで置換し、続いてパラフィン包埋を行った。
  5. ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行い、腫瘍領域を組織学的に評価する。目的の間質マーカーについて免疫組織化学を行う。ピクロ・サイラス・レッド染色を行い、コラーゲン陽性領域を評価します。
    注:ImageJソフトウェア42 は、免疫組織化学およびピクロシリウスレス染色データを定量するために使用することができる。カラーデコンボリューション機能とMRI線維症ツールを使用して、それぞれ3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)陽性領域とピクロシリウス赤陽性領域を評価することができます。

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Representative Results

腫瘍抑制間質遺伝子Islr 4,25,43,44のAAV媒介性過剰発現を肝細胞において誘導するために、我々は、IslrコードAAV8を静脈内注射した。0 x1011のAAV8-Islrのウイルスゲノム(vg)、または対照として、AAV8-mRuby2を、成体マウス尾静脈に注射した(図1A)。尾静脈注射の2週間後、肝細胞におけるIslrの過剰発現を検証するために肝臓を採取した。RNAscopein situハイブリダイゼーション45を行い、肝臓全域で3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)+シグナルが観察されることを確認した(図1B)。AAV8-mRuby2処理マウスの肝臓ではDAB+シグナルは検出されなかった。

インドインクを注入して門脈注入手順を実践した(PBSで1:1000希釈)。上腹部に切開を行った後、腸を腹腔から穏やかに取り出して、門脈の可視化を可能にした(図2A)。インドインクの門脈注入は、肝臓全体にインクを送達したが、肺には送達しなかった(図2B)。インクが誤って下大静脈(IVC)や腹部大動脈などの他の血管に注入されると、インクの全身循環が肺の色を黒色に変化させる。インドのインクはまた、膵臓または腹膜の播種を示す門脈からの漏れの量を特定するのにも役立ちます。

AAV-mRuby2の尾静脈注射の2週間後、Apc Δ/ΔおよびTrp53Δ/Δ結腸癌オルガノイド(AP腫瘍イド)を単一細胞に解離させ、マウス門脈に注射した(図3A)。転移性腫瘍の成長を確認し、組織学を評価するために、我々は、顕著な壊死が組織病理学的分析を混乱させる前に、門脈注射の3〜4週間後(すなわち、人道的なエンドポイントではなく、タイミングのとれた時点で)肝臓を採取した。巨視的には、腫瘍イドの門脈注射は、肝臓に複数の白色腫瘍結節をもたらした(図3B)。我々は、同じ細胞数の腫瘍イドの脾臓内注射が大きな転移性腫瘍塊を生成しないことを見出した。このことは、門脈注入アプローチが脾臓内注射モデルと比較してより効率的に肝転移を誘導したことを示唆している。門脈注入により誘導されるCRC肝転移のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、デスモプラスティック間質反応および壊死を伴う中分化性尿細管腺癌の組織病理学を実証した(図3C)。この間質に富む組織学は、ヒトCRC肝転移の組織学を忠実に再現しており(図3C)、このモデルは転移性腫瘍間質を調査するトランスレーショナルリサーチに適しています。さらに、CAFの十分に確立されたマーカーであるα-平滑筋アクチン(αSMA)の免疫組織化学は、腫瘍領域の約7%がαSMA陽性であることを示し、このマウスモデルにおけるCAFの存在を確認した(図3D、E)。コラーゲン46を染色するピクロシリウス赤色染色は、腫瘍間葉系に豊富なECMを示し、腫瘍領域の約13%がコラーゲン陽性であった(図3D、E)。上皮系譜マーカーであるEPCAMの免疫組織化学により、転移性CRCが腫瘍出芽(単一の腫瘍細胞または最大4つの腫瘍細胞からなる細胞クラスター)を示し、予後不良の結腸直腸癌の特徴であることが明らかになった47(図3F)。転移性CRCにおけるKi67標識指数は約80%であり、ほとんどの腫瘍細胞が分裂活性であることを示している(図3G、H)。

我々は、この前臨床モデルにおいてマウスの生存および腫瘍増殖動態解析を行った。我々の最初のパイロットコホートにおけるマウスは、門脈への腫瘍様注射後57日間の生存期間中央値を示した(N = 4匹のマウス; 図4A)。これは後に、より大きな対照AAV8−mRuby2注射群25において複製された。人道的エンドポイント(注、ステップ5.2に示すように)では、パイロット群の4匹のマウスのうち3匹が腹水を示し、これは進行した肝転移患者でも観察される48。腫瘍増殖を評価するために、 インビボ 画像化システム(IVIS)を用いて、腫瘍様由来発光を測定した(図4B、C)。生物発光シグナルは上腹部内で観察され、肝臓特異的な腫瘍増殖を示唆した(図4B)。IVISシグナルが下腹部で観察される場合、これは腹膜播種または腹部器官への二次転移を示す。毎週の in vivo イメージングにより、各マウスの腫瘍増殖の縦断的評価が可能になり(図4C)、その後の大規模な研究で治療効果を監視することが容易になりました。腫瘍採取率は、IVISシグナルによって評価された100%(4/4マウス)であった。この実験では、組織採取時に巨視的に明らかな肺転移は認められなかった(0/4マウス)。

最後に、AAV媒介肝細胞によるがん抑制CAF遺伝子Islr 4,25の送達が、この前臨床マウスモデルにおいてCRC肝転移増殖を阻害できるかどうかを調べた。特に、AAV8-Islr処置マウスは、マウスの生存率の改善および腫瘍からのIVISシグナルの減少を示した(図5A-C)25。リン酸化Smad1/5/8の免疫組織化学は、BMPシグナル伝達能因子であるISLRの肝細胞過剰発現が転移性腫瘍におけるBMPシグナル伝達を増強することを実証した(図5D)。AAV8-Islrによる治療は、CRC肝転移におけるKi67+増殖細胞の数を減少させた(図5E)。結果の詳細については、小林ら、消化器内科、202125を参照されたい。我々の集団的データは、AAV8媒介性肝転移性腫瘍間質29の重要な構成要素である肝細胞への腫瘍阻害遺伝子の送達が、CRC肝転移に対する効果的な予防/治療的アプローチとなり得ることを示している(図5F)。

Figure 1
図1:尾静脈投与されたAAV8-Islrは肝臓でIslr過剰発現を生じる。 (a)AAV8の尾静脈注射、続いて結腸直腸癌(CRC)オルガノイドの門脈注射を示す実験スキーム。ISH, in situハイブリダイゼーション;IHC, 免疫組織化学;qRT-PCR、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。(B)代表的な写真。Islrに対するRNAin situハイブリダイゼーションは、AAV8-IslrまたはAAV8-mRuby2処置マウス由来の肝臓を用いて行った。肝臓を尾静脈注射の2週間後に採取した。スケール バー、50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:インドインクの門脈注射は、肝臓への送達をもたらすが、肺には送達しない。門脈の可視化のために、腸は腹腔の外側に採取されることに注意してください。右側の写真は、各臓器と血管の解剖学的注釈を示しています。黄色の矢印は注射部位を示す。IVC、下大静脈。(B)インドインクの門脈注射後の肝臓と肺の代表的な写真。黄色の矢印は、インドのインクで染色された血管を示しています。縮尺棒、1 cm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:結腸直腸癌オルガノイドの門脈注射は間質に富む肝転移を生成する。 (A)Apc Δ/ΔおよびTrp53Δ/Δ結腸癌オルガノイド(AP腫瘍イド)の門脈注射を示す実験スキーム。スケールバー、200μm. T、腫瘍性。(b)門脈注射(左)または脾臓内注射(右)の3〜4週間後に採取した肝臓の代表的な巨視的写真。AP腫瘍様体からの5.0 x 105個の単一細胞を門脈または脾臓に注入した。脾臓内注射は、13に記載のようにして行った。白い結節は腫瘍を示す。T, 腫瘍;N, 正常な肝臓.(c)門脈注射マウスモデル(左および中央)およびヒト(右)からのCRC肝転移の代表的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色写真。T, 腫瘍;N, 正常な肝臓;S, 間質;ネク、ネクロシス。黄色の点線は、腫瘍と正常な肝臓(左)の境界を示す。(D及びE)α-平滑筋アクチン(αSMA;左)およびピクロ-シリウス赤色染色(右)の免疫組織化学(IHC)。(D)代表的な写真。(E)αSMA陽性領域(左)とピクロ・シリウス赤陽性領域(右)の定量化N = 4 マウス、5 HPF (ハイパワーフィールド; 400x)/マウス。(f)上皮細胞マーカーであるEPCAMに対する免疫組織化学を示す代表的な写真。緑色の点線は腫瘍の出芽を示す。(GおよびH)細胞増殖マーカーであるKi67の免疫組織化学。(G)代表的な写真。(h)上皮細胞全体に占めるKi67+細胞の割合。上皮細胞をヘマトキシリン対比染色により可視化した。N = 4マウス、5HPF/マウス。(B)−(H)において、AP腫瘍イドの注射後3〜4週間で全てのマウス肝臓組織を採取した。平均± S.E.M.各ドットは、マウス由来の5個のHPF(EおよびH)の平均値を表す。スケール バーは、1 cm (B)、1 mm (C; 左)、100 μm (C; 中央と右)、および 50 μm (D、F、および G) を表します。なお、ヒト組織を用いた本研究は、名古屋大学大学院医学系研究科倫理委員会(2017-0127)により承認されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4: in vivo イメージングによる生存解析および腫瘍増殖動態解析。 (A) カプラン・マイヤー生存曲線。N=4匹のマウス。(B,C) インビボ イメージングシステム(IVIS)を用いて、腫瘍増殖動態を評価した。(B)代表的な写真。赤いボックス内の領域は定量化に使用されました。(C)成長動態。各マウスからのルシフェラーゼシグナルが示されている。N=4匹のマウス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:肝細胞へのIslrのAAV8媒介遺伝子送達は、CRC肝転移の門脈注入モデルにおいて、BMPシグナル伝達を増加させ、腫瘍増殖を減少させ、マウスの生存を改善する。 (A) カプラン・マイヤー生存曲線。AAV−IslrまたはAAV−mRuby2の尾静脈注射の2週間後に、CRC腫瘍イドの門脈注射を行った。(B及びC)腫瘍性誘導ルシフェラーゼシグナルをIVISを用いて評価した。(B)代表的な写真。(C)IVISシグナルの定量化N=5(AAV-mRuby2)および8(AAV-Islr)マウス。平均± S.E.M. (D) 代表的な写真。リン酸化Smad1/5/8(pSmad1/5/8)のための免疫組織化学(IHC)。Smad1/5/8は、BMPシグナル伝達活性化49時にリン酸化される骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の下流分子である。N=それぞれ4匹のマウス。(E)代表的な写真。Ki67の免疫組織化学。N=それぞれ4匹のマウス。(F) グラフィカルな要約。AAV媒介性肝細胞指向性遺伝子送達は、癌抑制間質遺伝子がCRC転移を阻害する治療戦略として役立つかもしれない。肝細胞におけるIslrのAAV8媒介性過剰発現は、BMPシグナル伝達を増強し、CRC転移進行を制限することによって転移ニッチを再構築した。詳細については、小林ら, 消化器病学, 202125を参照されたい。ログランク検定(A)、および第3週(C)での事後シダックの多重比較検定による二元反復測定ANOVA(分散分析)。図5A-Cは、消化器内科、Vol 160(4)、小林ら、GREM1およびISLRが結腸直腸発癌を媒介とする間質BMPシグナル伝達のバランス、1224-1239.e30ページ、著作権(2021年)、エルゼビアの許可を得て転載されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本研究では、マウスCRCオルガノイドの門脈注射が、ヒトCRC肝転移の組織学的特徴を模倣した線維芽細胞に富む肝転移を再現性よく生成することを示した。さらに、AAV8媒介性遺伝子治療などの間質指向性治療薬と組み合わせると、この前臨床モデルは、マウスの生存および腫瘍増殖に対する治療効果を評価するための有用なツールとして役立つ。

プロトコルには、少なくとも 2 つの重要なステップがあります。まず、オルガノイドを完全にトリプシン処理し、メッシュフィルターを使用して細胞凝集塊を除去することによって、腫瘍イドの単一細胞懸濁液を調製することが重要です。腫瘍イドの不完全な解離は大きな細胞凝集をもたらし、その注入は門脈を閉塞し得る。これは肝臓の梗塞および動物死22を引き起こす。第二に、門脈注射中は、門脈からの出血を最小限に抑えることが不可欠です。針は門脈に適切に挿入する必要があります。門脈の反対側の穿刺を避けるために、挿入された針の角度は門脈とほぼ平行に保つべきである。注射中の門脈の裂け目を防ぐために、針が門脈に完全に挿入されたら、針を動かさないでください。門脈から針を取り除いた直後に、綿棒で注射部位に少なくとも5分間圧力をかけることが不可欠です。

注射用の細胞数は、レシピエントマウス(例えば、免疫能力マウス対免疫不全マウス)およびオルガノイド株の造腫瘍性に応じて改変される必要がある。我々の実験では、100 μL懸濁液中の5.0 x 105個の単一細胞の注射は、免疫適格マウスにおいて肝転移を発生させるのに十分であった。細胞数を増加させることは、門脈における塞栓症および動物14の死のリスクを高める可能性があるため、慎重に検討されるべきである。以前の論文では、門脈または腸間膜静脈25、26、27、28への腫瘍様注入に100μL中の5 x 104〜5 x 105細胞を使用していたことを考えると、この細胞数範囲が最適化のための良い出発点であると考えています。

門脈注入アプローチの1つの限界は、CRC転移のカスケード全体を完全に反復しないことである。癌の肝転移は、5つの主要なステップを必要とする:(1)原発部位での癌細胞浸潤、(2)血管内への溢血、(3)門脈循環における細胞生存、(4)門脈から肝実質への溢出、および(5)転移ニッチ50におけるコロニー形成。門脈注入モデルでは、ステップ(3)~(5)の調査のみが可能です。他の転移過程についての洞察を得るためには、 インビトロ モデルおよび/または肝臓に頻繁に転移する Notch1変異原発性CRCマウスモデルなどの他のモデルを利用する必要がある51。

既存の方法に対する門脈注入法の重要性には、肝臓特異的増殖およびより高い腫瘍量が含まれる。他の注射モデルにおける腹膜播種および原発性CRCモデルにおける原発性腫瘍増殖は、肝転移進行の分析を混乱させる可能性がある。対照的に、我々の門脈アプローチは肝臓特異的腫瘍を急速に生成し、生存率および腫瘍増殖分析を簡素化する。

細胞株注射に対するオルガノイド移植の主な利点の1つは、腫瘍イドの門脈注入が、ヒト転移性CRCのデスモプラスティック特徴を表現コピーする線維芽細胞に富む腫瘍微小環境を生成したことである。オルガノイド培養条件は、腫瘍微小環境の特徴を再現し、成長因子の定義された組み合わせを有する豊富で複雑な3D ECMに細胞を埋め込むことを含む腸幹細胞集団を支持する24、52。これは、供給源腫瘍52、53の遺伝的景観を保存する様式での腫瘍細胞増殖をもたらす。対照的に、腫瘍細胞株の従来の2D培養は、クローン選択および元の癌の特徴を忠実に反映しない異常なゲノム/トランスクリプトーム変化と関連している54。我々は、癌細胞株の2D培養のための比較的過酷な培養条件は、細胞が生存のために間質由来のシグナルを必要としなくなったため、ECM/成長因子シグナルの欠如に細胞を適応させ、その後、 インビボで間質不良腫瘍をもたらす可能性があると推測する。

オルガノイド門脈注入モデルをAAV8媒介性遺伝子治療と組み合わせることにより、肝臓における癌細胞コロニー形成前に肝細胞に癌抑制ペイロードを送達することで、CRC転移増殖を阻害するために(事前)転移ニッチを改変できることを見出した25。有望なことに、臨床試験は、AAV媒介性の肝臓へのin vivo遺伝子導入が導入遺伝子の長期発現を誘導し、非腫瘍性遺伝性疾患を治療するための効果的かつ安全なモダリティとなり得ることを実証している30,31,55。将来的には、AAVアプローチを通じて肝細胞を利用して肝転移を予防することは、転移のリスクが高いがん患者において潜在的な臨床的価値を有する可能性がある。

要約すると、我々の論文は、門脈を介したCRCオルガノイド移植が線維芽細胞に富む肝転移を生成し、間質を標的とする治療戦略の開発に利用できることを示している。門脈注射をAAV媒介性遺伝子送達などの間質指向性療法と組み合わせることにより、CRC転移進行を抑制する新規間質標的を同定することができる。

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Disclosures

著者らは利益相反がないと宣言しています。

Acknowledgments

この研究は、National Health and Medical Research Council(APP1156391からD.L.W.、S.L.W.)からの助成金によって支援された。(APP1081852からD.L.W.、APP1140236からS.L.W.、APP1099283からD.L.W.、);Cancer Council SA Beat Cancer Projectは、保健省を通じてドナーと南オーストラリア州政府を代表して(MCF0418からS.L.W.、D.L.W.へ)。文部科学省委託科学研究費補助金(基盤研究(B)(20H03467~M.T.)AMED-CREST(独立行政法人日本医療研究開発機構 進化科学技術基盤研究(19gm0810007h0104、19gm1210008s0101~A.E.)、AMEDからがん研究・治療進化プロジェクト(P-CREATE)(19cm0106332h0002~A.E.);日本学術振興会若手研究者海外チャレンジプログラム(所在日)、武田科学財団フェローシップ(所英)、グリートン国際博士課程奨学金(所在日)、ライオンズ医学研究財団奨学金(弊社)

我々は、組換えAAVベクターを作製したChildren's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) のVector and Genome Engineering Facility(VGEF)のLeszek Lisowski博士に感謝する。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

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がん研究 第175号
肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入
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Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

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