Summary
A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.
Abstract
A metástase hepática do câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um dos principais componentes do microambiente tumoral, desempenham um papel crucial na progressão metastática do CRC e predizem um prognóstico ruim do paciente. No entanto, há falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o crosstalk entre células cancerígenas metastáticas e CAFs. Aqui, apresentamos um método para investigar como a progressão da metástase hepática é regulada pelo nicho metastático e possivelmente poderia ser contida pela terapia dirigida por estroma. A injeção de veia portal de organoides crc gerou uma reação desmoplástica, que recapitulou fielmente a histologia rica em fibroblasto de metástases hepáticas crc humanas. Este modelo foi específico do tecido com maior carga tumoral no fígado quando comparado a um modelo de injeção intra-esplênica, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo. Ao injetar organoides tumorais que expressam luciferase, a cinética de crescimento tumoral poderia ser monitorada por imagens in vivo . Além disso, este modelo pré-clínico fornece uma plataforma útil para avaliar a eficácia da terapêutica voltada para o mesenquime tumoral. Descrevemos métodos para examinar se a entrega mediada por vírus adeno de um gene estromal inibidor de tumores para hepatócitos poderia remodelar o microambiente tumoral e melhorar a sobrevivência do camundongo. Essa abordagem permite o desenvolvimento e a avaliação de novas estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortalidade por câncer em todo o mundo1. Mais da metade dos pacientes do CRC desenvolve metástase hepática que ocorre através da disseminação venosado portal 1. Atualmente, não há terapêuticas eficazes que possam curar metástase hepática avançada, e a maioria dos pacientes sucumbe à doença metastática.
O nicho metastático ou microambiente tumoral desempenha um papel fundamental no enenxermento e crescimento das células CRC disseminadas2. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um componente proeminente do microambiente tumoral, promovem ou restringem a progressão do câncer através de fatores de crescimento secretos, remodelação da matriz extracelular (ECM) e modulação de paisagens imunes e angiogênese 3,4,5. Os CAFs também conferem resistência às quimioterapias e imunoterápicos3. Além disso, os CAFs regulam a iniciação e progressão da metástase hepática do CRC e prevêem prognóstico em pacientes com C CRC 3,6,7,8. Assim, fatores relacionados ao CAF poderiam ser explorados para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC. No entanto, a falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o estromoma tumoral metastático tem sido um grande obstáculo para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao estroma.
Atualmente, modelos animais para estudar metástase hepática crc incluem modelos primários de CRC que desenvolvem espontaneamente modelos de metástase hepática e transplante de células cancerosas no fígado. Modelos primários de camundongos CRC, como modelos de camundongos geneticamente modificados e injeção cólon de células cancerosas, raramente apresentam metástase no fígado 9,10,11,12. Além disso, mesmo que seja observada uma metástase hepática, esses modelos mostram longa latência desde a indução do tumor primário até a metástase, e potencialmente morrem de carga tumoral primária12. Para gerar eficientemente metástases hepáticas crc, células de CRC cultivadas são transplantadas no fígado usando três abordagens de injeção: injeção intra-esplênica, injeção intra-parenchímal direta no fígado e injeção de veia portal. Células cancerígenas injetadas intra-esplenticamente se espalharam pela veia esplênica, a veia portal, e, finalmente, para o fígado13,14. No entanto, a injeção intra-esplênica produz uma menor relação de dor tumoral em comparação com outros modelos de transplante15,16. Com injeção intra-esplênica, a remoção cirúrgica do baço é realizada para evitar o crescimento do câncer no baço, o que pode comprometer potencialmente a maturação das células imunes17. Além disso, a injeção intra-esplênica também pode resultar em crescimento tumoral não intencional no baço e cavidade abdominal18, complicando as análises de metástase hepática. A injeção intra-pareínrima direta no fígado induz eficientemente a metástase hepática 16,19,20. No entanto, essa abordagem não recapitula totalmente um passo biológico de metástase hepática que ocorre naturalmente através da disseminação da veia portal. Usando injeção direta no fígado, a entrada de células cancerígenas em um não-portal, mas a circulação sistêmica também pode resultar em múltiplas metástases pulmonaresgrandes 16. Embora a maioria dos pacientes com metástase hepática CRC apresentem nódulos tumorais múltiplos no fígado21, a injeção direta em um lobo hepático específico gera uma única massa tumoral19,20. A injeção de veia portal ou injeção de veia mesentérico, embora tecnicamente desafiadora, permite a entrega eficiente de células tumorais no fígado de forma a recapitular os padrões de crescimento vistos em pacientes17. Essa estratégia pode minimizar a possibilidade de metástases de local secundário e permite o rápido crescimento de células cancerígenas no fígado, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo.
Historicamente, linhas de células cancerígenas colorretais como o mouse MC-38, o HT-29 humano e o SW-620 foram usadas para gerar modelos de camundongos de metástase hepática22,23. No entanto, essas linhas de células cancerígenas colorretais não induzem uma reação escromato desmoplástica. O baixo teor estroma nos tumores dificulta a investigação dos papéis biológicos dos fibroblastos associados ao câncer. Os recentes avanços nos organoides de CRC e seus transplantes têm oferecido plataformas úteis para avaliar papéis vitais do estroma na progressãodo câncer 24. O transplante de fígado de organoides CRC gera um microambiente tumoral rico em fibroblasto e forneceu novas informações sobre a pesquisa estromal 6,25. Atualmente, a injeção de veias mesentóricas de organoides tornou-se uma abordagem padrão-ouro para gerar metástase hepática CRC 6,25,26,27,28. No entanto, pelo que sabemos, nenhum trabalho anterior descreveu métodos detalhados para a injeção venosa portal de tumoróides colorretais. Aqui, apresentamos uma metodologia para o uso da injeção venosa portal de organoides CRC para desenvolver uma nova terapia orientada a adeno -mediada pelo estromoma ..
Os hepatócitos são um importante constituinte do microambiente tumoral metastático no fígado e desempenham um papel crítico na progressão do câncer metastático29. Inspirados pelo sucesso das abordagens da terapia genética AAV para induzir a expressão proteica em hepatocitos em pacientes não neoplásicos30,31, investigamos uma abordagem semelhante, mas que visava modificar o microambiente do tumor hepático no CRC25. Como tal, também descrevemos aqui a injeção da veia da cauda do AAV8 para induzir a expressão de proteínas anti-tumorigênicas para modificar o microambiente tumoral hepático. O sorotipo AAV8, designado pela escolha da proteína capsida viral durante a produção do vírus, leva à alta eficiência de transdução especificamente dos hepatócitos (ou seja, expressão genética direcionada no microambiente do tumor hepático)32. Já mostramos anteriormente que islr (superfamília imunoglobulina contendo repetição rica em leucina) é um gene específico da CAF que induz a sinalização de proteína morfogenética óssea (BMP), reduz o crescimento tumoróide do CRC e promove a diferenciação de células-tronco intestinais Lgr5+25. Testamos se a superexpressão mediada pelo AAV8 do gene estromal que restringe o câncer, Islr, em hepatócitos poderia atenuar a progressão da metástase hepática realizando a injeção de veia portal de tumoróides CRC em camundongos tratados com AAV8-Islr.
Neste artigo, descrevemos primeiro o procedimento de injeção da veia da cauda do AAV trópico hepático. Em seguida, descrevemos um método de preparação de células tumoróides e injeção de veia portal nos camundongos tratados com AAV. Por fim, apresentamos abordagens para monitorar a progressão do tumor metastático para avaliar a eficácia da terapêutica dirigida ao estroma.
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Protocol
Todos os procedimentos animais deste artigo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália do Sul (número de aprovação, SAM322).
1. Injeção de veia de cauda do vírus associado ao adeno
NOTA: O vírus associado ao Adeno (AAV) deve ser tratado como um risco biológico sob as diretrizes de Nível 1 de Biossegurança. Consulte o protocolo publicado para preparação, purificação e titulação33 da AAV. Hepatocyte-trópico AAV, AAV834, codificando o gene promotor-Islr citomegalovírus (CMV), foi utilizado neste estudo25. Para induzir a superexpressão mediada pelo AAV, a dosagem AAV pode exigir otimização dependendo da atividade do promotor, do gene e do peso do mouse.
- Diluir o vetor AAV em 150 alíquotas μL contendo 1,0 x 1011 genomas virais, usando soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) e mantê-lo no gelo. Os equipamentos de proteção individual devem ser usados para manusear o AAV.
NOTA: O ciclo repetido de congelamento e degelo diminui o titulação do vírus e deve ser evitado. A solução viral de estoque deve ser armazenada em um congelador de -80 °C. - Ligue uma caixa de calor (câmara de aquecimento animal) para pré-aquecer a 35 °C.
- Segure um mouse e aplique um creme de anestesia tópico em toda a extensão da cauda pelo menos 15 minutos antes da injeção da veia da cauda.
NOTA: Esta é uma etapa opcional e pode não ser necessária se não for exigida pelo comitê de ética animal do instituto. Siga o protocolo aprovado pelo comitê local de ética animal. Neste experimento25, um rato Rosa26-Cas9 foi usado para injeção de AAV e subsequente injeção de veia portal de organoides CRC. Dado que os tumoróides utilizados neste estudo foram derivados de um camundongo Rosa26-Cas9 (fundo genético C57BL/6 x 129), esta cepa de camundongos também foi utilizada como imunocompetente, receptores síngênicos do transplante tumoral. Foram utilizados camundongos Rosa26-Cas9 masculinos e femininos (de 6 a 24 semanas de idade). - Coloque o mouse na caixa de calor. Deixe o mouse por até 15 minutos para aquecer e dilatar as veias da cauda.
- Segure suavemente o mouse em um cabisto de roedores. Coloque a cauda sob uma lâmpada de calor para garantir a dilatação total das veias da cauda.
- Desenhe 150 μL de AAV diluído (preparado na etapa 1.1) em uma seringa estéril de espaço baixo com uma agulha de 27-30 G.
- Mova a lâmpada de calor e identifique a veia traseira lateral localizada nas laterais da cauda. Coloque uma leve tensão na cauda com os dedos para que a cauda fique reta.
- Insira lentamente 2-3 mm da agulha, bisbida para cima, na veia. A agulha deve ser quase paralela à cauda (até 15° da cauda).
NOTA: O fluxo sanguíneo na seringa pode ser observado se a agulha estiver localizada com sucesso na veia. - Injete lentamente. Se for observada uma resistência ou o inchaço da pele, remova a agulha e reinsira acima do primeiro local ou da outra veia lateral.
- Aguarde cerca de 5 s após a conclusão da injeção e, em seguida, remova lentamente a agulha. Aplique imediatamente pressão suave no local da injeção com uma gaze limpa ou papel toalha até que o sangramento pare.
- Solte suavemente o mouse em sua gaiola. Monitore o animal para garantir que o sangramento tenha parado.
NOTA: A superexpressão genética no fígado pode ser avaliada de 1 a 2 semanas após a injeção da veia da cauda AAV. Isso pode ser confirmado, por exemplo, por RNA in situ hibridização (ISH), imunohistoquímica (IHC), mancha ocidental ou reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR; Figura 1A,B). Em um estudo publicado anteriormente25, a AAV8-Islr foi usada para sobreexpressar o gene islr do rato em hepatócitos e a superexpressão foi detectada pelo RNA ISH (Figura 1A,B).
2. Preparação celular para organoides de câncer colorretal
NOTA: Os organoides crc utilizados para este experimento contêm apenas células epiteliais. A cultura e geração de organoides de CRC foi descrita anteriormente25,35. Em suma, as células epiteliais coloniais normais foram isoladas do cólon de um rato Rosa26-Cas9 usando um tampão de isolamento cripto (5 mM EDTA (ethylenodiaminetetraacetatato) em PBS gelado), e então incorporada na matriz média da membrana do porão, e cultivada em meio de crescimento organoide, conforme descrito na referência35. Em seguida, mutações Apc e Trp53 foram introduzidas nas células epiteliais coloniais, superexpressando RNAs de guia único que visam Apc e Trp53 usando protocolo de expressão de lentivírus. Os clones organoides foram escolhidos a dedo25. UmpcΔ/Δe Trp53Δ/Δ tumoróides de câncer de cólon (tumoróides AP), foram injetados como 5,0 x 105 células únicas em 100 μL de PBS com 10 μM Y-27632 na veia portal por rato, com cultura organoide e preparação unicelular descrita abaixo.
- Cultura os organoides CRC na matriz de membrana do porão cúpulas médias em uma placa de 24 poços ou 10 cm prato 3-5 dias antes da injeção de veia portal para obter organoides de 50-400 μm de diâmetro.
- Prepare quantidade suficiente de solução de descolamento celular adicionando concentração de Y-27632 a 10 μM, o suficiente para digerir o número de organoides que estão sendo cultivados para a injeção. Pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
NOTA: A solução de descolamento celular utilizada neste protocolo é uma mistura de enzimas de dissociação celular recombinante e é usada como um substituto para a trippsina na cultura organoide (ver Tabela de Materiais). Reduz os danos celulares causados pela dissociação celular em comparação com a trippsina36. Y-27632 é um inibidor de Rho quinase e inibe a morte celular induzida pela dissociação, aumentando assim a sobrevivência decélulas únicas 37.- Para injeção em até cinco camundongos, prepare dois tubos contendo 40 mL da solução de descolamento celular para digerir 10-24 x 50 μL de cúpulas de matriz de membrana de porão com cada cúpula contendo aproximadamente 300 organoides (50-400 μm de diâmetro), ou seja, cada rato é injetado com 2-4,8 cúpulas de organoides (equivalente a cerca de 600-1440 organoides). O número de organoides necessários para obter número celular suficiente depende da linha organoide e, portanto, deve ser otimizado.
NOTA: O segundo tubo de 40 mL permite uma digestão repetida com solução de descolamento de células frescas para obter células únicas dissociadas.
- Para injeção em até cinco camundongos, prepare dois tubos contendo 40 mL da solução de descolamento celular para digerir 10-24 x 50 μL de cúpulas de matriz de membrana de porão com cada cúpula contendo aproximadamente 300 organoides (50-400 μm de diâmetro), ou seja, cada rato é injetado com 2-4,8 cúpulas de organoides (equivalente a cerca de 600-1440 organoides). O número de organoides necessários para obter número celular suficiente depende da linha organoide e, portanto, deve ser otimizado.
- Aspire cuidadosamente o meio organoide de cada poço.
- Adicione 1 mL de PBS gelado a cada poço em uma placa de 24 poços. Se um prato de 10 cm for usado, adicione 10 mL de PBS gelado ao prato.
- Risque o meio da matriz da membrana do porão usando uma ponta de pipeta P1000. Transfira o pbs/chorume médio para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Enxágüe cada poço com a mesma quantidade de PBS para coletar fragmentos da matriz da membrana do porão e adicionar ao tubo de 15 mL(s).
- Incubar por 5 minutos no gelo. Esta incubação ajuda a dissolver o meio da matriz da membrana do porão.
- Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernascido garantindo não perturbar o meio e as células pelleted.
- Adicione 5 mL de solução de descolamento de células pré-aquecidas preparada na etapa 2.2 à pelota, resuspenque a pelota 10 vezes e transfira-a de volta para um tubo de 50 mL contendo solução de descolamento celular fresca e pré-aquecida.
- Coloque o tubo no banho de água de 37 °C. Incubar por 5 minutos.
- Centrifugar o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C.
- Repetir as etapas 2.9-2.11.
NOTA: A digestão enzimática repetida permite a dissociação celular eficiente em células únicas. - Verifique se os organoides são dissociados em células únicas, pipetando 100 μL em uma placa de 96 poços e observando sob um microscópio. Se muitos organoides apresentarem aglomerados celulares constituídas por mais de quatro células, pode ser necessária uma maior incubação com a solução de descolamento celular e dissociação física por trituração com uma pipeta de 10 mL.
- Uma vez que a maioria das células são células únicas, adicione 4 mL de soro bovino fetal (FBS) na suspensão celular de 40 mL para parar a digestão. Enxágüe um coador de células de 40 μm com PBS de 5 mL.
- Passe a suspensão celular através do coador de células em um tubo de coleta de 50 mL para remover qualquer aglomerado de células.
- Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernatante. Adicione 10 mL de PBS frio à pelota celular e transfira-a para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernatante. Resuspenda a pelota em PBS frio de 500 μL com 10 μM Y-27632. Conte as células.
- Ajuste a concentração celular para 5,0 x 105 células únicas/100 μL, utilizando PBS com 10 μM Y-27632. Coloque o tubo no gelo até que a injeção venosa do portal seja realizada.
NOTA: Recomenda-se injetar células dissociadas dentro de 4h de dissociação.
3. Portal de injeção venosa de organoides CRC
NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos e gazes cirúrgicas devem ser autoclavados ou esterilizados antes da cirurgia. Este protocolo é modificado a partir de um protocolo anterior17. Neste experimento25, a injeção de veia portal foi realizada utilizando-se camundongos Rosa26-Cas9 tratados com AAV-mRuby2 ou AAV-Islr na etapa 1.
- Prepare uma área cirúrgica asséptica usando cortinas estéreis em uma almofada de aquecimento.
- Prepare instrumentos cirúrgicos (tesouras e fórceps), esponja cirúrgica e hemostática, sutura de poliglactina 4-0, botões de algodão, grampeadores de pele, aplicador de grampeador, soro fisiológico, buprenorfina e agulha de 33 G presa a uma seringa Hamilton. Corte a esponja hemostática em pedaços de 1,0 cm x 1,0 cm.
- Ajuste a posição da fonte de luz para iluminar a área cirúrgica.
- Injete 0,1 mg/kg de peso corporal de buprenorfina subcutânea em um rato para o tratamento cirúrgico da dor.
- Anestesiar o rato com isoflurano em uma câmara de anestesia. A concentração de isoflurane para indução e manutenção costuma ser de 5% e 2,5%, respectivamente. Verifique se há ausência de uma reação ao aperto do dedo antes de iniciar o próximo procedimento.
- Raspe o meio para o abdômen superior do mouse com uma máquina de barbear elétrica. A barba deve ser realizada em uma área distante da área cirúrgica asséptica para evitar que o cabelo contamine o local.
- Limpe o local de incisão alternando com Betadine e 80% de etanol para esterilizar a área cirúrgica. Repita três vezes.
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma posição supina com anestesia isoflurane de manutenção. Coloque uma cortina cirúrgica com um orifício sobre o abdômen do rato.
- Levante a pele abdominal com fórceps e faça uma incisão de pele de 2-3 cm na linha média com uma tesoura, cortando apenas a pele (não subjacente ao peritônio). A incisão deve variar do abdômen médio ao processo xiphoide do esterno. A incisão não deve ir acima da extremidade inferior do processo xiphoide.
- Levante totalmente a parede peritoneal com fórceps e faça uma incisão semelhante de 2-3 cm ao peritônio com uma tesoura. Evite cortar o intestino e o diafragma.
- Mergulhe a gaze cirúrgica com soro fisiológico quente e coloque-a no lado esquerdo da incisão (no lado esquerdo do corpo do camundongo; à direita do cirurgião).
- Puxe suavemente os órgãos internos (intestinos pequenos e grandes) usando um broto de algodão encharcado com soro fisiológico. Coloque os intestinos sobre a gaze encharcada com soro fisiológico.
NOTA: Os intestinos do lado esquerdo do camundongo (ou seja, intestinos à direita do cirurgião) devem ser retirados primeiro, e então os intestinos do lado direito do rato (ou seja, intestinos à esquerda do cirurgião) podem ser retirados. - Ajuste a posição dos intestinos para visualizar a veia do portal. Cubra os intestinos com gaze molhada adicional para manter os intestinos úmidos.
- Puxe suavemente o intestino para o lado esquerdo com a gaze molhada e aplique uma tensão suave à esquerda. Isso facilita a visualização da veia portal (Figura 2A).
NOTA: Se a visualização da veia do portal for difícil, ajustar suavemente a posição do estômago com um broto de algodão molhado pode ajudar na visualização. - Suspensão tumoróide de pipeta suavemente várias vezes para obter uma suspensão celular homogênea. Desenhe lentamente 100 μL da suspensão da célula em uma seringa Hamilton presa a uma agulha de 33 G. Evite bolhas de ar.
- Insira lentamente a agulha, bisbisse para cima, na veia portal. A profundidade de inserção ao longo da agulha deve ser de 3-4 mm, com o ângulo da agulha quase paralelo à veia portal.
NOTA: A injeção deve ser realizada na parte bem visualizada da veia portal (geralmente até 2 cm de distância do hilum hepático). Evite o movimento da agulha depois de totalmente inserida na veia portal. - Injete células tumorais por 30 anos. A injeção deve ser realizada lentamente para evitar a oclusão da veia portal. Se a injeção for bem sucedida, a cor do fígado muda temporariamente de vermelho para branco.
- Remova a agulha lentamente. Aplique imediatamente pressão suave no local da injeção com um broto de algodão seco e espere por 5 min.
- Retire o broto de algodão e aplique simultaneamente uma esponja hemostática no local da injeção. Segure a esponja hemostática com um broto de algodão ou fórceps e aplique pressão suave por mais 5 minutos.
- Remova a pressão para a esponja hemostática e confirme que não há sangramento do local da injeção.
NOTA: A esponja hemostática bio absorvível não precisa ser removida. Tentar remover a gaze pode causar hemorragia do local da injeção. - Se ocorrer sangramento, realize imediatamente hemostase de pressão com um broto de algodão por cerca de 10 minutos. Em seguida, aplique uma esponja hemostática adicional por mais 5 minutos.
NOTA: Se observar a perda de sangue incontrolável, o camundongo deve ser eutanizado de acordo com o protocolo aprovado pelo comitê de ética animal do instituto. - Remova as gazes cirúrgicas nos intestinos. Usando uma seringa cheia de soro fisiológico de 5 mL, esguiche soro fisiológico nos intestinos para evitar a adesão dos órgãos.
NOTA: Não aplique soro fisiológico no site de injeção de veias do portal. Isso pode causar hemorragia. - Coloque suavemente os intestinos de volta dentro da cavidade abdominal.
- Sutura o peritônio usando suturas de poliglactina 4-0.
- Levante os dois lados da pele com fórceps. Aplique grampos de pele para fechar a incisão da pele. Tenha cuidado para não grampear o intestino.
- Desligue o isoflurane, mas mantenha o fluxo de oxigênio funcionando. Monitore cuidadosamente o mouse. Quando o mouse acordar, coloque o mouse em uma gaiola vazia em uma almofada de aquecimento. O rato normalmente acorda dentro de 5 minutos.
- Monitore cuidadosamente o mouse até que ele esteja consciente e ambulando normalmente.
- Injete subcutâneamente 0,1 mg/kg de buprenorfina no camundongo 4h após a cirurgia.
- Injete 0,1 mg/kg de buprenorfina no mouse a cada 24 horas durante os 2 dias seguintes.
- Monitore cuidadosamente os ratos diariamente durante uma semana após a cirurgia. Verifique suturas e cicatrização de feridas.
- dias após a cirurgia, remova os grampeadores da pele usando um removedor de grampeador.
4. Avaliação da cinética de crescimento tumoral por imagem bioluminescente in vivo
NOTA: Se os tumoróides que expressam firefly forem usados para injeção, a progressão do tumor metastático pode ser monitorada semanalmente por imagens in vivo, conforme descrito38,39. A luciferase expressa por células cancerosas poderia provocar respostas imunes contra as células cancerosas e limitar o crescimento do tumor40. Assim, a cautela é justificada na análise de fenótipos imunológicos e progressão do câncer em um modelo de camundongo usando células tumorais que expressam a luciferase.
- Prepare uma solução de 30 mg/mL de D-luciferin utilizando PBS estéril. Proteja-o da luz. A d-luciferina deve ser armazenada em alíquotas a -20 °C até o uso.
- Raspe o abdômen e o tórax com uma máquina de barbear eletrônica. Isso pode ser feito até 1 dia antes da imagem in vivo .
- Injete 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferin intraperitoneal em camundongos (ou seja, se o peso corporal do rato for de 30 g, injete 150 μL da solução D-luciferina).
- Coloque os ratos em uma câmara de anestesia e anestesia-os. Use 5% de isoflurane para indução e 2%-3% para manutenção.
- min depois, coloque os ratos em uma posição lateral (lado direito para cima). Adquira imagens de bioluminescência usando um sistema de imagem in vivo (IVIS) conforme descrito anteriormente38,39.
NOTA: Os ratos são mais estáveis em uma posição lateral em comparação com a posição supina. Portanto, uma posição lateral é preferível para obter uma imagem de luminescência de um plano focal consistente. - Coloque os ratos em uma gaiola vazia e monitore sua recuperação.
- Defina regiões de interesse no abdômen superior usando o Living Image Software como descrito38. Quantifique o fluxo total como substituto para o número de células tumorais.
5. Análise de sobrevivência e coleta de tecidos
- Monitore os camundongos cuidadosamente para sintomas clínicos de metástases, como um abdômen distendido.
- Eutanize um rato por inalação de CO2 quando atingir pontos finais humanos.
NOTA: Utilize um ponto final de estudo aprovado pelo comitê de ética animal do instituto. Para determinar um ponto final humano, foi utilizada uma ficha de registro clínico; os escores foram calculados por um ponto para a presença de cada uma das seguintes observações: perda de peso > 15%, postura curvada, casaco de babados, desidratação, diminuição do movimento, abdômen distendido ou careta facial. Uma vez que uma pontuação de 3 foi alcançada, os ratos foram humanamente eutanizados. - Imediatamente após a eutanásia, realize a fixação da perfusão transcárdia com 30-50 mL de 10% de formalina em um capô de fumaça, como descrito41. Faça várias pequenas incisões (até 1 cm cada) com tesoura na parte normal do fígado antes da perfusão para gerar saídas para sangue e formalina. Após a perfusão, a cor do fígado mudará de vermelho para marrom.
NOTA: Se micrometastases em áreas hepáticas macroscopicamente normais são objeto de estudo, recomendamos aos pesquisadores que não cortem o fígado, mas cortem a cava vena superior. No entanto, quando usamos este método, a fixação do fígado parece mais pobre quando comparada com o corte do fígado. Especialmente se o RNA in situ hibridização (ISH) for planejado para ser realizado em seções hepáticas, recomendamos fazer incisões no fígado antes da injeção intra-cardíaca de formalina, como descrito acima. Isso permite fixação suficiente do tecido hepático, resultando na preservação da integridade do RNA para ISH. - Coloque os tecidos hepáticos e pulmonares em 10% de formalina e fixe durante a noite. Substitua a formalina por 70% de etanol, seguida de incorporação de parafina.
- Realizar a coloração de hematoxilina e eosina para avaliar histologicamente a área do tumor. Realize a imunohistoquímica para marcadores estromatrais de interesse. Realize a coloração picro-sirus vermelha para avaliar áreas positivas de colágeno.
NOTA: O software ImageJ42 pode ser usado para quantificar os dados de coloração da imunohistoquímica e do Picro-Sirius Res. Uma função de desconvolução de cores e a ferramenta de fibrose de ressonância magnética podem ser usadas para avaliar áreas positivas de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) e áreas vermelho-positivas picro-sirius, respectivamente.
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Representative Results
Para induzir a superexpressão mediada pelo AAV de um gene escroto de contenção de tumores, Islr 4,25,43,44, em hepatócitos, injetamos intravenosamente AAV8 codificadora de Islr. 1.0 x 1011 genomas virais (vg) de AAV8-Islr, ou como controle, AAV8-mRuby2, foi injetado na veia da cauda do rato adulto (Figura 1A). Duas semanas após a injeção da veia da cauda, fígados foram colhidos para validar a superexpressão de Islr em hepatócitos. Realizamos o RNAscope in situ hibridização 45 e confirmamos que 3,3'-Diaminobenzidina (DAB)+ foram observados em todo o fígado (Figura 1B). Nenhum sinal DAB+ foi detectado no fígado de um rato tratado com AAV8-mRuby2.
Praticamos o procedimento de injeção de veia portal injetando tinta índia (diluição de 1:1000 na PBS). Após fazer uma incisão no abdômen superior, os intestinos foram suavemente retirados do espaço abdominal para permitir a visualização da veia portal (Figura 2A). A injeção de veia portal de tinta da Índia entregou a tinta em todo o fígado, mas não para o pulmão (Figura 2B). Se a tinta for equivocadamente injetada em outros vasos, como a veia cava inferior (IVC) ou a aorta abdominal, a circulação sistêmica da tinta altera a cor pulmonar para preto. A tinta da Índia também ajuda a identificar a quantidade de vazamento da veia do portal, o que indica a disseminação pancreática ou peritoneal.
Duas semanas após a injeção da veia da cauda de AAV-mRuby2, ApcΔ/Δ e Trp53Δ/Δ Δ (tumoróides de câncer de cólon) foram dissociados em células únicas e injetados na veia portal do rato (Figura 3A). Para confirmar o crescimento do tumor metastático e avaliar a histologia, coletamos os fígados 3-4 semanas após a injeção venosa portal (ou seja, em um ponto cronometrado em vez de um ponto final humano), antes que a necrose proeminente confundisse as análises histopatológicas. Macroscopicamente, a injeção venosa portal de tumoróides resultou em múltiplos nódulos tumorais brancos no fígado (Figura 3B). Descobrimos que a injeção intra-esplênica do mesmo número celular de tumoróides não gerou uma grande massa tumoral metastática. Isso sugere que a abordagem da injeção de veia portal induz mais eficientemente as metástases hepáticas em comparação com o modelo de injeção intra-esplênica. A hematoxilina e a coloração de eosina das metástases hepáticas do CRC induzidas pela injeção de veia portal demonstraram histopatologia de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado acompanhado de uma reação estromal desmoplástica e necrose (Figura 3C). Esta histologia rica em estroma recapitulava fielmente a das metástases hepáticas crc humanas (Figura 3C), tornando este modelo adequado para pesquisas translacionais investigando o estromoma tumoral metastático. Além disso, a imunohistoquímica para actina muscular alfa-lisa (αSMA), um marcador bem estabelecido para CAFs, mostrou que cerca de 7% das áreas tumorais eram αSMA-positivas, confirmando a presença de CAFs neste modelo de camundongos (Figura 3D,E). A coloração vermelha picro-sirius que mancha o colágeno46 demonstrou ECM abundante no mesenquime tumoral com aproximadamente 13% das áreas tumorais positivas para colágeno (Figura 3D,E). A imunohistoquímica do EPCAM, um marcador de linhagem epitelial, revelou que o CRC metastático mostrou brotamento tumoral (uma única célula tumoral ou um aglomerado celular de até quatro células tumorais) que é uma característica do fraco prognóstico câncer colorretal47 (Figura 3F). O índice de rotulagem ki67 no CRC metastático foi de aproximadamente 80%, indicando que a maioria das células tumorais são mitoticamente ativas (Figura 3G,H).
Realizamos análises cinéticas de sobrevivência de camundongos e crescimento tumoral neste modelo pré-clínico. Os camundongos em nossa primeira coorte piloto mostraram uma sobrevida mediana de 57 dias após a injeção tumoróide na veia portal (N = 4 camundongos; Figura 4A). Isso foi mais tarde replicado em maior controle AAV8-mRuby2-injetou grupos25. No ponto final humane (como mostrado em NOTA, passo 5.2), 3 em cada 4 camundongos do grupo piloto demonstraram ascites, o que também é observado em pacientes com metástase hepática avançada48. Para avaliar o crescimento do tumor, foi utilizado o sistema de imagem in vivo (IVIS) para medir a luminescência derivada do tumoride (Figura 4B,C). Os sinais de bioluminescência foram observados dentro do abdômen superior, sugerindo crescimento tumoral específico do fígado (Figura 4B). Se os sinais IVIS forem observados no abdômen inferior, isso indica disseminação peritoneal ou metástases secundárias aos órgãos abdominais. A imagem semanal in vivo permitiu uma avaliação longitudinal do crescimento tumoral em cada camundongo (Figura 4C), facilitando o monitoramento de um efeito terapêutico em nosso estudo maior subsequente. A taxa de tomar tumor foi de 100% (4/4 camundongos) conforme avaliado pelos sinais do IVIS. Neste experimento, não foi observada metástase pulmonar macroscopicamente aparente no momento da coleta de tecidos (0/4 camundongos).
Finalmente, investigamos se a entrega de hepatocitado mediado pelo AAV de um gene CAF que restringe o câncer, Islr 4,25, poderia inibir o crescimento da metástase hepática do CRC neste modelo de camundongo pré-clínico. Notavelmente, os camundongos tratados com AAV8-Islr apresentaram melhor sobrevivência do camundongo e diminuíram os sinais IVIS de tumores (Figura 5A-C)25. A imunohistoquímica para fosforylated Smad1/5/8 demonstrou que a superexpressão de hepatocite de ISLR, um potencializador de sinalização BMP, sinalização aumentada de BMP em tumores metastáticos (Figura 5D). O tratamento com AAV8-Islr diminuiu o número de células proliferadoras de Ki67+ na metástase hepática do CRC (Figura 5E). Para a descrição completa dos resultados, consulte Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Nossos dados coletivos indicam que a entrega mediada pelo AAV8 de um gene inibidor de tumores para hepatócitos, um componente vital do estroma29 do tumor metastático hepático, pode ser uma abordagem preventiva/terapêutica eficaz para metástases hepáticas crc (Figura 5F).
Figura 1: Aav8-Islr administrada por veias traseiras gera superexpressão islr no fígado. (A) Esquema experimental mostrando a injeção da veia da cauda de AAV8, seguido pela injeção venosa portal de organoides de câncer colorretal (CRC). ISH, na hibridização in situ; IHC, imunohistoquímica; qRT-PCR, reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real. (B) Fotos representativas. A hibridização do RNA in situ para Islr foi realizada utilizando fígados de camundongos tratados aAV8-Islr ou AAV8-mRuby2. Os fígados foram coletados duas semanas após a injeção da veia da cauda. Barras de escala, 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A injeção de veia portal da tinta da Índia resulta em sua entrega ao fígado, mas não no pulmão. (A) Fotos representativas mostrando anatomia do abdômen superior após laparotomia. Note que, para visualização da veia portal, os intestinos são tomados fora da cavidade abdominal. A imagem do lado direito mostra uma anotação anatômica de cada órgão e vaso. A seta amarela denota o local da injeção. IVC, veia cava inferior. (B) Fotos representativas do fígado e pulmão após a injeção de veia portal de tinta índia. As pontas das flechas amarelas indicam navios manchados com a tinta da Índia. Barras de escala, 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A injeção venosa portal de organoides de câncer colorretal gera metástases hepáticas ricas em estroma. (A) Esquema experimental mostrando injeção de veia portal de ApcΔ/Δ e Trp53Δ/Δ organoides de câncer de cólon (tumoróides AP). Barra de escala, 200 μm. T, tumoróides. (B) Fotos macroscópicas representativas dos fígados coletados 3-4 semanas após injeção de veia portal (esquerda) ou injeção intra-esplênica (direita). 5,0 x 105 células únicas de tumoróides AP foram injetadas na veia do portal ou baço. A injeção intra-esplênica foi realizada conforme descrito13. Nódulos brancos indicam tumores. T, Tumor; N, fígado normal. (C) Fotos de coloração representativa de hematoxilina e eosina (H&E) das metástases hepáticas do crc do modelo de rato de injeção de veia portal (esquerda e média) e humana (direita). T, Tumor; N, fígado normal; S, Stroma; Nec, Necrose. A linha pontilhada amarela indica uma borda entre o tumor e o fígado normal (esquerda). (D e E) Imunohistoquímica (IHC) para actina muscular alfa-lisa (αSMA; esquerda) e picro-sirius manchas vermelhas (direita). (D) Fotos representativas. (E) Quantificação das áreas αSMA-positivas (esquerda) e Picro-Sirius áreas vermelho-positivas (direita). N = 4 ratos, 5 HPFs (Campos de Alta Potência; 400x)/mouse. (F) Imagem representativa mostrando a imunohistoquímica para ePCAM, um marcador de célula epitelial. As linhas pontilhadas verdes denotam o tumor brotando. (G e H) Imunohistoquímica para Ki67, um marcador de proliferação celular. (G) Foto representativa. (H) Percentual de células Ki67+ em células epiteliais totais. As células epiteliais foram visualizadas pela contra-mancha de hematoxilina. N = 4 ratos, 5 HPFs/mouse. Em (B)-(H), todos os tecidos hepáticos de camundongos foram coletados 3-4 semanas após a injeção de tumoróides AP. Mean ± S.E.M. Cada ponto representa um valor médio de 5 HPFs de um mouse (E e H). As barras de escala representam 1 cm (B), 1 mm (C; esquerda), 100 μm (C; médio e direito) e 50 μm (D, F e G). Note-se que o estudo com tecidos humanos foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Nagoya (2017-0127). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de sobrevivência e análise cinética de crescimento do tumor por imagem in vivo . (A) Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier. N = 4 ratos. (B,C) O Sistema de Imagem In vivo (IVIS) foi utilizado para avaliar a cinética de crescimento do tumor. (B) Uma foto representativa. A área na caixa vermelha foi usada para quantificação. (C) Cinética de crescimento. Sinais de luciferase de cada rato são mostrados. N = 4 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A entrega de genes mediados por AAV8 de Islr para hepatócitos aumenta a sinalização de BMP, reduz a proliferação de tumores e melhora a sobrevivência do camundongo em um modelo de injeção de veia portal de metástase hepática CRC. (A) Curva de sobrevivência De Kaplan-Meier. Duas semanas após a injeção da veia da cauda de AAV-Islr ou AAV-mRuby2, foi realizada injeção de veia portal de tumoróides CRC. (B e C) Os sinais de luciferase derivados de tumoroid foram avaliados por meio do IVIS. (B) Foto representativa. (C) Quantificação dos sinais IVIS. N = 5 (AAV-mRuby2) e 8 (AAV-Islr) ratos. Fotos de representantes da ± S.E.M. (D). Imunohistoquímica (IHC) para Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 é uma molécula a jusante de sinalização de proteína morfogenética óssea (BMP) que é fosfoilada após a ativação de sinalização BMP49. N = 4 ratos cada. (E) Fotos representativas. Imunohistoquímica para Ki67. N = 4 ratos cada. (F) Resumo gráfico. A entrega de genes de hepatócitos mediados pelo AAV de um gene estromal que restringe o câncer pode servir como uma estratégia terapêutica para inibir a metastagenese do CRC. A superexpressão mediada por AAV8 de Islr em hepatócitos remodelou o nicho metastático aumentando a sinalização de BMP e limitando a progressão da metástase CRC. Para obter informações detalhadas, consulte Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Teste de classificação de log (A) e ANOVA de duas formas repetidas (análise de variância) com o teste de comparação múltipla de Sidak pós-hoc na Semana 3 (C). Barras de escala, 50 μm. Figura 5A-C foi reimpressa da Gastroenterologia, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediado por GREM1 e ISLR Drives Colorretal Carcinogenesis, Páginas 1224-1239.e30, Copyright (2021), com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, mostramos que a injeção de veia portal de organoides de CRC do camundongo gera reproduzivelmente metástases hepáticas ricas em fibroblastos que imitam características histológicas de metástases hepáticas crc humanas. Além disso, quando combinado com terapêuticas dirigidas ao estroma, como a terapia genética mediada pelo AAV8, este modelo pré-clínico serve como uma ferramenta útil para avaliar os efeitos terapêuticos sobre a sobrevivência do camundongo e o crescimento do tumor.
Há, pelo menos, dois passos críticos no protocolo. Em primeiro lugar, é importante preparar uma suspensão unicelular de tumoróides, experimentando totalmente os organoides e usando um filtro de malha para remover aglomerados celulares. A dissociação incompleta dos tumoróides resulta em grandes agregações celulares, que podem ocluir a veia portal. Isso causa infarto do fígado e morte animal22. Em segundo lugar, durante a injeção de veia portal, é imprescindível minimizar o sangramento da veia portal. A agulha deve ser devidamente inserida na veia do portal. Para evitar perfurar o outro lado da veia portal, o ângulo da agulha inserida deve ser mantido quase paralelo à veia do portal. Para evitar o rasgo da veia portal durante a injeção, a agulha não deve ser movida uma vez que esteja totalmente inserida na veia portal. Imediatamente após a remoção da agulha da veia portal, é vital aplicar pressão no local da injeção com um broto de algodão por pelo menos 5 minutos.
O número celular para injeção precisa ser modificado de acordo com o camundongo receptor (por exemplo, imunocompetente vs. camundongo imunodeficente) e tumorigenicidade da linha organoide. Em nossos experimentos, a injeção de 5,0 x 105 células únicas em suspensão de 100 μL foi suficiente para gerar metástases hepáticas em camundongos imunocompetentes. O aumento do número celular poderia aumentar o risco de embolia na veia portal e morte de animais14, devendo ser cuidadosamente considerado. Dado que os trabalhos anteriores usavam 5 x 104 a 5 x 105 células em 100 μL para injeção de tumoróide no portal ou veia mesentrica 25,26,27,28, consideramos que essa faixa de número celular seria um bom ponto de partida para otimização.
Uma limitação da abordagem de injeção de veia portal é que ela não recapitula totalmente toda a cascata de metastagenese crc. A metástase hepática do câncer requer cinco passos principais: (1) invasão de células cancerígenas no local primário, (2) intravasação no vaso, (3) sobrevivência celular na circulação do portal, (4) extravasação da veia portal para o parênquim hepático, e (5) colonização no nicho metastático50. O modelo de injeção de veia portal só permite a investigação das etapas (3)-(5). Para obter insights sobre os outros processos metastáticos, é necessário utilizar outros modelos, como modelos in vitro e/ou um modelo de mouse CRC primário de Notch1 que frequentemente metástase para o fígado51.
A significância do método de injeção de veia portal em relação aos métodos existentes inclui crescimento específico do fígado e maior carga tumoral. A disseminação peritoneal em outros modelos de injeção e o crescimento do tumor primário em modelos primários de CRC podem confundir a análise da progressão da metástase hepática. Em contraste, nossa abordagem venosa portal gera rapidamente tumores específicos do fígado, simplificando as análises de sobrevivência e crescimento tumoral.
Uma grande vantagem do transplante organoide sobre a injeção de linha celular é que a injeção de linha venosa portal de tumoróides gerou o microambiente tumoral rico em fibroblasto que fenócópia uma característica desmoplástica do CRC metastático humano. As condições de cultura organoide recapitulam características do microambiente tumoral e suportam populações de células-tronco intestinais, incluindo a incorporação de células-tronco em um rico e complexo ECM 3D com uma combinação definida de fatores de crescimento24,52. Isso resulta na propagação de células tumorais de forma a preservar a paisagem genética do tumorde origem 52,53. Em contraste, a cultura 2D tradicional das linhas de células tumorais está associada à seleção clonal e alterações genômicas/transcriômicas aberrantes que não refletem fielmente características dos cânceresoriginais 54. Especulamos que as condições de cultura relativamente duras para a cultura 2D das linhas celulares cancerosas forçam as células a se adaptarem à falta de sinais de ECM/fator de crescimento que podem resultar em tumores pobres em estroma in vivo, já que as células não requerem mais sinais derivados de estroma para sobrevivência.
Combinando o modelo de injeção de veias do portal organoide com a terapia genética mediada pelo AAV8, descobrimos que a entrega de uma carga inibitória do câncer aos hepatócitos antes que a colonização de células cancerígenas no fígado pudesse modificar o nicho (pré-)metastático para inibir o crescimento da metástase CRC25. Encorajadoramente, estudos clínicos demonstraram que a transferência de genes in vivo mediada pela AAV para o fígado induz a expressão a longo prazo de um transgene e pode ser uma modalidade eficaz e segura para tratar doenças genéticas não neoplásicas 30,31,55. No futuro, aproveitar hepatócitos para prevenir metástases hepáticas através da abordagem AAV pode ter valor clínico potencial em pacientes com câncer com alto risco de metástases.
Em resumo, nosso artigo mostra que o transplante organoide de CRC através da veia portal gera metástases hepáticas ricas em fibroblastos, que podem ser exploradas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas voltadas para o estroma. Ao acoplar a injeção de veia portal com terapia direcionada ao estroma, como a entrega de genes mediada por AAV, pode-se identificar novos alvos estromamicas para conter a progressão da metástase do CRC.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (APP1156391 a D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 a D.L.W., APP1140236 para S.L.W., APP1099283 a D.L.W.,); O Cancer Council SA Beat Cancer Project em nome de seus doadores e do Governo do Estado da Austrália do Sul através do Departamento de Saúde (MCF0418 a S.L.W., D.L.W.); um Subsídio de Auxílio à Pesquisa Científica (B) (20H03467 a M.T.) encomendado pelo Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão; AMED-CREST (Agência do Japão de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, Pesquisa Central para Ciência e Tecnologia Evolução Evolução (19gm0810007h0104 e 19gm1210008s0101 a A.E.); o Projeto de Pesquisa e Evolução Terapêutica do Câncer (P-CREATE) da AMED (19cm0106332h0002 a A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (to H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (to H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (to H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (to K.G.).
Agradecemos ao Dr. Leszek Lisowski da Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Instituto de Pesquisa Médica Infantil (CMRI) (NSW, AUSTRÁLIA) pela produção de vetores AAV recombinantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
- Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
- Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
- Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
- Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
- Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
- Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
- Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
- Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
- Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
- McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
- Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
- Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
- Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
- Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
- de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
- Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
- Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
- George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
- Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
- Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
- Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
- Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
- Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
- Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
- Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).
