Summary
הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.
Abstract
גרורות בכבד של סרטן המעי הגס (CRC) הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב מרכזי במיקרו-סביבה של הגידול, ממלאים תפקיד מכריע בהתקדמות CRC גרורתית ומנבאים פרוגנוזה לקויה של המטופלים. עם זאת, חסרים מודלים משביעי רצון של עכברים כדי לחקור את ההצלבה בין תאים סרטניים גרורתיים לבין CAFs. כאן אנו מציגים שיטה לחקור כיצד התקדמות גרורות בכבד מווסתת על ידי הנישה הגרורתית וייתכן שניתן לרסן אותה על ידי טיפול מכוון סטרומה. הזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים CRC יצרה תגובה דסמופלסטית, אשר שחזרה בנאמנות את ההיסטולוגיה העשירה בפיברובלסטים של גרורות כבד CRC אנושיות. מודל זה היה ספציפי לרקמות עם עומס גידול גבוה יותר בכבד בהשוואה למודל הזרקה תוך-טחולית, מה שמפשט את ניתוחי ההישרדות של העכברים. על ידי הזרקת אורגנואידים של גידולים המבטאים לוציפראז, ניתן היה לנטר קינטיקה של גדילת הגידול על ידי הדמיית in vivo . יתר על כן, מודל פרה-קליני זה מספק פלטפורמה שימושית להערכת היעילות של טיפולים המכוונים למזנכים של הגידול. אנו מתארים שיטות לבחון אם העברה בתיווך נגיף הקשור לנגיף של גן סטרומלי מעכב גידול להפטוציטים יכולה לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול ולשפר את הישרדות העכברים. גישה זו מאפשרת פיתוח והערכה של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לעיכוב גרורות בכבד של CRC.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם העיקרי לתמותה מסרטן ברחבי העולם1. יותר ממחצית מחולי ה-CRC מפתחים גרורות בכבד המתרחשות באמצעות הפצת וריד הפורטל1. נכון לעכשיו, אין טיפולים יעילים שיכולים לרפא גרורות מתקדמות בכבד, ורוב החולים נכנעים למחלה גרורתית.
הנישה הגרורתית או המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת תפקיד מפתח בהשתקה ובצמיחה של תאי CRC מופצים2. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב בולט במיקרו-סביבה של הגידול, מקדמים או מרסנים את התקדמות הסרטן באמצעות הפרשת גורמי גדילה, שיפוץ המטריצה החוץ-תאית (ECM) וויסות נופי מערכת החיסון והאנגיוגנזה 3,4,5. CAFs גם מעניקים עמידות לכימותרפיה ולאימונותרפיות3. יתר על כן, CAFs מווסתים את ההתחלה וההתקדמות של גרורות בכבד CRC ומנבאים פרוגנוזה בחולים עם CRC 3,6,7,8. לפיכך, גורמים הקשורים ל- CAF יכולים להיות מנוצלים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לעיכוב גרורות בכבד CRC. עם זאת, היעדר מודלים משביעי רצון של עכברים לחקר סטרומה של הגידול הגרורתי היווה מכשול מרכזי לפיתוח טיפולים ממוקדי סטרומה.
נכון לעכשיו, מודלים של בעלי חיים לחקר גרורות בכבד CRC כוללים מודלים ראשוניים של CRC המפתחים באופן ספונטני גרורות בכבד ומודלים של השתלת תאים סרטניים לתוך הכבד. מודלים ראשוניים של עכברי CRC, כגון מודלים של עכברים מהונדסים גנטית והזרקה מעי גסה של תאים סרטניים, מראים רק לעתים רחוקות גרורות לכבד 9,10,11,12. יתר על כן, גם אם נצפתה גרורתה בכבד, מודלים אלה מראים חביון ארוך מהאינדוקציה של הגידול הראשוני ועד גרורות, ועלולים למות מנטל הגידול הראשוני12. כדי ליצור ביעילות גרורות בכבד CRC, תאי CRC בתרבית מושתלים בכבד באמצעות שלוש גישות הזרקה: הזרקה תוך-הטחולית, הזרקה תוך-פרנכימית ישירה לתוך הכבד והזרקת וריד פורטלי. תאים סרטניים שהוזרקו באופן תוך-ספלני התפשטו לווריד הטחול, לווריד הפורטלי, ובסופו של דבר לכבד13,14. עם זאת, הזריקה התוך-טחולית מניבה יחס נטילת גידול נמוך יותר בהשוואה למודלים אחרים של השתלה15,16. עם הזרקה תוך-טחולית, הסרה כירורגית של הטחול מבוצעת כדי למנוע צמיחת סרטן בטחול, מה שעלול לפגוע בהבשלת תאי מערכת החיסון17. יתר על כן, הזרקה תוך-טחולית יכולה גם לגרום לצמיחה לא מכוונת של הגידול בטחול ובחלל הבטן18, מה שמסבך את ניתוחי הגרורות בכבד. הזרקה תוך-פרנכימלית ישירה לתוך הכבד גורמת ביעילות לגרורות בכבד 16,19,20. עם זאת, גישה זו אינה משחזרת באופן מלא שלב ביולוגי של גרורות בכבד המתרחש באופן טבעי באמצעות הפצת ורידים בפורטל. באמצעות הזרקה ישירה לתוך הכבד, כניסה של תאים סרטניים לתוך לא פורטל, אבל מחזור הדם המערכתי יכול גם לגרום למספר גרורות ריאה גדולות16. למרות שרוב החולים עם גרורות בכבד CRC מראים מספר גושים של גידולים בכבד21, הזרקה ישירה לאונת כבד ספציפית מייצרת מסת גידול אחת19,20. הזרקת וריד פורטלי או הזרקת ורידים מזנטריים, למרות שהיא מאתגרת מבחינה טכנית, מאפשרת העברה יעילה של תאי גידול לתוך הכבד באופן שמשחזר את דפוסי הגדילה שנראו בחולים17. אסטרטגיה זו יכולה למזער את האפשרות של גרורות באתר משני ומאפשרת צמיחה מהירה של תאים סרטניים בכבד, תוך פישוט ניתוחי הישרדות של עכברים.
מבחינה היסטורית, קווי תאים של סרטן המעי הגס כגון עכבר MC-38, HT-29 אנושי ו- SW-620 שימשו ליצירת מודלים של עכברים של גרורות בכבד22,23. עם זאת, קווי תאים אלה של סרטן המעי הגס אינם גורמים לתגובה סטרומלית דסמופלסטית. תכולה סטרומלית נמוכה בגידולים מקשה על חקר התפקידים הביולוגיים של פיברובלסטים הקשורים לסרטן. ההתקדמות האחרונה באורגנואידים של CRC ובהשתלתם הציעה פלטפורמות שימושיות להערכת תפקידים חיוניים של הסטרומה בהתקדמות הסרטן24. השתלת כבד של אורגנואידים CRC מייצרת מיקרו-סביבה של גידול עשיר בפיברובלסטים וסיפקה תובנות חדשניות על מחקר סטרומלי 6,25. נכון לעכשיו, הזרקת ורידים פורטלית או מזנטרית של אורגנואידים הפכה לגישה סטנדרטית זהב ליצירת גרורות בכבד CRC 6,25,26,27,28. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מאמר קודם לא תיאר שיטות מפורטות להזרקת ורידים פורטליים של גידולים במעי הגס. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לשימוש בהזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים מסוג CRC כדי לפתח טיפול חדשני בהכוונת סטרומה בתיווך נגיף אדנו (AAV).
הפטוציטים הם מרכיב חשוב של המיקרו-סביבה של הגידול הגרורתי בכבד וממלאים תפקיד קריטי בהתקדמות סרטן גרורתי29. בהשראת ההצלחה של גישות ריפוי גנטי AAV להשראת ביטוי חלבונים בהפטוציטים בחולים שאינם ניאופלסטיים30,31, חקרנו גישה דומה אך מכוונת לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד ב-CRC25. ככזה, אנו מתארים כאן גם את הזרקת וריד הזנב של AAV8 כדי לגרום לביטוי של חלבונים אנטי-סרטניים כדי לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד. הסרוטיפ AAV8, המיועד על ידי בחירה של חלבון קפסיד נגיפי במהלך ייצור הנגיף, מוביל ליעילות טרנסדוקציה גבוהה במיוחד של הפטוציטים (כלומר, ביטוי גנים ממוקד במיקרו-סביבה של גידולי הכבד)32. בעבר הראינו כי Islr (משפחת-על אימונוגלובולינים המכילה חזרה עשירה בלאוצין) הוא גן ספציפי ל-CAF המעורר איתות של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP), מפחית את צמיחת הגידולים של CRC ומקדם התמיינות תאי גזע במעיים Lgr5+ 25. בדקנו אם ביטוי יתר בתיווך AAV8 של הגן הסטרומלי מרסן הסרטן, Islr, בהפטוציטים יכול להחליש את התקדמות גרורות הכבד על ידי ביצוע הזרקת ורידים פורטליים של גידולי CRC בעכברים שטופלו ב-AAV8-Islr.
במאמר זה, אנו מתארים לראשונה את הליך הזרקת ורידי הזנב של AAV טרופי כבד. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה להכנת תאים סרטניים והזרקת ורידים פורטליים לעכברים שטופלו ב-AAV. לבסוף, אנו מציגים גישות לניטור התקדמות הגידול הגרורתי כדי להעריך את היעילות של טיפולים מכווני סטרומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים במאמר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים במכון הבריאות והמחקר הרפואי של דרום אוסטרליה (מספר אישור, SAM322).
1. הזרקת וריד זנב של וירוס הקשור לאדנו
הערה: יש לטפל בנגיף הקשור ל-Adeno (AAV) כביו-האזרד תחת הנחיות בטיחות ביולוגית ברמה 1. אנא עיין בפרוטוקול שפורסם להכנת AAV, טיהור וטיטרציה33. AAV הפטוציטים-טרופיים, AAV834, המקודדים את הגן מקדם ציטומגלווירוס (CMV) מקדם-Islr , שימש במחקר זה25. כדי לגרום לביטוי יתר בתיווך AAV, מינון AAV עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לפעילות המקדם, הגן ומשקל העכבר.
- דיללו וקטור AAV ל-150 μL aliquots המכילים 1.0 x 1011 גנומים נגיפיים, תוך שימוש במי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) והשארתו על קרח. יש ללבוש ציוד מגן אישי כדי להתמודד עם ה- AAV.
הערה: מחזור ההקפאה וההפשרה החוזרים ונשנים מקטין את הטיטר של הנגיף ויש להימנע ממנו. הפתרון הוויראלי המלאי צריך להיות מאוחסן במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. - הפעילו תיבת חום (תא לחימום בעלי חיים) כדי לחמם מראש ל-35 מעלות צלזיוס.
- החזיקו עכבר והניחו קרם הרדמה מקומי לכל אורך הזנב לפחות 15 דקות לפני הזרקת וריד הזנב.
הערה: זהו צעד אופציונלי וייתכן שלא יהיה בו צורך אם הוא אינו נדרש על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של המכון. פעל בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים. בניסוי זה25, עכבר Rosa26-Cas9 שימש להזרקת AAV והזרקת וריד פורטלי לאחר מכן של אורגנואידים CRC. בהתחשב בכך שהגידולים ששימשו במחקר זה נגזרו מעכבר Rosa26-Cas9 (רקע גנטי C57BL/6 x 129), זן עכבר זה שימש גם כמושתלים חיסוניים וסינגניים של השתלת הגידול. נעשה שימוש בעכברי רוזה26-Cas9 זכרים ונקבות (בני 6 עד 24 שבועות). - מכניסים את העכבר לתוך תיבת החום. השאירו את העכבר עד 15 דקות כדי לחמם ולהרחיב את ורידי הזנב.
- אבטח בעדינות את העכבר במעצור מכרסמים. הניחו את הזנב מתחת למנורת חום כדי להבטיח התרחבות מלאה של ורידי הזנב.
- ציירו 150 μL של AAV מדולל (מוכן בשלב 1.1) לתוך מזרק סטרילי בחלל נמוך עם מחט 27-30 G.
- הזיזו את מנורת החום וזהו את וריד הזנב הצדדי הממוקם בצידי הזנב. שים מתח קל על הזנב עם האצבעות, כך שהזנב הופך ישר.
- לאט לאט להכניס 2-3 מ"מ של המחט, להתפצל למעלה, לתוך הווריד. המחט צריכה להיות כמעט מקבילה לזנב (עד 15° מהזנב).
הערה: ניתן להבחין בזרימת דם למזרק אם המחט ממוקמת בהצלחה לתוך הווריד. - להזריק לאט. אם מורגשת התנגדות או נפיחות בעור נצפתה, הסר את המחט והכנס מחדש מעל האתר הראשון או לווריד הצדדי האחר.
- יש להמתין כ-5 שניות לאחר השלמת ההזרקה, ולאחר מכן להסיר באיטיות את המחט. מיד להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם גזה נקייה או מגבת נייר עד הדימום מפסיק.
- שחררו בעדינות את העכבר לתוך הכלוב שלו. עקוב אחר החיה כדי לוודא שהדימום נעצר.
הערה: ניתן להעריך ביטוי יתר של גנים בכבד 1 עד 2 שבועות לאחר הזרקת וריד זנב AAV. ניתן לאשר זאת, למשל, על ידי הכלאה של RNA in situ (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC), כתם מערבי, או תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR; איור 1א,ב). במחקר25 שפורסם בעבר, AAV8-Islr שימש לביטוי יתר של גן איסלר עכבר בהפטוציטים, וביטוי יתר זוהה על ידי RNA ISH (איור 1A,B).
2. הכנת תאים לאורגנואידים של סרטן המעי הגס
הערה: אורגנואידים של CRC המשמשים לניסוי זה מכילים אך ורק תאי אפיתל. תרבית ויצירת אורגנואידים של CRC תוארו בעבר25,35. בקיצור, תאי אפיתל קולוניאליים רגילים בודדו מהמעי הגס של עכבר Rosa26-Cas9 באמצעות חיץ בידוד קריפטה (5 mM EDTA (אתילנדיאמינטטראצטט) ב- PBS קר כקרח), ולאחר מכן הוטמעו במדיום מטריצת ממברנת מרתף, ותרביתם בתווך גדילה אורגנואידי כמתואר בהפניה35. לאחר מכן, מוטציות Apc ו-Trp53 הוכנסו לתאי האפיתל של המעי הגס על ידי ביטוי יתר של רנ"א חד-כיווניים המכוונים נגד Apc ו-Trp53 באמצעות פרוטוקול הביטוי lentivirus. שיבוטים אורגנואידים בודדים נבחרו בקפידה25. מחשבΔ/Δו- Trp53Δ/Δ אורגנואידים של סרטן המעי הגס (AP tumoroids), הוזרקו כ-5.0 x 105 תאים בודדים ב-100 μL של PBS עם 10 μM Y-27632 לתוך וריד הפורטל לכל עכבר, עם תרבית אורגנואידית והכנת תאים בודדים המתוארים להלן.
- תרבית האורגנואידים של CRC במטריצת ממברנת המרתף כיפות בינוניות בצלחת של 24 בארות או צלחת של 10 ס"מ 3-5 ימים לפני הזרקת הווריד הפורטלי כדי להשיג אורגנואידים בקוטר 50-400 מיקרומטר.
- הכינו כמות מספקת של תמיסת ניתוק תאים על ידי הוספת ריכוז Y-27632 לריכוז של 10 מיקרומטר, מספיק כדי לעכל את מספר האורגנואידים שעוברים תרבית לצורך ההזרקה. חמה מראש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: תמיסת ניתוק התאים המשמשת בפרוטוקול זה היא תערובת אנזים רקומביננטית של דיסוציאציה של תאים ומשמשת כתחליף לטריפסין בתרבית אורגנואידית (ראו טבלת חומרים). הוא מפחית את הנזק התאי הנגרם על ידי דיסוציאציה של תאים בהשוואה לטריפסין36. Y-27632 הוא מעכב רו קינאז ומעכב מוות של תאים הנגרמים על ידי דיסוציאציה, ובכך מגביר את ההישרדות של תאיםבודדים 37.- להזרקה לעד חמישה עכברים, הכינו שני צינורות המכילים 40 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים לעיכול 10-24 x 50 מיקרול' של כיפות מטריצת ממברנה במרתף כאשר כל כיפה מכילה כ-300 אורגנואידים (קוטר של 50-400 מיקרומטר), כלומר, כל עכבר מוזרק עם 2-4.8 כיפות של אורגנואידים (שווה ערך לכ-600-1440 אורגנואידים). מספר האורגנואידים הדרושים כדי להשיג מספר תא מספיק תלוי בקו האורגנואידים, ולכן יש לייעל אותו.
הערה: צינור 40 מ"ל השני מאפשר עיכול חוזר עם תמיסת ניתוק תאים טרייה כדי להשיג תאים בודדים מנותקים.
- להזרקה לעד חמישה עכברים, הכינו שני צינורות המכילים 40 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים לעיכול 10-24 x 50 מיקרול' של כיפות מטריצת ממברנה במרתף כאשר כל כיפה מכילה כ-300 אורגנואידים (קוטר של 50-400 מיקרומטר), כלומר, כל עכבר מוזרק עם 2-4.8 כיפות של אורגנואידים (שווה ערך לכ-600-1440 אורגנואידים). מספר האורגנואידים הדרושים כדי להשיג מספר תא מספיק תלוי בקו האורגנואידים, ולכן יש לייעל אותו.
- בזהירות לשאוף את המדיום האורגנואידי מכל באר.
- הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל באר בצלחת של 24 בארות. אם משתמשים במנה של 10 ס"מ, הוסיפו למנה 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
- לגרד את מדיום מטריצת קרום המרתף באמצעות קצה פיפטה P1000. העבר את ה-PBS/סלרי בינוני לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- יש לשטוף כל באר באותה כמות של PBS כדי לאסוף שברי מטריצת ממברנת מרתף ולהוסיף לצינור(ים) של 15 מ"ל.
- דגירה במשך 5 דקות על קרח. דגירה זו מסייעת להמיס את מדיום מטריצת קרום המרתף.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
- לשאוף את supernatant להבטיח לא להפריע את המדיום גלולה ואת התאים.
- הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש שהוכנה בשלב 2.2 לכדורית, החזירו את הכדור 10 פעמים והעבירו אותו בחזרה לצינור 50 מ"ל המכיל תמיסת ניתוק תאים טרייה ומחוממת מראש.
- הניחו את הצינור באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אינקובציה למשך 5 דקות
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (64 °F).
- חזור על שלבים 2.9-2.11.
הערה: עיכול אנזימטי חוזר ונשנה מאפשר דיסוציאציה יעילה של תאים לתאים בודדים. - בדוק אם האורגנואידים מנותקים לתאים בודדים על ידי צנרת 100 μL לתוך צלחת של 96 בארות ותצפית תחת מיקרוסקופ. אם אורגנואידים רבים מראים גושי תאים המורכבים מיותר מארבעה תאים, ייתכן שיהיה צורך בדגירה ארוכה יותר עם תמיסת ניתוק התאים ודיסוציאציה פיזית על ידי טריטורציה עם פיפטה של 10 מ"ל.
- ברגע שרוב התאים הם תאים בודדים, הוסיפו 4 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) לתרחיף התאים של 40 מ"ל כדי לעצור את העיכול. יש לשטוף מסננת של 40 מיקרומטר עם PBS של 5 מ"ל.
- מעבירים את תרחיף התא דרך מסננת התא לתוך צינור איסוף של 50 מ"ל כדי להסיר את כל גושי התאים.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
- לשאוף את הסופרנאטנט. הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר לכדור התא והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
- לשאוף את הסופרנאטנט. בצעו החייאה של הכדור ב-500 μL קר PBS עם 10 μM Y-27632. ספרו את התאים.
- התאם את ריכוז התא ל- 5.0 x 105 תאים בודדים / 100 μL, באמצעות PBS עם 10 μM Y-27632. מניחים את הצינור על קרח עד לביצוע הזרקת וריד הפורטל.
הערה: מומלץ להזריק תאים מנותקים תוך 4 שעות של דיסוציאציה.
3. הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים CRC
הערה: כל כלי הניתוח והגאוזים הכירורגיים חייבים להיות אוטוקלבים או מעוקרים לפני הניתוח. פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול קודם17. בניסוי זה25, הזרקת ורידים פורטליים בוצעה באמצעות עכברי Rosa26-Cas9 שטופלו ב-AAV-mRuby2 או AAV-Islr בשלב 1.
- הכינו אזור כירורגי אספטי באמצעות וילונות סטריליים על משטח חימום.
- הכינו כלי ניתוח (מספריים ומלקחיים), ספוג כירורגי והמוסטטי, תפר פוליגלקטין 4-0, ניצני כותנה, מהדקי עור, אפליקטור מהדק, מי מלח, בופרנורפין ומחט 33 גרם המחוברת למזרק המילטון. חותכים את הספוג ההמוסטי לחתיכות של 1.0 ס"מ על 1.0 ס"מ.
- התאם את מיקום מקור האור כדי להאיר את האזור הניתוחי.
- יש להזריק לעכבר משקל גוף של 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין תת עורית לצורך טיפול בכאב כירורגי.
- להרדים את העכבר עם איזופלורן בתא הרדמה. ריכוז איזופלורן לאינדוקציה ותחזוקה הם בדרך כלל 5% ו -2.5%, בהתאמה. בדוק את היעדר התגובה לצביטת הבוהן לפני תחילת ההליך הבא.
- לגלח את הבטן האמצעית עד העליונה של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הגילוח צריך להתבצע באזור מרוחק מהאזור הכירורגי האספטי כדי למנוע זיהום שיער באתר.
- נקו את אתר החתך לסירוגין עם בטאדין ו-80% אתנול כדי לעקר את האזור הכירורגי. חזרו על הפעולה שלוש פעמים.
- מניחים את העכבר על כרית חימום במצב שכיבה עם הרדמה איזופלורנית תחזוקה. מניחים וילון כירורגי עם חור מעל הבטן של העכבר.
- הרימו את עור הבטן עם מלקחיים ועשו חתך עור של 2-3 ס"מ בקו האמצע עם מספריים, חותכים את העור בלבד (לא את הצפק הבסיסי). החתך צריך לנוע מאמצע הבטן ועד לתהליך ה-xiphoid של עצם החזה. החתך לא צריך ללכת מעל הקצה התחתון של תהליך xiphoid.
- להרים באופן מלא את דופן הצפק עם מלקחיים ולעשות חתך דומה 2-3 ס"מ לצפק עם מספריים. הימנע חיתוך המעי ואת הסרעפת.
- משרים את הגזה הכירורגית במי מלח חמים ומניחים אותה בצד שמאל של החתך (בצד שמאל של גוף העכבר; לימינו של המנתח).
- משכו בעדינות את האיברים הפנימיים (המעי הדק והמעי הגס) החוצה באמצעות ניצן כותנה ספוג במי מלח. מניחים את המעיים על הגזה ספוגה במי מלח.
הערה: יש לשלוף תחילה את המעיים בצד שמאל של העכבר (כלומר, מעיים מימינו של המנתח), ולאחר מכן לשלוף את המעיים בצד ימין של העכבר (כלומר, מעיים משמאלו של המנתח). - התאם את מיקום המעיים כדי לדמיין את וריד הפורטל. מכסים את המעיים בגאזה רטובה נוספת כדי לשמור על לחות המעיים.
- משכו בעדינות את המעי לצד שמאל עם הגזה הרטובה והחלו מתח עדין על שמאל. זה מקל על הדמיה של וריד הפורטל (איור 2A).
הערה: אם ההדמיה של וריד הפורטל קשה, התאמה עדינה של מיקום הבטן עם ניצן כותנה רטוב עשויה לעזור להדמיה. - בעדינות פיפטה תרחיף סרטני מספר פעמים כדי לקבל תרחיף תא הומוגני. לאט לאט משכו 100 μL של מתלי התא לתוך מזרק המילטון המחובר למחט של 33 גרם. הימנעו מבועות אוויר.
- הכניסו באיטיות את המחט, התרחבו, לתוך וריד הפורטל. עומק ההחדרה לאורך המחט צריך להיות 3-4 מ"מ, כאשר זווית המחט כמעט מקבילה לווריד הפורטל.
הערה: יש לבצע את ההזרקה לחלק המדומיין היטב של וריד הפורטל (בדרך כלל עד 2 ס"מ הרחק מההילום הכבד). הימנע מתזוזה של המחט לאחר שהיא מוכנסת במלואה לווריד הפורטל. - להזריק תאי גידול במשך 30 שניות. ההזרקה צריכה להתבצע באיטיות כדי למנוע חסימה של וריד הפורטל. אם ההזרקה מוצלחת, צבע הכבד משתנה באופן זמני מאדום ללבן.
- הסר את המחט באיטיות. מיד להפעיל לחץ עדין על מקום ההזרקה עם ניצן כותנה יבשה ולהמתין 5 דקות.
- מוציאים את ניצן הכותנה ובמקביל מורחים ספוג המוסטטי על מקום ההזרקה. החזיקו ספוג המוסטטי עם ניצן כותנה או מלקחיים והפעילו לחץ עדין במשך 5 דקות נוספות.
- הסר את הלחץ לספוג המוסטטי ואשר כי אין דימום מאתר ההזרקה.
הערה: אין צורך להסיר את הספוג ההמוסטטי הנספג ביולוגית. ניסיון להסיר את הגזה עלול לגרום לדימום חוזר מאתר ההזרקה. - אם מתרחש דימום, מיד לבצע hemostasis בלחץ עם ניצן כותנה במשך כ 10 דקות. לאחר מכן, יש למרוח ספוג המוסטטי נוסף למשך 5 דקות נוספות.
הערה: אם נצפה אובדן דם בלתי נשלט, יש להרדים את העכבר על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון. - הסר את הגזוזים הכירורגיים על המעיים. באמצעות מזרק מלא 5 מ"ל מלוחים, להשפריץ מלח על המעיים כדי למנוע הידבקות איברים.
הערה: אין להחיל מלח על אתר הזרקת הוורידים בפורטל. זה עלול לגרום לדימום מחדש. - הניחו בעדינות את המעיים בחזרה בתוך חלל הבטן.
- לתפור את הצפק באמצעות 4-0 תפרים פוליגלקטין.
- להרים את שני צידי העור עם מלקחיים. יש למרוח מהדקי עור כדי לסגור את החתך בעור. היזהרו לא להדק את המעי.
- כבו את האיזופלורן אך המשיכו להפעיל את זרימת החמצן. נטר בזהירות את העכבר. כאשר העכבר מתעורר, הניחו את העכבר בכלוב ריק על משטח חימום. העכבר מתעורר בדרך כלל תוך 5 דקות.
- עקוב בקפידה אחר העכבר עד שהוא בהכרה ואמבולציה כרגיל.
- תת עורית להזריק 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לעכבר 4 שעות לאחר הניתוח.
- הזריקו 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לעכבר כל 24 שעות במשך היומיים הבאים.
- יש לעקוב בקפידה אחר העכברים מדי יום במשך שבוע לאחר הניתוח. בדוק תפרים וריפוי פצעים.
- ימים לאחר הניתוח, יש להסיר מהדקי עור באמצעות מסיר מהדק.
4. הערכת קינטיקה של גדילת גידולים על ידי הדמיה ביולומינסנטית in vivo
הערה: אם משתמשים בגידולים המבטאים Firefly להזרקה, ניתן לעקוב אחר התקדמות הגידול הגרורתי מדי שבוע על ידי הדמיית in vivo כמתואר38,39. לוציפראז המתבטא על ידי תאים סרטניים יכול לעורר תגובות חיסוניות נגד התאים הסרטניים ולהגביל את צמיחת הגידול40. לפיכך, נדרשת זהירות בניתוח פנוטיפים חיסוניים והתקדמות סרטן במודל עכברי באמצעות תאי גידול המבטאים לוציפראז.
- הכינו תמיסה של 30 מ"ג/מ"ל של D-לוציפרין באמצעות PBS סטרילי. הגן עליו מפני אור. יש לאחסן D-לוציפרין באליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- לגלח את הבטן ואת בית החזה עם מכונת גילוח אלקטרונית. ניתן לעשות זאת עד יום אחד לפני הדמיית in vivo .
- הזריקו לעכברים משקל גוף של 150 מ"ג/ק"ג של D-לוציפרין באופן תוך-צפקי (כלומר, אם משקל גוף העכבר הוא 30 גרם, הזריקו 150 μL של תמיסת D-לוציפרין).
- מניחים את העכברים בתא הרדמה ומרדים אותם. השתמש ב-5% מהאיזופלורן לאינדוקציה וב-2%-3% לתחזוקה.
- דקות מאוחר יותר, הניחו את העכברים במצב רוחבי (צד ימין למעלה). רכוש תמונות ביולומינסנציה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS) כפי שתואר קודם לכן38,39.
הערה: עכברים יציבים יותר במצב רוחבי בהשוואה לתנוחת השכיבה. לכן, מיקום רוחבי עדיף כדי לקבל תמונת זוהר ממישור מוקד עקבי. - הניחו את העכברים בכלוב ריק ועקבו אחר החלמתם.
- הגדר אזורי עניין בבטן העליונה באמצעות תוכנת Living Image כמתואר38. לכמת את השטף הכולל כפונדקאית למספר תאי הגידול.
5. ניתוח הישרדות ואיסוף רקמות
- עקוב בקפידה אחר עכברים לתסמינים קליניים של גרורות כגון בטן מעוותת.
- המתת עכבר על ידי שאיפת CO2 ברגע שהוא מגיע לנקודות קצה הומאניות.
הערה: השתמש בנקודת קצה של מחקר שאושרה על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים במכון. כדי לקבוע נקודת קצה הומאנית, נעשה שימוש בגיליון רשומה קלינית; הציונים חושבו על ידי נקודה אחת שניתנה לנוכחות של כל אחת מהתצפיות הבאות: ירידה במשקל > 15%, תנוחה מחובקת, פרווה פרועה, התייבשות, ירידה בתנועה, בטן מעוותת או צער פנים. ברגע שהגיעו לציון 3, העכברים הומתו באופן הומאני. - מיד לאחר המתת חסד, בצע קיבוע פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 30-50 מ"ל של 10% פורמלין במכסה אדים, כמתואר41. לעשות כמה חתכים קטנים (עד 1 ס"מ כל אחד) עם מספריים לתוך החלק הרגיל של הכבד לפני זלוף כדי ליצור שקעים עבור דם ופורמלין. עם הזלוף, צבע הכבד ישתנה מאדום לחום.
הערה: אם מיקרומטסטזות באזורי כבד מקרוסקופיים תקינים הן נושא למחקר, אנו ממליצים לחוקרים לא לחתוך את הכבד, אלא לחתוך את הווריד קאווה המעולה במקום זאת. עם זאת, כאשר השתמשנו בשיטה זו, קיבוע של הכבד נראה גרוע יותר בהשוואה לחיתוך הכבד. במיוחד אם הכלאה של RNA in situ (ISH) מתוכננת להתבצע על חתכים בכבד, אנו ממליצים לבצע חתכים בכבד לפני הזרקה תוך-לבבית של פורמלין, כמתואר לעיל. זה מאפשר קיבוע מספיק של רקמת הכבד, וכתוצאה מכך שמירה על שלמות הרנ"א עבור ISH. - מכניסים את רקמות הכבד והריאות ל-10% פורמלין ומקבעים את הלילה. החלף את הפורמלין ב-70% אתנול, ולאחר מכן הטמעת פרפין.
- בצע צביעת המטוקסילין ואוזין כדי להעריך באופן היסטולוגי את אזור הגידול. לבצע אימונוהיסטוכימיה עבור סמנים סטרומליים של עניין. בצע את הכתמת Picro-Sirus Red כדי להעריך אזורים חיוביים לקולגן.
הערה: ניתן להשתמש בתוכנת ImageJ42 כדי לכמת אימונוהיסטוכימיה ונתוני צביעה של Picro-Sirius Res. ניתן להשתמש בפונקציית דה-קונבולוציה של צבע ובכלי פיברוזיס MRI כדי להעריך 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-אזורים חיוביים ואזורים חיוביים אדומים של Picro-Sirius, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לגרום לביטוי יתר בתיווך AAV של גן סטרומלי מרסן גידול, Islr 4,25,43,44, בהפטוציטים, הזרקנו תוך ורידי AAV8 המקודד על ידי איסלר. 1.0 x 1011 גנומים נגיפיים (vg) של AAV8-Islr, או כבקרה, AAV8-mRuby2, הוזרקו לווריד זנב העכבר הבוגר (איור 1A). שבועיים לאחר הזרקת וריד הזנב, נקטפו כבדים כדי לאמת את ביטוי היתר של Islr בהפטוציטים. ביצענו RNAscope בהכלאה באתרה 45 ואישרנו כי אותות 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)+ נצפו בכל הכבד (איור 1B). לא זוהו אותות DAB+ בכבד מעכבר שטופל ב-AAV8-mRuby2.
תרגלנו את הליך הזרקת הוורידים בפורטל על ידי הזרקת דיו הודו (דילול 1:1000 ב- PBS). לאחר ביצוע חתך לבטן העליונה, המעיים הוצאו בעדינות מחלל הבטן כדי לאפשר הדמיה של וריד הפורטל (איור 2A). הזרקת וריד פורטל של דיו הודו העבירה את הדיו דרך הכבד, אך לא לריאה (איור 2B). אם הדיו מוזרק בטעות לכלי דם אחרים כגון הווריד הנבוב התחתון (IVC) או אבי העורקים הבטני, סירקולציה מערכתית של הדיו משנה את צבע הריאה לשחור. הדיו ההודי גם מסייע בזיהוי כמות הדליפה מווריד הפורטל, מה שמעיד על התפשטות הלבלב או הצפק.
שבועיים לאחר הזרקת וריד הזנב של AAV-mRuby2, ApcΔ/Δ ו-Trp53Δ/Δ אורגנואידים של סרטן המעי הגס (AP tumoroids) נותקו לתאים בודדים והוזרקו לווריד פורטל העכברים (איור 3A). כדי לאשר את צמיחת הגידול הגרורתי ולהעריך היסטולוגיה, אספנו את הכבדים 3-4 שבועות לאחר הזרקת הווריד הפורטלי (כלומר, בנקודה מתוזמנת ולא בנקודת קצה הומאנית), לפני שנמק בולט מבלבל ניתוחים היסטופתולוגיים. באופן מקרוסקופי, הזרקת הווריד הפורטלי של גידולים סרטניים גרמה למספר גושים של גידולים לבנים בכבד (איור 3B). מצאנו שהזרקה תוך-טחולנית של אותו מספר תאים של גידולים לא יצרה מסת גידול גרורתית גדולה. זה מצביע על כך שגישת הזרקת הוורידים הפורטליים גרמה בצורה יעילה יותר לגרורות בכבד בהשוואה למודל ההזרקה התוך-טחולית. צביעת המטוקסילין ואאוזין של גרורות הכבד CRC המושרות על ידי הזרקת הווריד הפורטלי הדגימה היסטופתולוגיה של אדנוקרצינומה צינורית מובחנת למדי, מלווה בתגובה סטרומלית דסמופלסטית ונמק (איור 3C). היסטולוגיה עשירה בסטרומה זו שחזרה בנאמנות את זו של גרורות כבד CRC אנושיות (איור 3C), מה שהפך את המודל הזה למתאים למחקר תרגומי החוקר את סטרומה של הגידול הגרורתי. יתר על כן, אימונוהיסטוכימיה עבור אקטין שרירי אלפא-חלק (αSMA), סמן מבוסס היטב עבור CAFs, הראתה שכ-7% מאזורי הגידול היו חיוביים ל-αSMA, מה שאישר את נוכחותם של CAFs במודל העכבר הזה (איור 3D,E). צביעה אדומה של Picro-Sirius שמכתימה קולגן46 הדגימה שפע של ECM במזנכים של הגידול עם כ-13% מאזורי הגידול החיוביים לקולגן (איור 3D,E). אימונוהיסטוכימיה עבור EPCAM, סמן שושלת אפיתל, גילתה כי ה-CRC הגרורתי הראה ניצני גידול (תא גידול יחיד או אשכול תאים של עד ארבעה תאי גידול) שהוא מאפיין של פרוגנוזה לקויה של סרטן המעי הגס47 (איור 3F). מדד הסימון של Ki67 ב-CRC הגרורתי היה כ-80%, מה שמצביע על כך שרוב תאי הגידול פעילים באופן מיטוטי (איור 3G,H).
ביצענו ניתוחי הישרדות של עכברים וקינטיקה של גדילת גידולים במודל פרה-קליני זה. העכברים בקבוצת הפיילוט הראשונה שלנו הראו הישרדות חציונית של 57 ימים לאחר הזרקת הגידול לווריד הפורטל (N = 4 עכברים; איור 4א). זה שוכפל מאוחר יותר בקבוצות שליטה גדולות יותר AAV8-mRuby2-מוזרק25. בנקודת קצה הומאנית (כפי שמוצג ב- NOTE, שלב 5.2), 3 מתוך 4 עכברים בקבוצת הפיילוט הדגימו מיימת, אשר נצפתה גם בחולים עם גרורות כבד מתקדמות48. כדי להעריך את גדילת הגידול, מערכת הדמיית in vivo (IVIS) שימשה למדידת לומינסנציה שמקורה בגידול (איור 4B,C). אותות הביו-לומינסנציה נצפו בתוך הבטן העליונה, מה שמרמז על גדילה ספציפית של הגידול בכבד (איור 4B). אם אותות IVIS נצפים בבטן התחתונה, הדבר מצביע על התפשטות הצפק או גרורות משניות לאיברי הבטן. הדמיית in vivo השבועית אפשרה הערכה אורכית של צמיחת הגידול בכל עכבר (איור 4C), מה שהקל על ניטור השפעה טיפולית במחקר הגדול יותר שלנו. שיעור נטילת הגידול היה 100% (4/4 עכברים) כפי שהוערך על ידי אותות IVIS. בניסוי זה לא נצפתה גרורות ריאה מקרוסקופיות לעין בזמן איסוף הרקמות (0/4 עכברים).
לבסוף, חקרנו אם אספקה מכוונת הפטוציטים בתיווך AAV של גן CAF מרסן סרטן, Islr 4,25, יכולה לעכב את צמיחת גרורות הכבד של CRC במודל עכבר פרה-קליני זה. יש לציין כי עכברים שטופלו ב-AAV8-Islr הראו שיפור בהישרדות העכברים והפחיתו את אותות ה-IVIS מגידולים (איור 5A-C)25. אימונוהיסטוכימיה עבור Smad1/5/8 זרחני הראה כי ביטוי יתר של הפטוציטים של ISLR, פוטנציאטור המאותת BMP, איתות BMP מוגבר בגידולים גרורתיים (איור 5D). הטיפול ב-AAV8-Islr הפחית את מספר התאים המתרבים של Ki67+ בגרורות הכבד של CRC (איור 5E). לתיאור מלא של התוצאות, עיין Kobayashi et al., גסטרואנטרולוגיה, 202125. הנתונים הקולקטיביים שלנו מצביעים על כך שמסירה בתיווך AAV8 של גן מעכב גידול להפטוציטים, מרכיב חיוני של הגידול הגרורתי בכבד סטרומה29, עשויה להיות גישה מונעת/טיפולית יעילה עבור גרורות בכבד CRC (איור 5F).
איור 1: AAV8-Islr הניתן על ידי וריד זנב יוצר ביטוי יתר של Islr בכבד. (A) ערכת ניסוי המציגה את הזרקת וריד הזנב של AAV8, ולאחר מכן הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים של סרטן המעי הגס (CRC). ISH, הכלאה באתרה; IHC, אימונוהיסטוכימיה; qRT-PCR, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת. (ב) תמונות מייצגות. הכלאת RNA in situ עבור Islr בוצעה באמצעות כבדים מעכברים שטופלו ב-AAV8-Islr או בעכברים שטופלו ב-AAV8-mRuby2. הכבדים נאספו שבועיים לאחר הזרקת ורידי הזנב. סרגלי קנה מידה, 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הזרקת וריד פורטל של דיו הודו גורמת להעברתו לכבד, אך לא לריאה. (A) תמונות מייצגות המראות אנטומיה של הבטן העליונה לאחר לפרוטומיה. שים לב כי, עבור הדמיה של וריד הפורטל, המעיים נלקחים מחוץ לחלל הבטן. התמונה בצד ימין מראה ביאור אנטומי של כל איבר וכלי. החץ הצהוב מציין את אתר ההזרקה. IVC, vena cava נחות. (B) תמונות מייצגות של הכבד והריאה בעקבות הזרקת וריד פורטל של דיו הודו. ראשי החצים הצהובים מציינים כלי שיט המוכתמים בדיו הודו. סרגלי קנה מידה, 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס מייצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. (A) סכימה ניסיונית המציגה הזרקת ורידים פורטליים של ApcΔ/Δ ו-Trp53Δ/Δ אורגנואידים של סרטן המעי הגס (AP tumoroids). סרגל קנה מידה, 200 μm. T, גידולים סרטניים. (B) תמונות מקרוסקופיות מייצגות של הכבדים שנאספו 3-4 שבועות לאחר הזרקת ורידים פורטליים (משמאל) או הזרקה תוך-טחולית (מימין). 5.0 x 105 תאים בודדים מגידולי AP הוזרקו לווריד הפורטל או לטחול. הזרקה תוך-ספלנית בוצעה כמתואר13. גושים לבנים מצביעים על גידולים. T, גידול; N, כבד רגיל. (C) תמונות צביעה מייצגות של המטוקסילין ואוזין (H&E) של גרורות כבד CRC ממודל עכבר הזרקת הוורידים הפורטליים (משמאל ומאמצע) ובני אדם (מימין). T, גידול; N, כבד רגיל; S, סטרומה; Nec, Necrosis. הקו המקווקו הצהוב מציין גבול בין הגידול לכבד רגיל (משמאל). (ד' ו-ה') אימונוהיסטוכימיה (IHC) עבור אקטין שרירי אלפא-חלק (αSMA; משמאל) וכתמים אדומים של פיקרו-סיריוס (מימין). (ד) תמונות מייצגות. (E) כימות של אזורים חיוביים ל-αSMA (משמאל) ואזורים חיוביים-אדומים של פיקרו-סיריוס (מימין). N = 4 עכברים, 5 HPFs (שדות בהספק גבוה; 400x) / עכבר. (F) תמונה מייצגת המציגה אימונוהיסטוכימיה עבור EPCAM, סמן תאי אפיתל. הקווים המנוקדים הירוקים מציינים ניצני גידול. (ז' ו-ח') אימונוהיסטוכימיה עבור Ki67, סמן התפשטות תאים. (ז) תמונה מייצגת. (H) אחוז תאי Ki67+ בסך כל תאי האפיתל. תאי אפיתל הודגמו על ידי ההמטוקסילין נגדי. N = 4 עכברים, 5 HPFs / עכבר. ב-(B)-(H), כל רקמות הכבד של העכברים נאספו 3-4 שבועות לאחר הזרקת גידולי AP. ממוצע ± S.E.M. כל נקודה מייצגת ערך ממוצע של 5 HPFs מעכבר (E ו-H). פסי קנה מידה מייצגים 1 ס"מ (B), 1 מ"מ (C; משמאל), 100 מיקרומטר (C; אמצע וימין) ו-50 מיקרומטר (D, F ו-G). שימו לב שהמחקר עם רקמות אנושיות אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת נגויה (2017-0127). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח הישרדות וניתוח קינטי של גדילת גידולים על ידי הדמיית in vivo . (A) עקומות ההישרדות של קפלן-מאייר. N = 4 עכברים. (ב,ג) מערכת ההדמיה In vivo (IVIS) שימשה להערכת קינטיקה של גדילת הגידול. (ב) תמונה מייצגת. השטח בתיבה האדומה שימש לכימות. (C) קינטיקה של גדילה. אותות לוציפראז מכל עכבר מוצגים. N = 4 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: העברת גנים בתיווך AAV8 של Islr להפטוציטים מגבירה את איתות ה-BMP, מפחיתה את התפשטות הגידול ומשפרת את הישרדות העכברים במודל הזרקת ורידים פורטלי של גרורות בכבד CRC. (A) עקומת ההישרדות של קפלן-מאייר. שבועיים לאחר הזרקת וריד הזנב של AAV-Islr או AAV-mRuby2, בוצעה הזרקת ורידים פורטלית של גידולי CRC. (ב ו-ג) אותות לוציפראז שמקורם בגידול הוערכו באמצעות IVIS. (ב) תמונה מייצגת. (C) כימות אותות IVIS. N = 5 (AAV-mRuby2) ו-8 (AAV-Islr) עכברים. ממוצע ± S.E.M. (D) תמונות מייצגות. אימונוהיסטוכימיה (IHC) עבור Smad1/5/8 זרחני (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 היא מולקולה במורד הזרם של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP) המאותתת על ידי זרחון עם הפעלת איתות BMP49. N = 4 עכברים כל אחד. (ה) תמונות מייצגות. אימונוהיסטוכימיה עבור Ki67. N = 4 עכברים כל אחד. (ו) סיכום גרפי. העברת גנים מכוונת הפטוציטים בתיווך AAV של גן סטרומלי מרסן סרטן עשויה לשמש כאסטרטגיה טיפולית לעיכוב גרורות של CRC. ביטוי יתר בתיווך AAV8 של Islr בהפטוציטים שיפץ את הנישה הגרורתית על ידי הגברת איתות BMP והתקדמות מוגבלת של גרורות CRC. לקבלת מידע מפורט, עיין Kobayashi et al., גסטרואנטרולוגיה, 202125. מבחן דירוג יומן (A), ומדדים דו-כיווניים חוזרים ונשנים ANOVA (ניתוח שונות) עם מבחן ההשוואה המרובה של סידק לאחר הוק בשבוע 3 (C). סרגלי קנה מידה, 50 μm. איור 5A-C הודפס מחדש מתוך גסטרואנטרולוגיה, כרך 160(4), Kobayashi et al., המאזן של איתות BMP סטרומלי בתיווך GREM1 ו- ISLR כוננים קרצינוגנזה של המעי הגס, עמודים 1224-1239.e30, זכויות יוצרים (2021), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הראינו כי הזרקת ורידים פורטליים של אורגנואידים CRC של עכברים יוצרת באופן משוחזר גרורות כבד עשירות בפיברובלסטים המחקות תכונות היסטולוגיות של גרורות כבד CRC אנושיות. יתר על כן, בשילוב עם טיפולים מכווני סטרומה כגון ריפוי גנטי בתיווך AAV8, מודל פרה-קליני זה משמש ככלי שימושי להערכת השפעות טיפוליות על הישרדות עכברים וצמיחת גידולים.
ישנם, לפחות, שני שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, חשוב להכין תרחיף חד-תאי של סרטנים על ידי טריפסיזציה מלאה של האורגנואידים ושימוש במסנן רשת להסרת גושי תאים. דיסוציאציה לא מלאה של גידולים גורמת לצבירת תאים גדולים, שהזרקה שלהם יכולה לחסום את וריד הפורטל. זה גורם לאוטם של הכבד ולמוות בעלי חיים22. שנית, במהלך הזרקת וריד הפורטל, זה הכרחי כדי למזער את הדימום מווריד הפורטל. יש להכניס את המחט כראוי לווריד הפורטל. כדי למנוע ניקוב של הצד השני של וריד הפורטל, יש לשמור את זווית המחט שהוכנסה כמעט במקביל לווריד הפורטל. כדי למנוע קריעה של וריד הפורטל במהלך ההזרקה, אין להזיז את המחט ברגע שהיא מוכנסת במלואה לווריד הפורטל. מיד לאחר הסרת המחט מווריד הפורטל, חיוני להפעיל לחץ על אתר ההזרקה עם ניצן כותנה למשך 5 דקות לפחות.
יש לשנות את מספר התא להזרקה בהתאם לעכבר המקבל (למשל, אימונו-כושר לעומת עכבר אימונו-יעיל) ולגידוליות של הקו האורגנואידי. בניסויים שלנו, הזרקה של 5.0 x 105 תאים בודדים בתרחיף של 100 μL הספיקה כדי ליצור גרורות בכבד בעכברים מדוכאי חיסון. הגדלת מספר התאים עלולה להגביר את הסיכון לתסחיף ברוח הפורטל ולמוותם של בעלי חיים14, ולכן יש לשקול זאת בקפידה. בהתחשב בכך שמאמרים קודמים השתמשו ב-5 x 104 עד 5 x 105 תאים ב-100 μL להזרקה סרטנית לפורטל או לווריד המזנטרי 25,26,27,28, אנו סבורים שטווח מספרי תאים זה יהיה נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה.
מגבלה אחת של גישת הזרקת הוורידים בפורטל היא שהיא אינה משחזרת באופן מלא את כל מפל הגרורות של CRC. גרורות בכבד של סרטן דורשות חמישה שלבים עיקריים: (1) פלישת תאים סרטניים באתר הראשוני, (2) תוך-ווסציה לתוך הכלי, (3) הישרדות התאים במחזור הפורטל, (4) אקסטרווסציה מווריד הפורטל לפרנכימה של הכבד, ו-(5) התיישבות בנישה הגרורתית50. מודל הזרקת הוורידים בפורטל מאפשר רק חקירה של שלבים (3)-(5). כדי לקבל תובנות על התהליכים הגררתיים האחרים, יש צורך להשתמש במודלים אחרים כגון מודלים במבחנה ו/או מודל עכבר CRC ראשי מוטנטי Notch1 אשר שולח לעתים קרובות גרורות לכבד51.
המשמעות של שיטת הזרקת ורידי הפורטל ביחס לשיטות הקיימות כוללת גדילה ספציפית לכבד ונטל גידול גבוה יותר. הפצת הצפק במודלים אחרים של הזרקה וגידול ראשוני במודלים ראשוניים של CRC יכולים לבלבל ניתוח של התקדמות גרורות בכבד. לעומת זאת, גישת הוורידים הפורטליים שלנו מייצרת במהירות גידולים ספציפיים לכבד, ומפשטת את ניתוחי ההישרדות והגידול של הגידול.
אחד היתרונות הגדולים של השתלת אורגנואידים על פני הזרקת קו תאים הוא שהזרקת ורידים פורטלית של סרטנים יצרה את המיקרו-סביבה של הגידול העשיר בפיברובלסטים, המהווה פנוקופה של תכונה דסמופלסטית של CRC גרורתי אנושי. תנאי תרבית אורגנואידית משחזרים תכונות של המיקרו-סביבה של הגידול ותומכים באוכלוסיות תאי גזע במעיים, כולל הטמעת תאים ב-ECM תלת-ממדי עשיר ומורכב עם שילוב מוגדר של גורמי גדילה24,52. התוצאה היא התפשטות תאי הגידול באופן שמשמר את הנוף הגנטי של גידול המקור52,53. לעומת זאת, תרבית דו-ממדית מסורתית של קווי תאי הגידול קשורה לברירה קלונלית ולשינויים גנומיים/תעתיקיים חריגים שאינם משקפים נאמנה את המאפיינים של הסרטנים המקוריים54. אנו משערים שתנאי התרבית הקשים יחסית לתרבית הדו-ממדית של קווי תאים סרטניים מאלצים את התאים להסתגל להיעדר אותות ECM/גורם גדילה שעלולים לגרום לגידולים עניים בסטרומה in vivo, מכיוון שהתאים אינם זקוקים עוד לאותות שמקורם בסטרומה להישרדות.
על ידי שילוב מודל הזרקת הוורידים של פורטל האורגנואידים עם טיפול גנטי בתיווך AAV8, מצאנו כי העברת מטען מעכב סרטן להפטוציטים לפני התיישבות תאי הסרטן בכבד יכולה לשנות את הנישה (הטרום-גרורתית) כדי לעכב את צמיחת גרורות CRC25. באופן מעודד, ניסויים קליניים הראו כי העברת גנים in vivo בתיווך AAV לכבד גורמת לביטוי ארוך טווח של טרנסגן ויכולה להיות שיטה יעילה ובטוחה לטיפול במחלות גנטיות שאינן ניאופלסטיות 30,31,55. בעתיד, רתימת הפטוציטים למניעת גרורות בכבד באמצעות גישת AAV עשויה להיות בעלת ערך קליני פוטנציאלי בחולי סרטן הנמצאים בסיכון גבוה לגרורות.
לסיכום, המאמר שלנו מראה כי השתלת אורגנואידים של CRC דרך וריד הפורטל יוצרת גרורות כבד עשירות בפיברובלסטים, אשר ניתן לנצלן לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות המכוונות נגד הסטרומה. על ידי צימוד הזרקת הוורידים הפורטליים עם טיפול מכוון סטרומה כגון העברת גנים בתיווך AAV, ניתן לזהות מטרות סטרומליות חדשות לריסון התקדמות גרורות CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (APP1156391 ל- D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 עד D.L.W., APP1140236 עד S.L.W., APP1099283 עד D.L.W.,); מועצת הסרטן SA ניצחה את פרויקט הסרטן בשם התורמים שלה וממשלת המדינה של דרום אוסטרליה באמצעות מחלקת הבריאות (MCF0418 ל- S.L.W., D.L.W.); מענק סיוע למחקר מדעי (B) (20H03467 ל- M.T.) שהוזמן על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן; AMED-CREST (הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי, מחקר ליבה למדע וטכנולוגיה אבולוציונית (19gm0810007h0104 ו- 19gm1210008s0101 עד A.E.); הפרויקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-CREATE) מ- AMED (19cm0106332h0002 עד A.E.); האגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל תוכנית אתגר לחוקרים צעירים (ל- H.K.), מלגת קרן טקדה למדע (ל- H.K.), מלגת הדוקטורט הבינלאומית של גרייטון (ל- H.K.), מלגת קרן המחקר הרפואי של ליונס (ל- K.G.).
אנו מודים לד"ר לזק ליסובסקי במתקן להנדסת וקטורים וגנום (VGEF), מכון המחקר הרפואי לילדים (CMRI) (NSW, אוסטרליה) על ייצור וקטורים רקומביננטיים AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
- Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
- Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
- Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
- Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
- Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
- Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
- Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
- Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
- Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
- McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
- Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
- Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
- Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
- Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
- de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
- Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
- Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
- George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
- Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
- Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
- Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
- Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
- Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
- Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
- Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).
