Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Portalveninjektion av kolorektal cancerorganoider för att studera levermetastasen Stroma

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

Portalveninjektion av kolorektal cancer (CRC) organoider genererar stromarik levermetastas. Denna musmodell av CRC-levermetastaser representerar ett användbart verktyg för att studera tumör-stroma-interaktioner och utveckla nya stroma-riktade terapier såsom adenoassocierade virusmedierade genterapier.

Abstract

Levermetastasering av kolorektal cancer (CRC) är en ledande orsak till cancerrelaterad död. Cancerassocierade fibroblaster (CAF), en viktig del av tumörmikromiljön, spelar en avgörande roll i metastatisk CRC-progression och förutsäger dålig patientprognos. Det saknas dock tillfredsställande musmodeller för att studera överhörningen mellan metastatiska cancerceller och CAF. Här presenterar vi en metod för att undersöka hur levermetastasprogressionen regleras av den metastatiska nischen och eventuellt kan begränsas av stroma-riktad terapi. Portalveninjektion av CRC-organoider genererade en desmoplastisk reaktion, som troget rekapitulerade den fibroblastrika histologin hos humana CRC-levermetastaser. Denna modell var vävnadsspecifik med en högre tumörbörda i levern jämfört med en intra-mjältinjektionsmodell, vilket förenklade musöverlevnadsanalyser. Genom att injicera luciferasuttryckande tumörorganoider kunde tumörtillväxtkinetiken övervakas genom in vivo-avbildning . Dessutom ger denna prekliniska modell en användbar plattform för att bedöma effekten av terapier riktade mot tumörmesenkymet. Vi beskriver metoder för att undersöka om adenoassocierad virusmedierad leverans av en tumörhämmande stromalegen till hepatocyter skulle kunna omforma tumörmikromiljön och förbättra musens överlevnad. Detta tillvägagångssätt möjliggör utveckling och bedömning av nya terapeutiska strategier för att hämma levermetastasering av CRC.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) är en viktig orsak till cancerdödlighet över hela världen1. Mer än hälften av CRC-patienterna utvecklar levermetastaser som sker genomportalvenspridningen 1. För närvarande finns det inga effektiva terapier som kan bota avancerad levermetastas, och de flesta patienter ger efter för metastatisk sjukdom.

Den metastatiska nischen eller tumörmikromiljön spelar en nyckelroll i engraftment och tillväxt av spridda CRC-celler2. Cancerassocierade fibroblaster (CAF), en framträdande komponent i tumörmikromiljön, främjar eller begränsar cancerprogression genom att utsöndra tillväxtfaktorer, ombygga den extracellulära matrisen (ECM) och modulera immunlandskap och angiogenes 3,4,5. CAF ger också resistens mot kemoterapier och immunterapier3. Dessutom reglerar CAF initiering och progression av CRC-levermetastaser och förutsäger prognos hos patienter med CRC 3,6,7,8. Således kan CAF-relaterade faktorer utnyttjas för utveckling av terapeutiska strategier för att hämma CRC-levermetastasering. Bristen på tillfredsställande musmodeller för att studera den metastatiska tumörstroma har dock varit ett stort hinder för att utveckla stroma-riktade terapier.

För närvarande inkluderar djurmodeller för att studera CRC-levermetastaser primära CRC-modeller som spontant utvecklar levermetastaser och cancercellstransplantationsmodeller i levern. Primära CRC-musmodeller, såsom genetiskt konstruerade musmodeller och koloninjektion av cancerceller, visar sällan metastaser till levern 9,10,11,12. Dessutom, även om en levermetastas observeras, visar dessa modeller lång latens från den primära tumörinduktionen till metastasering och dör potentiellt av primär tumörbörda12. För att effektivt generera CRC-levermetastaser transplanteras odlade CRC-celler i levern med hjälp av tre injektionsmetoder: intra-mjältinjektion, direkt intraparenkymisk injektion i levern och portalveninjektion. Intra-spleniskt injicerade cancerceller sprids i mjältvenen, portalvenen och slutligen till levern13,14. Den intra-mjältinjektion ger emellertid ett lägre tumörintagsförhållande jämfört med andra transplantationsmodeller15,16. Med intra-mjältinjektion utförs kirurgiskt avlägsnande av mjälten för att undvika cancertillväxt i mjälten, vilket potentiellt kan äventyra immuncellsmognad17. Vidare kan intra-mjältinjektion också resultera i oavsiktlig tumörtillväxt i mjälten och bukhålan18, vilket komplicerar analyser av levermetastaser. Direkt intraparenkymisk injektion i levern inducerar effektivt levermetastasering 16,19,20. Ändå rekapitulerar detta tillvägagångssätt inte helt ett biologiskt steg av levermetastas som naturligt sker genom portalvenspridning. Med hjälp av direkt injektion i levern kan cancerceller komma in i en icke-portal, men systemisk cirkulation kan också resultera i flera stora lungmetastaser16. Även om en majoritet av patienterna med CRC-levermetastaser visar flera tumörknölar i levern21, genererar direkt injektion i en specifik leverlob en enda tumörmassa19,20. Portalveninjektion eller mesenterisk veninjektion, även om det är tekniskt utmanande, möjliggör effektiv leverans av tumörceller i levern på ett sätt som sammanfattar de tillväxtmönster som ses hos patienter17. Denna strategi kan minimera risken för metastaser på sekundär plats och möjliggör snabb tillväxt av cancerceller i levern, vilket förenklar musöverlevnadsanalyser.

Historiskt sett användes kolorektal cancercellinjer som mus MC-38, human HT-29 och SW-620 för att generera musmodeller av levermetastas22,23. Dessa kolorektala cancercellinjer inducerar emellertid inte en desmoplastisk stromalreaktion. Lågt stromalinnehåll i tumörerna gör det svårt att undersöka de biologiska rollerna hos cancerassocierade fibroblaster. De senaste framstegen inom CRC-organoider och deras transplantation har erbjudit användbara plattformar för att bedöma stromas vitala roller i cancerprogression24. Levertransplantation av CRC-organoider genererar en fibroblastrik tumörmikromiljö och har gett nya insikter i stromalforskning 6,25. För närvarande har portal- eller mesenterisk veninjektion av organoider blivit en guldstandardmetod för att generera CRC-levermetastaser 6,25,26,27,28. Såvitt vi vet har dock inga tidigare artiklar beskrivit detaljerade metoder för portalveninjektion av kolorektala tumöroider. Här presenterar vi en metod för att använda portalveninjektion av CRC-organoider för att utveckla nytt adenoassocierat virus (AAV) -medieterad stroma-riktad terapi.

Hepatocyter är en viktig beståndsdel i den metastaserande tumörmikromiljön i levern och spelar en avgörande roll i metastatisk cancerprogression29. Inspirerade av framgången med AAV-genterapimetoder för att inducera proteinuttryck i hepatocyter hos icke-neoplastiska patienter30,31, undersökte vi ett liknande tillvägagångssätt men syftade till att modifiera levertumörmikromiljön i CRC25. Som sådan beskriver vi också här svansveninjektionen av AAV8 för att inducera uttryck av antitumörigena proteiner för att modifiera levertumörens mikromiljö. AAV8-serotypen, betecknad genom valet av viralt kapsidprotein under virusproduktion, leder till hög transduktionseffektivitet specifikt för hepatocyter (dvs. riktat genuttryck i levertumörmikromiljön)32. Vi har tidigare visat att Islr (immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat) är en CAF-specifik gen som inducerar benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering, minskar CRC-tumöroidtillväxt och främjar Lgr5+ intestinal stamcellsdifferentiering25. Vi testade om AAV8-medierat överuttryck av den cancerhämtande stromagenen, Islr, i hepatocyter kunde dämpa levermetastasprogressionen genom att utföra portalveninjektion av CRC-tumöroider hos AAV8-Islr-behandlade möss.

I detta dokument beskriver vi först injektionsproceduren för svansvenen i levertropiken AAV. Därefter beskriver vi en metod för tumöroidcellberedning och portalveninjektion i de AAV-behandlade mössen. Slutligen presenterar vi metoder för att övervaka metastatisk tumörprogression för att bedöma effekten av stroma-riktade terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök i denna artikel granskades och godkändes av South Australian Health and Medical Research Institute Animal Ethics Committee (godkännandenummer, SAM322).

1. Injektion av svansven av adenoassocierat virus

OBS: Adenoassocierat virus (AAV) bör hanteras som en biologisk fara enligt riktlinjerna för biosäkerhetsnivå 1. Se det publicerade protokollet för AAV-beredning, rening och titrering33. Hepatocyt-tropisk AAV, AAV834, som kodar för cytomegalovirus (CMV) promotor-Islr-genen , användes i denna studie25. För att inducera AAV-medierat överuttryck kan AAV-dosering kräva optimering beroende på promotoraktivitet, gen och musvikt.

  1. Späd AAV-vektorn i 150 μL alikvoter innehållande 1,0 x 1011 virala genom, med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och håll den på is. Personlig skyddsutrustning ska bäras för att hantera AAV.
    OBS: Upprepad frysning och upptiningscykel minskar virustitern och bör undvikas. Stamvirallösningen ska förvaras i en frys på -80 °C.
  2. Slå på en värmebox (djurvärmekammare) för att förvärma till 35 °C.
  3. Håll en mus och applicera en aktuell anestesikräm på hela svansens längd minst 15 minuter före injektionen av svansvenen.
    OBS: Detta är ett valfritt steg och kanske inte är nödvändigt om det inte krävs av institutets djuretiska kommitté. Följ det protokoll som godkänts av den lokala djuretiska kommittén. I detta experiment25 användes en Rosa26-Cas9-mus för AAV-injektion och efterföljande portalveninjektion av CRC-organoider. Med tanke på att tumöroider som användes i denna studie härleddes från en Rosa26-Cas9-mus (C57BL / 6 x 129 genetisk bakgrund), användes denna musstam också som immunkompetenta, syngena mottagare av tumörtransplantationen. Manliga och kvinnliga Rosa26-Cas9-möss (6 till 24 veckor gamla) användes.
  4. Placera musen i värmeboxen. Låt musen stå i upp till 15 minuter för att värma och vidga svansvenerna.
  5. Säkra försiktigt musen i en gnagare restrainer. Placera svansen under en värmelampa för att säkerställa full utvidgning av svansvenerna.
  6. Rita upp 150 μL utspädd AAV (framställd i steg 1.1) i en steril spruta med lågt dött utrymme med en 27-30 G nål.
  7. Flytta värmelampan och identifiera den laterala svansvenen som ligger på svansens sidor. Sätt lätt spänning på svansen med fingrarna så att svansen blir rak.
  8. Sätt långsamt in 2-3 mm av nålen, fasa upp, i venen. Nålen ska vara nästan parallell med svansen (upp till 15° från svansen).
    OBS: Blodinflöde i sprutan kan observeras om nålen framgångsrikt ligger i venen.
  9. Injicera långsamt. Om ett motstånd känns eller hudsvullnad observeras, ta bort nålen och sätt in den igen ovanför den första platsen eller till den andra laterala venen.
  10. Vänta i ca 5 s efter avslutad injektion och ta sedan långsamt bort nålen. Applicera omedelbart försiktigt tryck på injektionsstället med en ren gasväv eller pappershandduk tills blödningen slutar.
  11. Släpp försiktigt musen i buret. Övervaka djuret för att säkerställa att blödningen har slutat.
    OBS: Genöveruttryck i levern kan bedömas 1 till 2 veckor efter AAV-injektion av svansvenen. Detta kan exempelvis bekräftas genom RNA in situ-hybridisering (ISH), immunohistokemi (IHC), western blotting eller kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR; Figur 1A,B). I en tidigare publicerad studie25 användes AAV8-Islr för att överuttrycka mus islr-genen i hepatocyter och överuttrycket detekterades av RNA ISH (figur 1A,B).

2. Cellberedning för organoider för kolorektal cancer

OBS: CRC-organoider som används för detta experiment innehåller enbart epitelceller. Odling och generering av CRC-organoider har tidigare beskrivits 25,35. Kort sagt, normala kolonepitelceller isolerades från tjocktarmen på en Rosa26-Cas9-mus med hjälp av en kryptisoleringsbuffert (5 mM EDTA (etylenidamintetraacetat) i iskall PBS) och inbäddades sedan i basalmembranmatrismedium och odlades i organoidtillväxtmedium enligt beskrivningen i referens35. Därefter introducerades Apc- och Trp53-mutationer till kolonepitelcellerna genom att överuttrycka enkelguide-RNA som riktar sig mot Apc och Trp53 med hjälp av lentivirusuttrycksprotokoll. Enstaka organoidkloner handplockades25. EnpcΔ/Δoch Trp53Δ/Δ koloncancerorganoider (AP-tumöroider) injicerades som 5,0 x 105 enstaka celler i 100 μL PBS med 10 μM Y-27632 i portalvenen per mus, med organoidodling och encellsberedning som beskrivs nedan.

  1. Odla CRC-organoiderna i basalmembranmatrisens mediumkupoler i en 24-brunnsplatta eller 10 cm skål 3-5 dagar före portalveninjektionen för att erhålla organoider med en diameter på 50-400 μm.
  2. Förbered tillräcklig mängd cellavskiljningslösning genom att tillsätta Y-27632 till 10 μM koncentration, tillräckligt för att smälta antalet organoider som odlas för injektionen. Förvärm i ett 37 °C vattenbad.
    OBS: Cellavskiljningslösningen som används i detta protokoll är en rekombinant celldissociationsenzymblandning och används som ersättning för trypsin i organoidodling (se Materialtabell). Det minskar cellskador orsakade av celldissociation jämfört med trypsin36. Y-27632 är en Rho-kinashämmare och hämmar dissociationsinducerad celldöd, vilket ökar encellsöverlevnaden37.
    1. För injektion i upp till fem möss, förbered två rör innehållande 40 ml av cellavskiljningslösningen för att smälta 10-24 x 50 μL basalmembranmatriskupoler med varje kupol innehållande cirka 300 organoider (50-400 μm diameter), dvs varje mus injiceras med 2-4,8 kupoler av organoider (motsvarande cirka 600-1440 organoider). Antalet organoider som är nödvändiga för att erhålla tillräckligt cellantal är beroende av organoidlinjen och bör därför optimeras.
      OBS: Det andra 40 ml röret möjliggör en upprepad matsmältning med färsk cellavskiljningslösning för att erhålla dissocierade enskilda celler.
  3. Aspirera försiktigt organoidmediet från varje brunn.
  4. Tillsätt 1 ml iskall PBS till varje brunn i en 24-brunnsplatta. Om en 10 cm skål används, tillsätt 10 ml iskall PBS till skålen.
  5. Skrapa av basalmembranmatrismediet med en P1000 pipettspets. Överför PBS/mediumuppslamning till ett 15 ml centrifugrör.
  6. Skölj varje brunn med samma mängd PBS för att samla basalmembranmatrisfragment och lägg till 15 ml rör.
  7. Inkubera i 5 min på is. Denna inkubation hjälper till att lösa upp basalmembranmatrismediet.
  8. Centrifugera röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
  9. Aspirera supernatanten och se till att inte störa det pelleterade mediet och cellerna.
  10. Tillsätt 5 ml förvärmd cellavskiljningslösning framställd i steg 2.2 till pelleten, återutnyttja pelletsen 10 gånger och överför den tillbaka till ett 50 ml rör innehållande färsk, förvärmd cellavskiljningslösning.
  11. Placera röret i 37 ° C vattenbadet. Inkubera i 5 min.
  12. Centrifugera röret vid 400 x g i 3 min vid 4 °C.
  13. Upprepa steg 2.9–2.11.
    OBS: Upprepad enzymatisk matsmältning möjliggör effektiv celldissociation i enskilda celler.
  14. Kontrollera om organoiderna dissocieras i enskilda celler genom att pipettera 100 μL i en 96-brunnsplatta och observera under ett mikroskop. Om många organoider visar cellklumpar som består av mer än fyra celler kan längre inkubation med cellavskiljningslösningen och fysisk dissociation genom triturering med en 10 ml pipett vara nödvändig.
  15. När de flesta celler är enskilda celler, tillsätt 4 ml fetalt bovint serum (FBS) i 40 ml cellsuspension för att stoppa matsmältningen. Skölj en 40 μm cellsil med 5 ml PBS.
  16. För cellsuspensionen genom cellsilen till ett 50 ml uppsamlingsrör för att avlägsna eventuella cellklumpar.
  17. Centrifugera röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
  18. Aspirera supernatanten. Tillsätt 10 ml kall PBS till cellpelleten och överför den till ett 15 ml centrifugrör.
  19. Centrifugera röret vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
  20. Aspirera supernatanten. Resuspend pelletsen i 500 μL kall PBS med 10 μM Y-27632. Räkna cellerna.
  21. Justera cellkoncentrationen till 5,0 x 105 enskilda celler/100 μL med PBS med 10 μM Y-27632. Placera röret på is tills portalveninjektion utförs.
    OBS: Det rekommenderas att injicera dissocierade celler inom 4 timmar efter dissociation.

3. Portalveninjektion av CRC-organoider

OBS: Alla kirurgiska instrument och kirurgiska gasbindningar måste autoklaveras eller steriliseras före operationen. Detta protokoll är modifierat från ett tidigare protokoll17. I detta experiment25 utfördes portalveninjektion med Rosa26-Cas9-möss behandlade med AAV-mRuby2 eller AAV-Islr i steg 1.

  1. Förbered ett aseptiskt kirurgiskt område med sterila draperier på en värmepanna.
  2. Förbered kirurgiska instrument (sax och pincett), kirurgisk och hemostatisk svamp, 4-0 polyglaktinsutur, bomullspinnar, hudhäftapparater, häftapparatapplikator, saltlösning, buprenorfin och 33 G nål fäst vid en Hamilton-spruta. Skär den hemostatiska svampen i 1,0 cm x 1,0 cm bitar.
  3. Justera ljuskällans position för att belysa det kirurgiska området.
  4. Injicera 0,1 mg/kg kroppsvikt av buprenorfin subkutant till en mus för kirurgisk smärtlindring.
  5. Bedöva musen med isofluran i en anestesikammare. Isoflurankoncentrationen för induktion och underhåll är vanligtvis 5% respektive 2,5%. Kontrollera om det inte finns någon reaktion på tåklämman innan du påbörjar nästa procedur.
  6. Raka mitten till musens övre buk med en elektrisk rakapparat. Rakning bör utföras i ett område långt ifrån det aseptiska kirurgiska området för att undvika att håret förorenar platsen.
  7. Rengör snittstället alternerande med Betadin och 80% etanol för att sterilisera det kirurgiska området. Upprepa tre gånger.
  8. Placera musen på en värmedyna i ryggläge med underhållsisoflurananestesi. Placera en kirurgisk draperi med ett hål över musens buk.
  9. Lyft bukhuden med pincett och gör ett 2-3 cm hudsnitt vid mittlinjen med sax, skär endast huden (inte underliggande bukhinnan). Snittet bör sträcka sig från mitten av buken till bröstbenets xiphoidprocess. Snittet bör inte gå över den nedre änden av xiphoidprocessen.
  10. Lyft helt bukhinnan med pincett och gör ett liknande 2-3 cm snitt i bukhinnan med sax. Undvik att skära tarmen och membranet.
  11. Blötlägg den kirurgiska gasbindningen med varm saltlösning och placera den på vänster sida av snittet (på vänster sida av musens kropp, till kirurgens höger).
  12. Dra försiktigt ut de inre organen (tunn- och tjocktarmen) med en bomullsknopp blöt med saltlösning. Placera tarmarna på gasbindningen blöt med saltlösning.
    OBS: Musens vänstra tarm (dvs tarmar på kirurgens högra sida) ska dras ut först, och sedan kan musens högra tarm (dvs tarmar på kirurgens vänstra) dras ut.
  13. Justera tarmarnas position för att visualisera portalvenen. Täck tarmarna med ytterligare våt gasbindning för att hålla tarmarna fuktiga.
  14. Dra försiktigt tarmen till vänster sida med den våta gasbindningen och applicera mild spänning till vänster. Detta underlättar visualisering av portalvenen (figur 2A).
    OBS: Om visualisering av portalvenen är svår, kan det hjälpa visualiseringen att försiktigt justera magens position med en våt bomullsknopp.
  15. Pipett tumöroid suspension försiktigt flera gånger för att erhålla en homogen cellsuspension. Dra långsamt upp 100 μL av cellsuspensionen i en Hamilton-spruta fäst vid en 33 G-nål. Undvik luftbubblor.
  16. Sätt långsamt in nålen, fasa upp, i portalvenen. Insättningsdjupet längs nålen ska vara 3-4 mm, med nålvinkeln nästan parallell med portalvenen.
    OBS: Injektion ska utföras i den väl visualiserade delen av portalvenen (vanligtvis upp till 2 cm från leverfästet). Undvik nålens rörelse efter att den är helt införd i portalvenen.
  17. Injicera tumörceller i 30 s. Injektionen ska utföras långsamt för att förhindra ocklusion av portalvenen. Om injektionen lyckas ändras leverns färg tillfälligt från rött till vitt.
  18. Ta bort nålen långsamt. Applicera omedelbart försiktigt tryck på injektionsstället med en torr bomullsknopp och vänta i 5 minuter.
  19. Ta bort bomullsknoppen och applicera samtidigt en hemostatisk svamp på injektionsstället. Håll hemostatisk svamp med en bomullsknopp eller pincett och applicera försiktigt tryck i ytterligare 5 minuter.
  20. Ta bort trycket till den hemostatiska svampen och bekräfta att det inte finns någon blödning från injektionsstället.
    OBS: Den bioabsorberbara hemostatiska svampen behöver inte tas bort. Att försöka ta bort gasbindningen kan orsaka återblödning från injektionsstället.
  21. Om blödning uppstår, utför omedelbart tryck hemostas med en bomullsknopp i ca 10 min. Applicera sedan en extra hemostatisk svamp i ytterligare 5 minuter.
    OBS: Om okontrollerbar blodförlust observeras bör musen avlivas enligt protokollet som godkänts av institutets djuretiska kommitté.
  22. Ta bort de kirurgiska gasbindningarna på tarmarna. Använd en spruta fylld med 5 ml saltlösning, spruta saltlösning till tarmarna för att förhindra organvidhäftning.
    OBS: Applicera inte saltlösning på portalvenens injektionsställe. Detta kan orsaka återblödning.
  23. Placera försiktigt tarmarna tillbaka inuti bukhålan.
  24. Sutur bukhinnan med 4-0 polyglaktinsuturer.
  25. Lyft upp båda sidor av huden med pincett. Applicera hudhäftapparater för att stänga hudsnittet. Var försiktig så att du inte häftar tarmen.
  26. Stäng av isofluranet men håll syreflödet igång. Övervaka musen noggrant. När musen vaknar, placera musen i en tom bur på en värmepanna. Musen vaknar vanligtvis inom 5 minuter.
  27. Övervaka musen noggrant tills den är vid medvetande och ambulerar normalt.
  28. Subkutant injicera 0,1 mg/kg buprenorfin till musen 4 timmar efter operationen.
  29. Injicera 0,1 mg/kg buprenorfin till musen var 24:e timme under de följande 2 dagarna.
  30. Noggrant övervaka mössen dagligen i en vecka efter operationen. Kontrollera suturer och sårläkning.
  31. dagar efter operationen, ta bort hudhäftapparater med en häftapparatborttagare.

4. Bedömning av tumörtillväxtkinetik genom in vivo bioluminescerande avbildning

OBS: Om Firefly-uttryckande tumöroider används för injektion kan metastatisk tumörprogression övervakas varje vecka genom in vivo-avbildning enligt beskrivningen38,39. Luciferas uttryckt av cancerceller kan framkalla immunsvar mot cancercellerna och begränsatumörtillväxten 40. Således är försiktighet motiverad vid analys av immunfenotyper och cancerprogression i en musmodell med användning av luciferasuttryckande tumörceller.

  1. Förbered en 30 mg / ml lösning av D-luciferin med steril PBS. Skydda den från ljus. D-luciferin ska förvaras i alikvoter vid -20 °C tills användning.
  2. Raka buken och bröstkorgen med en elektronisk rakapparat. Detta kan göras upp till 1 dag före in vivo-avbildning .
  3. Injicera 150 mg/kg kroppsvikt av D-luciferin intraperitonealt i möss (dvs. om musens kroppsvikt är 30 g, injicera 150 μL av D-luciferinlösningen).
  4. Placera mössen i en anestesikammare och bedöva dem. Använd 5% isofluran för induktion och 2% -3% för underhåll.
  5. min senare, placera mössen i sidoläge (höger sida uppåt). Förvärva bioluminescensbilder med hjälp av ett in vivo-bildsystem (IVIS) som beskrivits tidigare38,39.
    OBS: Möss är mer stabila i sidoläge jämfört med ryggpositionen. Därför är en sidoposition att föredra för att erhålla en luminescensbild från ett konsekvent fokalplan.
  6. Placera mössen i en tom bur och övervaka deras återhämtning.
  7. Definiera intressanta regioner på övre delen av buken med hjälp av Living Image Software enligt beskrivningen38. Kvantifiera totalt flöde som ett surrogat för tumörcellnummer.

5. Överlevnadsanalys och vävnadsinsamling

  1. Övervaka möss noggrant för kliniska symtom på metastaser som en utsträckt buk.
  2. Avliva en mus genom CO 2-inandning när den når humana slutpunkter.
    OBS: Använd en studieslutpunkt som godkänts av institutets djuretiska kommitté. För att bestämma ett humant effektmått användes ett kliniskt journalblad; poängen beräknades genom att en poäng gavs för närvaron av var och en av följande observationer: viktminskning > 15%, böjd hållning, rufsig päls, uttorkning, minskad rörelse, utsträckt buk eller ansikts grimas. När en poäng på 3 uppnåddes avlivades mössen humant.
  3. Omedelbart efter eutanasi, utför transkardiell perfusionsfixering med 30-50 ml 10% formalin i en dragskåpa, enligt beskrivningen41. Gör flera små snitt (upp till 1 cm vardera) med sax i den normala delen av levern före perfusion för att generera utlopp för blod och formalin. Vid perfusion kommer leverfärgen att förändras från rött till brunt.
    OBS: Om mikrometastaser i makroskopiskt normala leverområden är föremål för studier, rekommenderar vi forskare att inte skära levern, utan att klippa den överlägsna vena cava istället. Men när vi har använt denna metod verkar fixering av levern sämre jämfört med att skära levern. Speciellt om RNA in situ hybridisering (ISH) är planerad att utföras på leversektioner, rekommenderar vi att du gör snitt i levern före intra-hjärtinjektion av formalin, som beskrivits ovan. Detta möjliggör tillräcklig fixering av levervävnaden, vilket resulterar i bevarande av RNA-integritet för ISH.
  4. Placera levern och lungvävnaderna i 10% formalin och fixera över natten. Byt ut formalin med 70% etanol, följt av paraffininbäddning.
  5. Utför hematoxylin och eosinfärgning för att histologiskt utvärdera tumörområdet. Utför immunohistokemi för stromala markörer av intresse. Utför Picro-Sirus Red-färgning för att utvärdera kollagenpositiva områden.
    IMAGEJ-programvaran42 kan användas för att kvantifiera immunohistokemi och Picro-Sirius Res-färgningsdata. En färgdekonvolutionsfunktion och MR-fibrosverktyget kan användas för att utvärdera 3,3'-diaminobenzidin (DAB)-positiva områden respektive Picro-Sirius rödpositiva områden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att inducera AAV-medierat överuttryck av en tumörbegränsande stromagen, Islr 4,25,43,44, i hepatocyter injicerade vi intravenöst Islr-kodande AAV8. 1,0 x 1011 virala genom (vg) av AAV8-Islr, eller som en kontroll, AAV8-mRuby2, injicerades i den vuxna mussvansvenen (figur 1A). Två veckor efter injektionen av svansvenen skördades lever för att validera överuttrycket av Islr i hepatocyter. Vi utförde RNAscope in situ hybridisering45 och bekräftade att 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) + signaler observerades i hela levern (Figur 1B). Inga DAB+-signaler detekterades i levern från en AAV8-mRuby2-behandlad mus.

Vi övade portalveninjektionsproceduren genom att injicera Indien-bläck (1: 1000 utspädning i PBS). Efter att ha gjort ett snitt i övre buken togs tarmarna försiktigt ut från bukutrymmet för att möjliggöra visualisering av portalvenen (figur 2A). Portalveninjektion av Indien-bläck levererade bläcket i hela levern, men inte till lungan (figur 2B). Om bläcket felaktigt injiceras i andra kärl som den underlägsna vena cava (IVC) eller bukaortan, förändrar systemisk cirkulation av bläcket lungfärgen till svart. Indien bläck hjälper också till att identifiera mängden läckage från portalvenen, vilket indikerar spridning av bukspottkörteln eller bukhinnan.

Två veckor efter injektionen av svansvenen av AAV-mRuby2 dissocierades ApcΔ/Δ och Trp53Δ/Δ koloncancerorganoider (AP-tumöroider) till enstaka celler och injicerades i musportalvenen (figur 3A). För att bekräfta metastatisk tumörtillväxt och utvärdera histologi samlade vi levern 3-4 veckor efter portalveninjektionen (dvs. vid en tidsbesvär snarare än vid en human slutpunkt), innan framträdande nekros förvirrar histopatologiska analyser. Makroskopiskt resulterade portalveninjektionen av tumöroider i flera vita tumörknölar i levern (figur 3B). Vi fann att intra-mjältinjektion av samma cellantal tumoroider inte genererade en stor metastatisk tumörmassa. Detta tyder på att portalveninjektionsmetoden mer effektivt inducerade levermetastaser jämfört med den intra-mjältinjektionsmodellen. Hematoxylin och eosinfärgning av CRC-levermetastaserna inducerade av portalveninjektionen visade histopatologi av måttligt differentierat tubulärt adenokarcinom åtföljt av en desmoplastisk stromalreaktion och nekros (Figur 3C). Denna stromarika histologi rekapitulerade troget den hos humana CRC-levermetastaser (figur 3C), vilket gör denna modell lämplig för translationell forskning som undersöker den metastatiska tumörstroma. Dessutom visade immunohistokemi för alfa-glattmuskelaktin (αSMA), en väletablerad markör för CAF, att cirka 7% av tumörområdena var αSMA-positiva, vilket bekräftade närvaron av CAF i denna musmodell (Figur 3D,E). Picro-Sirius rödfärgning som fläckar kollagen46 visade riklig ECM i tumörmesenkymet med cirka 13% av tumörområdena positiva för kollagen (Figur 3D,E). Immunohistokemi för EPCAM, en epitelial härstamningsmarkör, avslöjade att den metastatiska CRC visade tumörspirande (en enda tumörcell eller ett cellkluster med upp till fyra tumörceller) som är ett kännetecken för dålig prognos kolorektal cancer47 (Figur 3F). Ki67-märkningsindex i den metastatiska CRC var cirka 80%, vilket indikerar att de flesta tumörceller är mitotiskt aktiva (Figur 3G,H).

Vi utförde analyser av musöverlevnad och tumörtillväxtkinetik i denna prekliniska modell. Mössen i vår första pilotkohort visade en medianöverlevnad på 57 dagar efter tumöroidinjektion i portalvenen (N = 4 möss; Figur 4A). Detta replikerades senare i större kontroll AAV8-mRuby2-injicerade grupper25. Vid humant effektmått (som visas i NOTE, steg 5.2) visade 3 av 4 möss i pilotgruppen ascites, vilket också observeras hos patienter med avancerad levermetastas48. För att bedöma tumörtillväxten användes in vivo imaging system (IVIS) för att mäta tumöroid-härledd luminescens (figur 4B,C). Bioluminescenssignalerna observerades i övre buken, vilket tyder på leverspecifik tumörtillväxt (figur 4B). Om IVIS-signaler observeras i underlivet indikerar detta peritoneal spridning eller sekundära metastaser till bukorganen. Den veckovisa in vivo-avbildningen möjliggjorde en longitudinell bedömning av tumörtillväxt i varje mus (figur 4C), vilket gjorde det lättare att övervaka en terapeutisk effekt i vår efterföljande större studie. Tumörintagshastigheten var 100% (4/4 möss) enligt IVIS-signaler. I detta experiment observerades ingen makroskopiskt uppenbar lungmetastas vid tidpunkten för vävnadsuppsamling (0/4 möss).

Slutligen undersökte vi om AAV-medierade hepatocytriktad leverans av en cancerbegränsande CAF-gen, Islr 4,25, kunde hämma CRC-levermetastastillväxt i denna prekliniska musmodell. I synnerhet visade AAV8-Islr-behandlade möss förbättrad musöverlevnad och minskade IVIS-signaler från tumörer (figur 5A-C)25. Immunohistokemi för fosforylerad Smad1/5/8 visade att hepatocytöveruttryck av ISLR, en BMP-signalpotentiator, förstärkt BMP-signalering i metastatiska tumörer (Figur 5D). Behandling med AAV8-Islr minskade antalet Ki67+ prolifererande celler i CRC-levermetastasen (figur 5E). För fullständig beskrivning av resultaten, se Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Våra kollektiva data indikerar att AAV8-medierad leverans av en tumörhämmande gen till hepatocyter, en viktig beståndsdel i levermetastatisktumörstroma 29, kan vara ett effektivt förebyggande / terapeutiskt tillvägagångssätt för CRC-levermetastaser (Figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Svansvenadministrerad AAV8-Islr genererar Islr-överuttryck i levern. (A) Experimentellt schema som visar injektion av AAV8 i svansvenen, följt av portalveninjektion av organoider av kolorektal cancer (CRC). ISH, in situ hybridisering; IHC, immunohistokemi; qRT-PCR, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid. (B) Representativa bilder. RNA in situ hybridisering för Islr utfördes med användning av lever från AAV8-Islr eller AAV8-mRuby2-behandlade möss. Levern samlades in 2 veckor efter injektion av svansvenen. Skalstänger, 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Portalveninjektion av Indien-bläck resulterar i leverans till levern, men inte lungan. (A) Representativa bilder som visar anatomi i övre buken efter laparotomi. Observera att för visualisering av portalvenen tas tarmarna utanför bukhålan. Den högra sidobilden visar en anatomisk anteckning av varje organ och kärl. Den gula pilen betecknar injektionsstället. IVC, Sämre vena cava. (B) Representativa bilder av levern och lungan efter portalveninjektion av Indien-bläck. De gula pilspetsarna indikerar fartyg färgade med Indien-bläcket. Skala staplar, 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Portalveninjektion av kolorektal cancerorganoider genererar stromarika levermetastaser. (A) Experimentellt schema som visar portalveninjektion av ApcΔ / Δ och Trp53Δ / Δ koloncancerorganoider (AP-tumöroider). Skala bar, 200 μm. T, tumöroider. (B) Representativa makroskopiska bilder av levern som samlades in 3-4 veckor efter portalveninjektion (vänster) eller intra-mjältinjektion (höger). 5,0 x 105 enstaka celler från AP-tumöroider injicerades i portalvenen eller mjälten. Intra-mjältinjektion utfördes enligt beskrivningen13. Vita knölar indikerar tumörer. T, tumör; N, Normal lever. (C) Representativa hematoxylin- och eosin (H&E) färgningsbilder av CRC-levermetastaserna från portalveninjektionsmusmodellen (vänster och mitten) och människa (höger). T, tumör; N, Normal lever; S, Stroma; Nec, nekros. Den gula prickade linjen indikerar en gräns mellan tumören och normal lever (vänster). (D och E) Immunohistokemi (IHC) för alfa-glattmuskelaktin (αSMA; vänster) och Picro-Sirius rödfärgning (höger). (D) Representativa bilder. (E) Kvantifiering av αSMA-positiva områden (vänster) och Picro-Sirius rödpositiva områden (höger). N = 4 möss, 5 HPF (High Power Fields; 400x)/mus. (F) Representativ bild som visar immunohistokemi för EPCAM, en epitelcellmarkör. De gröna prickade linjerna betecknar tumörspirande. (G och H) Immunohistokemi för Ki67, en cellproliferationsmarkör. (G) Representativ bild. (H) Procentandel Ki67+ celler i totala epitelceller. Epitelceller visualiserades genom hematoxylin-motfärgning. N = 4 möss, 5 HPF/mus. I (B)-(H) samlades alla muslevervävnader in 3-4 veckor efter injektion av AP-tumöroider. Medelvärde ± S.E.M. Varje prick representerar ett medelvärde på 5 HPF från en mus (E och H). Skalstänger representerar 1 cm (B), 1 mm (C; vänster), 100 μm (C; mitten och höger) och 50 μm (D, F och G). Observera att studien med mänskliga vävnader godkändes av etikkommittén vid Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Överlevnadsanalys och tumörtillväxtkinetisk analys genom in vivo-avbildning . (A) Kaplan-Meier överlevnadskurvor. N = 4 möss. (B,C) In vivo imaging system (IVIS) användes för att utvärdera tumörtillväxtkinetik. (B) En representativ bild. Området i den röda rutan användes för kvantifiering. (C) Tillväxtkinetik. Luciferase-signaler från varje mus visas. N = 4 möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: AAV8-medierade genleveranser av Islr till hepatocyter ökar BMP-signalering, minskar tumörproliferation och förbättrar musöverlevnaden i en portalveninjektionsmodell av CRC-levermetastasering. (A) Kaplan-Meier överlevnadskurva. Två veckor efter injektion av AAV-Islr eller AAV-mRuby2 utfördes portalveninjektion av CRC-tumöroider. (B och C) Tumöroid-härledda luciferassignaler utvärderades med hjälp av IVIS. (B) Representativ bild. C) Kvantifiering av IVIS-signaler. N = 5 (AAV-mRuby2) och 8 (AAV-Islr) möss. Genomsnittliga ± S.E.M. (D) Representativa bilder. Immunohistokemi (IHC) för fosforylerad Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 är en nedströms molekyl av benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering som fosforyleras vid BMP-signalaktivering49. N = 4 möss vardera. (E) Representativa bilder. Immunohistokemi för Ki67. N = 4 möss vardera. (F) Grafisk sammanfattning. AAV-medierade hepatocytriktad genleverans av en cancerbegränsande stromagen kan fungera som en terapeutisk strategi för att hämma CRC-metastagenes. AAV8-medierade överuttryck av Islr i hepatocyter ombyggde den metastatiska nischen genom att öka BMP-signalering och begränsad CRC-metastasprogression. För detaljerad information, se Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Log-rank test (A) och tvåvägs upprepade mått ANOVA (analys av varians) med post-hoc Sidaks multipeljämförelsetest vid vecka 3 (C). Figur 5A-C har tryckts om från Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie har vi visat att portalveninjektion av mus CRC-organoider reproducerbart genererar fibroblastrika levermetastaser som efterliknar histologiska egenskaper hos humana CRC-levermetastaser. Dessutom, i kombination med stroma-riktade terapier som AAV8-medierade genterapi, fungerar denna prekliniska modell som ett användbart verktyg för att bedöma terapeutiska effekter på musöverlevnad och tumörtillväxt.

Det finns åtminstone två kritiska steg i protokollet. För det första är det viktigt att förbereda en encellig suspension av tumöroider genom att helt trypsinisera organoiderna och använda ett nätfilter för att avlägsna cellklumpar. Ofullständig dissociation av tumöroider resulterar i stora cellaggregationer, vars injektion kan täppa till portalvenen. Detta orsakar infarkt i levern och djurdöd22. För det andra, under portalveninjektion, är det absolut nödvändigt att minimera blödningen från portalvenen. Nålen ska sättas in ordentligt i portalvenen. För att undvika punktering av den andra sidan av portalvenen bör vinkeln på den införda nålen hållas nästan parallell med portalvenen. För att förhindra rivning av portalvenen under injektionen ska nålen inte flyttas när den är helt införd i portalvenen. Omedelbart efter att nålen har tagits bort från portalvenen är det viktigt att applicera tryck på injektionsstället med en bomullsknopp i minst 5 minuter.

Cellnumret för injektion måste modifieras enligt mottagarmusen (t.ex. immunkompetent kontra immunbrist mus) och tumörframkallande hos organoidlinjen. I våra experiment var injektion av 5,0 x 105 enskilda celler i 100 μL suspension tillräcklig för att generera levermetastaser hos immunkompetenta möss. Att öka cellantalet kan öka risken för emboli i portalvenen och död hos djur14, och bör därför noggrant övervägas. Med tanke på att tidigare papper använde 5 x 104 till 5 x 105 celler i 100 μL för tumöroidinjektion i portalen eller mesenterisk ven 25,26,27,28, anser vi att detta cellnummerområde skulle vara en bra utgångspunkt för optimering.

En begränsning av portalveninjektionsmetoden är att den inte helt rekapitulerar hela kaskaden av CRC-metastagenes. Levermetastasering av cancer kräver fem huvudsteg: (1) cancercellinvasion på den primära platsen, (2) intravasation i kärlet, (3) cellöverlevnad i portalcirkulationen, (4) extravasering från portalvenen till leverparenkym och (5) kolonisering i den metastatiska nischen50. Portalveninjektionsmodellen tillåter endast undersökning av steg (3)-(5). För att få insikt i de andra metastatiska processerna är det nödvändigt att använda andra modeller som in vitro-modeller och / eller en Notch1-mutant primär CRC-musmodell som ofta metastaserar till levern51.

Betydelsen av portalveninjektionsmetoden med avseende på de befintliga metoderna inkluderar leverspecifik tillväxt och högre tumörbörda. Peritoneal spridning i andra injektionsmodeller och primär tumörtillväxt i primära CRC-modeller kan förvirra analysen av levermetastasprogression. Däremot genererar vår portalvenmetod snabbt leverspecifika tumörer, vilket förenklar överlevnads- och tumörtillväxtanalyser.

En stor fördel med organoidtransplantation jämfört med cellinjeinjektion är att portalveninjektion av tumöroider genererade den fibroblastrika tumörmikromiljön som fenokopierar en desmoplastisk egenskap hos mänsklig metastatisk CRC. Organoidodlingsförhållanden rekapitulerar egenskaper hos tumörmikromiljön och stöder tarmstamcellspopulationer, inklusive inbäddning av celler i en rik och komplex 3D ECM med en definierad kombination av tillväxtfaktorer24,52. Detta resulterar i tumörcellsförökning på ett sätt som bevarar det genetiska landskapet för källtumören52,53. Däremot är traditionell 2D-odling av tumörcellinjer associerad med klonalt urval och avvikande genomiska / transkriptomiska förändringar som inte troget återspeglar egenskaperna hos de ursprungliga cancerformerna54. Vi spekulerar i att de relativt hårda odlingsförhållandena för 2D-odling av cancercellinjer tvingar celler att anpassa sig till brist på ECM / tillväxtfaktorsignaler som då kan resultera i stroma-dåliga tumörer in vivo, eftersom cellerna inte längre kräver stroma-härledda signaler för överlevnad.

Genom att kombinera organoidportalveninjektionsmodellen med AAV8-medierade genterapi fann vi att leverans av en cancerhämmande nyttolast till hepatocyter före cancercellkolonisering i levern kunde modifiera (pre-) metastatisk nisch för att hämma CRC-metastastillväxt25. Uppmuntrande nog har kliniska prövningar visat att AAV-medierad in vivo-genöverföring till levern inducerar långsiktigt uttryck av en transgen och kan vara en effektiv och säker metod för att behandla icke-neoplastiska genetiska sjukdomar 30,31,55. I framtiden kan utnyttjande av hepatocyter för att förhindra levermetastaser genom AAV-metoden ha potentiellt kliniskt värde hos cancerpatienter med hög risk för metastaser.

Sammanfattningsvis visar vårt papper att CRC-organoidtransplantation via portalvenen genererar fibroblastrika levermetastaser, som kan utnyttjas för utveckling av terapeutiska strategier riktade mot stroma. Genom att koppla portalveninjektionen med stroma-riktad terapi som AAV-medielad genleverans kan man identifiera nya stromala mål för att begränsa CRC-metastasprogressionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från National Health and Medical Research Council (APP1156391 till D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 till D.L.W., APP1140236 till S.L.W., APP1099283 till D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project på uppdrag av sina givare och delstatsregeringen i södra Australien genom Department of Health (MCF0418 till S.L.W., D.L.W.); ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) (20H03467 till M.T.) på uppdrag av Japans ministerium för utbildning, kultur, idrott, vetenskap och teknik; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 och 19gm1210008s0101 till A.E.); projektet för cancerforskning och terapeutisk evolution (P-CREATE) från AMED (19cm0106332h0002 till A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (till H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (till H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (till H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (till K.G.).

Vi tackar Dr. Leszek Lisowski vid Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) för att producera rekombinanta AAV-vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Tags

Cancerforskning utgåva 175
Portalveninjektion av kolorektal cancerorganoider för att studera levermetastasen Stroma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter