Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Abstract

Les métastases hépatiques du cancer colorectal (CCR) sont l’une des principales causes de décès liés au cancer. Les fibroblastes associés au cancer (CAF), une composante majeure du microenvironnement tumoral, jouent un rôle crucial dans la progression du CCR métastatique et prédisent un mauvais pronostic du patient. Cependant, il y a un manque de modèles murins satisfaisants pour étudier la diaphonie entre les cellules cancéreuses métastatiques et les CAF. Ici, nous présentons une méthode pour étudier comment la progression des métastases hépatiques est régulée par la niche métastatique et pourrait éventuellement être contenue par un traitement dirigé par le stroma. L’injection veineuse portale d’organoïdes du CCR a généré une réaction desmoplastique, qui a fidèlement récapitulé l’histologie riche en fibroblastes des métastases hépatiques du CCR humain. Ce modèle était spécifique au tissu avec une charge tumorale plus élevée dans le foie par rapport à un modèle d’injection intra-splénique, simplifiant les analyses de survie de la souris. En injectant des organoïdes tumoraux exprimant la luciférase, la cinétique de croissance tumorale pourrait être surveillée par imagerie in vivo . De plus, ce modèle préclinique fournit une plate-forme utile pour évaluer l’efficacité des thérapies ciblant le mésenchyme tumoral. Nous décrivons des méthodes pour examiner si l’administration par un virus adéno-associé d’un gène stromal inhibiteur de tumeur aux hépatocytes pourrait remodeler le microenvironnement tumoral et améliorer la survie de la souris. Cette approche permet le développement et l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour inhiber les métastases hépatiques du CCR.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est une cause majeure de mortalité par cancer dans le monde1. Plus de la moitié des patients atteints de CCR développent des métastases hépatiques qui se produisent par la dissémination de la veineporte 1. Actuellement, il n’existe aucun traitement efficace capable de guérir les métastases hépatiques avancées, et la plupart des patients succombent à une maladie métastatique.

La niche métastatique ou le microenvironnement tumoral joue un rôle clé dans la greffe et la croissance des cellules CCR disséminées2. Les fibroblastes associés au cancer (CAF), un composant important du microenvironnement tumoral, favorisent ou freinent la progression du cancer en sécrétant des facteurs de croissance, en remodelant la matrice extracellulaire (ECM) et en modulant les paysages immunitaires et l’angiogenèse 3,4,5. Les CAF confèrent également une résistance aux chimiothérapies et aux immunothérapies3. De plus, les CAF régulent l’initiation et la progression des métastases hépatiques du CCR et prédisent le pronostic chez les patients atteints deCCR 3,6,7,8. Ainsi, les facteurs liés au CAF pourraient être exploités pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber les métastases hépatiques du CCR. Cependant, le manque de modèles murins satisfaisants pour étudier le stroma tumoral métastatique a été un obstacle majeur au développement de thérapies ciblées sur le stroma.

Actuellement, les modèles animaux pour étudier les métastases hépatiques du CCR comprennent des modèles primaires de CCR qui développent spontanément des métastases hépatiques et des modèles de transplantation de cellules cancéreuses dans le foie. Les modèles murins primaires du CCR, tels que les modèles murins génétiquement modifiés et l’injection colique de cellules cancéreuses, montrent rarement des métastases au foie 9,10,11,12. De plus, même si une métastase hépatique est observée, ces modèles montrent une longue latence de l’induction de la tumeur primaire à la métastase, et potentiellement mourir de la charge tumorale primaire12. Pour générer efficacement des métastases hépatiques CRC, les cellules CRC cultivées sont transplantées dans le foie en utilisant trois approches d’injection: injection intra-splénique, injection intra-parenchymateuse directe dans le foie et injection de veine porte. Les cellules cancéreuses injectées par voie intra-splénique se propagent dans la veine splénique, la veine porte et, finalement, dans le foie13,14. Cependant, l’injection intra-splénique donne un rapport de prise tumorale inférieur à celui d’autres modèles de transplantation15,16. Avec l’injection intra-splénique, l’ablation chirurgicale de la rate est effectuée pour éviter la croissance du cancer dans la rate, ce qui peut potentiellement compromettre la maturation des cellules immunitaires17. En outre, l’injection intra-splénique peut également entraîner une croissance tumorale involontaire dans la rate et la cavité abdominale18, ce qui complique les analyses de métastases hépatiques. L’injection intra-parenchymateuse directe dans le foie induit efficacement des métastases hépatiques 16,19,20. Néanmoins, cette approche ne récapitule pas complètement une étape biologique de la métastase hépatique qui se produit naturellement par la dissémination de la veine porte. En utilisant l’injection directe dans le foie, l’entrée des cellules cancéreuses dans un non-portail, mais la circulation systémique peut également entraîner plusieurs grandes métastases pulmonaires16. Bien qu’une majorité de patients atteints de métastases hépatiques CRC présentent plusieurs nodules tumoraux dans le foie21, l’injection directe dans un lobe hépatique spécifique génère une seule masse tumorale19,20. L’injection de veine porte ou injection de veine mésentérique, bien que techniquement difficile, permet une livraison efficace des cellules tumorales dans le foie d’une manière qui récapitule les modèles de croissance observés chez les patients17. Cette stratégie peut minimiser la possibilité de métastases au site secondaire et permet une croissance rapide des cellules cancéreuses dans le foie, simplifiant ainsi les analyses de survie des souris.

Historiquement, des lignées cellulaires de cancer colorectal telles que la souris MC-38, le HT-29 humain et le SW-620 ont été utilisées pour générer des modèles murins de métastases hépatiques22,23. Cependant, ces lignées cellulaires de cancer colorectal n’induisent pas de réaction stromale desmoplastique. La faible teneur stromale dans les tumeurs rend difficile l’étude des rôles biologiques des fibroblastes associés au cancer. Les progrès récents dans les organoïdes du CCR et leur transplantation ont offert des plateformes utiles pour évaluer les rôles vitaux du stroma dans la progression du cancer24. La transplantation hépatique d’organoïdes du CCR génère un microenvironnement tumoral riche en fibroblastes et a fourni de nouvelles informations sur la recherchestromale 6,25. Actuellement, l’injection veineuse portale ou mésentérique d’organoïdes est devenue une approche de référence pour générer des métastases hépatiques CRC 6,25,26,27,28. Néanmoins, à notre connaissance, aucun article précédent n’a décrit de méthodes détaillées pour l’injection veineuse porte de tumoroïdes colorectaux. Nous présentons ici une méthodologie pour l’utilisation de l’injection veineuse portale d’organoïdes du CCR pour développer un nouveau traitement dirigé par le stroma médié par le virus adéno-associé (AAV).

Les hépatocytes sont un constituant important du microenvironnement tumoral métastatique dans le foie et jouent un rôle essentiel dans la progression du cancer métastatique29. Inspirés par le succès des approches de thérapie génique AAV pour induire l’expression des protéines dans les hépatocytes chezles patients non néoplasiques 30,31, nous avons étudié une approche similaire mais visant à modifier le microenvironnement de la tumeur du foie dans leCCR 25. En tant que tel, nous décrivons également ici l’injection de veine caudale d’AAV8 pour induire l’expression de protéines anti-tumorigènes afin de modifier le microenvironnement de la tumeur du foie. Le sérotype AAV8, désigné par le choix de la protéine de capside virale lors de la production du virus, conduit à une efficacité de transduction élevée spécifiquement des hépatocytes (c’est-à-dire l’expression génique ciblée dans le microenvironnement de la tumeur hépatique)32. Nous avons déjà montré que Islr (superfamille d’immunoglobulines contenant une répétition riche en leucine) est un gène spécifique du CAF qui induit la signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP), réduit la croissance des tumoroïdes du CCR et favorise la différenciation des cellules souches intestinales Lgr5+ 25. Nous avons testé si la surexpression médiée par AAV8 du gène stromal limitant le cancer, Islr, dans les hépatocytes pouvait atténuer la progression des métastases hépatiques en effectuant une injection veineuse porte de tumoroïdes CRC chez des souris traitées par AAV8-Islr.

Dans cet article, nous décrivons d’abord la procédure d’injection de la veine caudale de l’AAV tropicale hépatique. Ensuite, nous décrivons une méthode de préparation de cellules tumoroïdes et d’injection de veine porte chez les souris traitées par AAV. Enfin, nous présentons des approches pour surveiller la progression tumorale métastatique afin d’évaluer l’efficacité des thérapies dirigées par le stroma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans cet article ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut de recherche médicale et de santé d’Australie-Méridionale (numéro d’approbation, SAM322).

1. Injection dans la veine caudale du virus adéno-associé

REMARQUE : Le virus adéno-associé (VAA) doit être traité comme un risque biologique conformément aux lignes directrices sur le niveau de biosécurité 1. Veuillez vous référer au protocole publié pour la préparation, la purification et le titrage de l’AAV33. L’AAV hépatocytaire-tropique, AAV834, codant pour le gène promoteur du cytomégalovirus (CMV) Islr , a été utilisé dans cette étude25. Pour induire une surexpression médiée par l’AAV, le dosage de l’AAV peut nécessiter une optimisation en fonction de l’activité du promoteur, du gène et du poids de la souris.

  1. Diluer le vecteur AAV dans des aliquotes de 150 μL contenant 1,0 x 1011 génomes viraux, en utilisant une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et le maintenir sur la glace. L’équipement de protection individuelle doit être porté pour manipuler le VAA.
    REMARQUE: Le cycle répété de gel et de dégel diminue le titre du virus et doit être évité. La solution virale mère doit être conservée dans un congélateur à -80 °C.
  2. Allumez une boîte chauffante (chambre de réchauffement pour animaux) pour préchauffer à 35 °C.
  3. Tenez une souris et appliquez une crème d’anesthésie topique sur toute la longueur de la queue au moins 15 minutes avant l’injection de la veine caudale.
    REMARQUE: Il s’agit d’une étape facultative et peut ne pas être nécessaire si elle n’est pas requise par le comité d’éthique animale de l’institut. Suivez le protocole approuvé par le comité local d’éthique animale. Dans cette expérience25, une souris Rosa26-Cas9 a été utilisée pour l’injection d’AAV et l’injection ultérieure de veines portes d’organoïdes CRC. Étant donné que les tumoroïdes utilisés dans cette étude étaient dérivés d’une souris Rosa26-Cas9 (fond génétique C57BL / 6 x 129), cette souche de souris a également été utilisée comme receveurs immunocompétents et syngéniques de la greffe tumorale. Des souris Rosa26-Cas9 mâles et femelles (âgées de 6 à 24 semaines) ont été utilisées.
  4. Placez la souris dans la boîte chauffante. Laissez la souris jusqu’à 15 minutes pour réchauffer et dilater les veines de la queue.
  5. Fixez doucement la souris dans un dispositif de retenue pour rongeurs. Placez la queue sous une lampe chauffante pour assurer la dilatation complète des veines de la queue.
  6. Prélever 150 μL d’AAV dilué (préparé à l’étape 1.1) dans une seringue stérile à faible espace mort avec une aiguille de 27 à 30 G.
  7. Déplacez la lampe chauffante et identifiez la veine latérale de la queue située sur les côtés de la queue. Mettez une légère tension sur la queue avec les doigts pour que la queue devienne droite.
  8. Insérez lentement 2-3 mm de l’aiguille, biseautez vers le haut, dans la veine. L’aiguille doit être presque parallèle à la queue (jusqu’à 15° de la queue).
    REMARQUE: Un afflux de sang dans la seringue peut être observé si l’aiguille est correctement localisée dans la veine.
  9. Injecter lentement. Si une résistance est ressentie ou si un gonflement de la peau est observé, retirez l’aiguille et réinsérez-la au-dessus du premier site ou dans l’autre veine latérale.
  10. Attendez environ 5 secondes après la fin de l’injection, puis retirez lentement l’aiguille. Appliquez immédiatement une légère pression sur le site d’injection avec une gaze propre ou une serviette en papier jusqu’à ce que le saignement cesse.
  11. Relâchez doucement la souris dans sa cage. Surveillez l’animal pour vous assurer que le saignement a cessé.
    REMARQUE: La surexpression des gènes dans le foie peut être évaluée 1 à 2 semaines après l’injection de la veine caudale AAV. Cela peut être confirmé, par exemple, par hybridation in situ de l’ARN (ISH), l’immunohistochimie (IHC), le transfert western ou la réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase (qRT-PCR; Figure 1A,B). Dans une étude25 publiée précédemment, AAV8-Islr a été utilisé pour surexprimer le gène Islr de souris dans les hépatocytes et la surexpression a été détectée par l’ARN ISH (Figure 1A, B).

2. Préparation cellulaire des organoïdes du cancer colorectal

REMARQUE: Les organoïdes CRC utilisés pour cette expérience contiennent uniquement des cellules épithéliales. La culture et la génération d’organoïdes du CCR ont déjà été décrites25,35. En bref, des cellules épithéliales coliques normales ont été isolées du côlon d’une souris Rosa26-Cas9 à l’aide d’un tampon d’isolement de crypte (5 mM EDTA (éthylènediaminetétraacétate) dans un PBS glacé), puis incorporées dans un milieu de matrice membranaire basale et cultivées dans un milieu de croissance organoïde tel que décrit à la référence35. Ensuite, les mutations Apc et Trp53 ont été introduites dans les cellules épithéliales du côlon en surexprimant des ARN à guide unique qui ciblent Apc et Trp53 en utilisant le protocole d’expression du lentivirus. Des clones organoïdes uniques ont été triés surle volet 25. UnpcΔ/Δet Trp53Δ/Δ organoïdes du cancer du côlon (ap tumoroïdes), ont été injectés sous forme de 5,0 x 105 cellules uniques dans 100 μL de PBS avec 10 μM Y-27632 dans la veine porte par souris, avec culture organoïde et préparation unicellulaire décrite ci-dessous.

  1. Cultiver les organoïdes CRC dans les dômes de la matrice de la membrane basale dans une plaque de 24 puits ou un plat de 10 cm 3 à 5 jours avant l’injection de la veine porte pour obtenir des organoïdes de 50 à 400 μm de diamètre.
  2. Préparer une quantité suffisante de solution de détachement cellulaire en ajoutant Y-27632 à une concentration de 10 μM, suffisante pour digérer le nombre d’organoïdes cultivés pour l’injection. Préchauffer au bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE: La solution de détachement cellulaire utilisée dans ce protocole est un mélange d’enzymes de dissociation cellulaire recombinante et est utilisée comme substitut de la trypsine en culture organoïde (voir Tableau des matériaux). Il réduit les dommages cellulaires causés par la dissociation cellulaire par rapport à la trypsine36. Y-27632 est un inhibiteur de la Rho kinase et inhibe la mort cellulaire induite par la dissociation, augmentant ainsi la survie unicellulaire37.
    1. Pour l’injection dans un maximum de cinq souris, préparer deux tubes contenant 40 mL de la solution de détachement cellulaire pour digérer 10-24 x 50 μL de dômes matriciels de membrane basale avec chaque dôme contenant environ 300 organoïdes (50-400 μm de diamètre), c’est-à-dire que chaque souris est injectée avec 2-4,8 dômes d’organoïdes (équivalent à environ 600-1440 organoïdes). Le nombre d’organoïdes nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de cellules dépend de la lignée organoïde et doit donc être optimisé.
      REMARQUE: Le deuxième tube de 40 mL permet une digestion répétée avec une solution de détachement de cellules fraîches pour obtenir des cellules individuelles dissociées.
  3. Aspirer soigneusement le milieu organoïde de chaque puits.
  4. Ajouter 1 mL de PBS glacé à chaque puits dans une plaque de 24 puits. Si un plat de 10 cm est utilisé, ajoutez 10 mL de PBS glacé au plat.
  5. Grattez le milieu de la matrice de la membrane basale à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Transférer la boue PBS/moyenne dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
  6. Rincez chaque puits avec la même quantité de PBS pour recueillir les fragments de matrice de la membrane basale et ajoutez-les au(x) tube(s) de 15 mL.
  7. Incuber pendant 5 min sur de la glace. Cette incubation aide à dissoudre le milieu de la matrice de la membrane basale.
  8. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
  9. Aspirer le surnageant en veillant à ne pas perturber le milieu aggloméré et les cellules.
  10. Ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire préchauffée préparée à l’étape 2.2 à la pastille, remettre la pastille 10 fois et la transférer dans un tube de 50 mL contenant une solution fraîche de détachement cellulaire préchauffée.
  11. Placez le tube dans le bain-marie à 37 °C. Incuber pendant 5 min.
  12. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 3 min à 4 °C.
  13. Répétez les étapes 2.9 à 2.11.
    REMARQUE: La digestion enzymatique répétée permet une dissociation cellulaire efficace en cellules individuelles.
  14. Vérifiez si les organoïdes sont dissociés en cellules individuelles en pipetant 100 μL dans une plaque de 96 puits et en observant au microscope. Si de nombreux organoïdes présentent des amas cellulaires constitués de plus de quatre cellules, une incubation plus longue avec la solution de détachement cellulaire et une dissociation physique par trituration avec une pipette de 10 mL peuvent être nécessaires.
  15. Une fois que la plupart des cellules sont des cellules individuelles, ajoutez 4 mL de sérum fœtal bovin (FBS) dans la suspension cellulaire de 40 mL pour arrêter la digestion. Rincer une passoire cellulaire de 40 μm avec 5 mL de PBS.
  16. Passez la suspension cellulaire à travers la passoire cellulaire dans un tube de collecte de 50 mL pour éliminer les amas cellulaires.
  17. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
  18. Aspirer le surnageant. Ajouter 10 mL de PBS froid à la pastille de la cellule et transférer dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
  19. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
  20. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans du PBS froid de 500 μL avec 10 μM Y-27632. Comptez les cellules.
  21. Ajuster la concentration de la cellule à 5,0 x 105 cellules individuelles/100 μL, en utilisant PBS avec 10 μM Y-27632. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce que l’injection de la veine porte soit effectuée.
    REMARQUE: Il est recommandé d’injecter des cellules dissociées dans les 4 heures suivant la dissociation.

3. Injection dans la veine porte d’organoïdes du CCR

REMARQUE: Tous les instruments chirurgicaux et les gazes chirurgicales doivent être autoclavés ou stérilisés avant la chirurgie. Ce protocole est modifié par rapport à un protocoleprécédent 17. Dans cette expérience25, l’injection de veine porte a été réalisée à l’aide de souris Rosa26-Cas9 traitées par AAV-mRuby2 ou AAV-Islr à l’étape 1.

  1. Préparez une zone chirurgicale aseptique à l’aide de rideaux stériles sur un coussin chauffant.
  2. Préparez des instruments chirurgicaux (ciseaux et forceps), une éponge chirurgicale et hémostatique, une suture de polyglactine 4-0, des cotons-tiges, des agrafeuses pour la peau, un applicateur d’agrafeuse, une solution saline, de la buprénorphine et une aiguille de 33 G attachée à une seringue Hamilton. Coupez l’éponge hémostatique en morceaux de 1,0 cm x 1,0 cm.
  3. Ajustez la position de la source lumineuse pour éclairer la zone chirurgicale.
  4. Injecter 0,1 mg/kg de poids corporel de buprénorphine par voie sous-cutanée à une souris pour la gestion chirurgicale de la douleur.
  5. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane dans une chambre d’anesthésie. La concentration d’isoflurane pour l’induction et l’entretien est généralement de 5% et 2,5%, respectivement. Vérifiez l’absence de réaction au pincement des orteils avant de commencer la procédure suivante.
  6. Rasez le milieu jusqu’au haut de l’abdomen de la souris avec un rasoir électrique. Le rasage doit être effectué dans une zone éloignée de la zone chirurgicale aseptique pour éviter que les cheveux ne contaminent le site.
  7. Nettoyez le site d’incision en alternant avec de la bétadine et de l’éthanol à 80% pour stériliser la zone chirurgicale. Répétez trois fois.
  8. Placez la souris sur un coussin chauffant en position couchée avec anesthésie à l’isoflurane d’entretien. Placez un drap chirurgical avec un trou sur l’abdomen de la souris.
  9. Soulevez la peau abdominale avec une pince et faites une incision cutanée de 2 à 3 cm à la ligne médiane avec des ciseaux, en coupant uniquement la peau (pas le péritoine sous-jacent). L’incision doit aller du milieu de l’abdomen au processus xiphoïde du sternum. L’incision ne doit pas dépasser l’extrémité inférieure du processus xiphoïde.
  10. Soulevez complètement la paroi péritonéale avec une pince et faites une incision similaire de 2 à 3 cm au péritoine avec des ciseaux. Évitez de couper l’intestin et le diaphragme.
  11. Faites tremper la gaze chirurgicale avec une solution saline chaude et placez-la sur le côté gauche de l’incision (sur le côté gauche du corps de la souris; à la droite du chirurgien).
  12. Retirez doucement les organes internes (petit et gros intestin) à l’aide d’un coton-tige imbibé de solution saline. Placez les intestins sur la gaze imbibée de solution saline.
    REMARQUE: Les intestins du côté gauche de la souris (c’est-à-dire les intestins à la droite du chirurgien) doivent d’abord être retirés, puis les intestins du côté droit de la souris (c’est-à-dire les intestins à gauche du chirurgien) peuvent être retirés.
  13. Ajustez la position des intestins pour visualiser la veine porte. Couvrez les intestins avec de la gaze humide supplémentaire pour garder les intestins humides.
  14. Tirez doucement l’intestin vers le côté gauche avec la gaze humide et appliquez une légère tension sur la gauche. Cela facilite la visualisation de la veine porte (Figure 2A).
    REMARQUE: Si la visualisation de la veine porte est difficile, ajuster doucement la position de l’estomac avec un coton-tige humide pourrait aider la visualisation.
  15. Pipettez doucement la suspension tumoroïde plusieurs fois pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Aspirer lentement 100 μL de la suspension cellulaire dans une seringue Hamilton attachée à une aiguille de 33 G. Évitez les bulles d’air.
  16. Insérez lentement l’aiguille, en biseau vers le haut, dans la veine porte. La profondeur d’insertion le long de l’aiguille doit être de 3-4 mm, avec l’angle de l’aiguille presque parallèle à la veine porte.
    REMARQUE: L’injection doit être effectuée dans la partie bien visualisée de la veine porte (généralement jusqu’à 2 cm du hile hépatique). Évitez le mouvement de l’aiguille après son insertion complète dans la veine porte.
  17. Injecter des cellules tumorales pendant 30 s. L’injection doit être effectuée lentement pour éviter l’occlusion de la veine porte. Si l’injection réussit, la couleur du foie passe temporairement du rouge au blanc.
  18. Retirez l’aiguille lentement. Appliquez immédiatement une légère pression sur le site d’injection avec un coton-tige sec et attendez 5 min.
  19. Retirez le coton-tige et appliquez simultanément une éponge hémostatique sur le site d’injection. Tenez l’éponge hémostatique avec un coton-tige ou une pince et appliquez une légère pression pendant 5 minutes de plus.
  20. Retirez la pression sur l’éponge hémostatique et confirmez qu’il n’y a pas de saignement du site d’injection.
    REMARQUE: L’éponge hémostatique bio-résorbable n’a pas besoin d’être retirée. Essayer d’enlever la gaze pourrait provoquer un nouveau saignement du site d’injection.
  21. En cas de saignement, effectuez immédiatement une hémostase sous pression avec un coton-tige pendant environ 10 minutes. Ensuite, appliquez une éponge hémostatique supplémentaire pendant 5 minutes supplémentaires.
    NOTE: Si une perte de sang incontrôlable est observée, la souris doit être euthanasiée conformément au protocole approuvé par le comité d’éthique animale de l’institut.
  22. Enlevez les gazes chirurgicales sur les intestins. À l’aide d’une seringue remplie de 5 ml de solution saline, versez une solution saline dans les intestins pour empêcher l’adhésion des organes.
    REMARQUE: Ne pas appliquer de solution saline sur le site d’injection de la veine porte. Cela pourrait provoquer de nouveaux saignements.
  23. Replacez doucement les intestins à l’intérieur de la cavité abdominale.
  24. Suturez le péritoine à l’aide de sutures de polyglactine 4-0.
  25. Soulevez les deux côtés de la peau avec une pince. Appliquez des agrafeuses cutanées pour fermer l’incision cutanée. Veillez à ne pas agrafer l’intestin.
  26. Éteignez l’isoflurane mais maintenez le flux d’oxygène en marche. Surveillez attentivement la souris. Lorsque la souris se réveille, placez-la dans une cage vide sur un coussin chauffant. La souris se réveille généralement dans les 5 minutes.
  27. Surveillez attentivement la souris jusqu’à ce qu’elle soit consciente et qu’elle se déplace normalement.
  28. Injecter par voie sous-cutanée 0,1 mg/kg de buprénorphine à la souris 4 h après la chirurgie.
  29. Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine à la souris toutes les 24 heures pendant les 2 jours suivants.
  30. Surveillez attentivement les souris quotidiennement pendant une semaine après la chirurgie. Vérifiez les sutures et la cicatrisation des plaies.
  31. jours après la chirurgie, retirez les agrafeuses cutanées à l’aide d’un dissolvant d’agrafeuse.

4. Évaluation de la cinétique de croissance tumorale par imagerie bioluminescente in vivo

REMARQUE: Si des tumoroïdes exprimant Firefly sont utilisés pour l’injection, la progression de la tumeur métastatique peut être surveillée chaque semaine par imagerie in vivo comme décrit38,39. La luciférase exprimée par les cellules cancéreuses pourrait provoquer des réponses immunitaires contre les cellules cancéreuses et limiter la croissance tumorale40. Ainsi, la prudence est justifiée dans l’analyse des phénotypes immunitaires et de la progression du cancer dans un modèle murin utilisant des cellules tumorales exprimant la luciférase.

  1. Préparer une solution de D-luciférine à 30 mg/mL à l’aide de PBS stérile. Protégez-le de la lumière. La D-luciférine doit être conservée dans des aliquotes à -20 °C jusqu’à son utilisation.
  2. Rasez l’abdomen et le thorax avec un rasoir électronique. Cela peut être fait jusqu’à 1 jour avant l’imagerie in vivo .
  3. Injecter 150 mg/kg de poids corporel de D-luciférine par voie intrapéritonéale chez la souris (c.-à-d. si le poids corporel de la souris est de 30 g, injecter 150 μL de la solution de D-luciférine).
  4. Placez les souris dans une chambre d’anesthésie et anesthésiez-les. Utilisez 5% d’isoflurane pour l’induction et 2% à 3% pour l’entretien.
  5. min plus tard, placez les souris en position latérale (côté droit vers le haut). Acquérir des images de bioluminescence à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (IVIS) comme décrit précédemment38,39.
    REMARQUE: Les souris sont plus stables en position latérale par rapport à la position couchée. Par conséquent, une position latérale est préférable pour obtenir une image de luminescence à partir d’un plan focal cohérent.
  6. Placez les souris dans une cage vide et surveillez leur rétablissement.
  7. Définissez les régions d’intérêt sur le haut de l’abdomen à l’aide du logiciel Living Image comme décrit38. Quantifier le flux total en tant que substitut du nombre de cellules tumorales.

5. Analyse de survie et prélèvement de tissus

  1. Surveillez attentivement les souris pour détecter les symptômes cliniques de métastases telles qu’un abdomen distendu.
  2. Euthanasier une souris par inhalation de CO2 une fois qu’elle atteint des paramètres sans cruauté.
    REMARQUE : Utilisez un critère d’évaluation approuvé par le comité d’éthique animale de l’institut. Pour déterminer un critère d’évaluation sans cruauté, une feuille de dossier clinique a été utilisée; les scores ont été calculés par un point donné pour la présence de chacune des observations suivantes: perte de poids > 15%, posture voûtée, pelage ébouriffé, déshydratation, diminution des mouvements, abdomen distendu ou grimace faciale. Une fois qu’un score de 3 a été atteint, les souris ont été euthanasiées sans cruauté.
  3. Immédiatement après l’euthanasie, effectuer une fixation par perfusion transcardique avec 30 à 50 mL de formol à 10 % dans une hotte aspirante, comme décrit41. Faites plusieurs petites incisions (jusqu’à 1 cm chacune) avec des ciseaux dans la partie normale du foie avant la perfusion pour générer des exutoires pour le sang et le formol. Lors de la perfusion, la couleur du foie passera du rouge au brun.
    REMARQUE: Si les micrométastases dans les zones hépatiques macroscopiquement normales sont un sujet d’étude, nous recommandons aux chercheurs de ne pas couper le foie, mais de couper la veine cave supérieure à la place. Cependant, lorsque nous avons utilisé cette méthode, la fixation du foie semble plus faible par rapport à la coupe du foie. Surtout si l’hybridation in situ de l’ARN (ISH) est prévue sur des coupes hépatiques, nous recommandons de faire des incisions dans le foie avant l’injection intra-cardiaque de formol, comme décrit ci-dessus. Cela permet une fixation suffisante du tissu hépatique, ce qui entraîne la préservation de l’intégrité de l’ARN pour l’ISH.
  4. Placez les tissus hépatiques et pulmonaires dans 10% de formol et fixez-les pendant la nuit. Remplacez le formol par de l’éthanol à 70 %, puis par de la paraffine.
  5. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour évaluer histologiquement la zone tumorale. Effectuer l’immunohistochimie pour les marqueurs stromaux d’intérêt. Effectuez une coloration Picro-Sirus Red pour évaluer les zones positives au collagène.
    REMARQUE: Le logiciel ImageJ42 peut être utilisé pour quantifier les données d’immunohistochimie et de coloration Picro-Sirius Res. Une fonction de déconvolution des couleurs et l’outil de fibrose IRM peuvent être utilisés pour évaluer respectivement les zones positives à la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et les zones rouges positives de Picro-Sirius.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pour induire une surexpression médiée par l’AAV d’un gène stromal limitant la tumeur, Islr 4,25,43,44, dans les hépatocytes, nous avons injecté par voie intraveineuse Islr-encodant AAV8. 1,0 x 1011 génomes viraux (vg) d’AAV8-Islr, ou comme témoin, AAV8-mRuby2, ont été injectés dans la veine de la queue de souris adulte (Figure 1A). Deux semaines après l’injection de la veine caudale, des foies ont été prélevés pour valider la surexpression d’Islr dans les hépatocytes. Nous avons effectué l’hybridation in situ de l’ARNscope 45 et confirmé que des signaux de 3,3'-diaminobenzidine (DAB)+ ont été observés dans tout le foie (Figure 1B). Aucun signal DAB+ n’a été détecté dans le foie d’une souris traitée AAV8-mRuby2.

Nous avons pratiqué la procédure d’injection de veine porte en injectant de l’encre de Chine (dilution 1:1000 dans pbS). Après avoir pratiqué une incision dans le haut de l’abdomen, les intestins ont été doucement retirés de l’espace abdominal pour permettre la visualisation de la veine porte (Figure 2A). L’injection veineuse d’encre de Chine a permis d’administrer l’encre dans tout le foie, mais pas dans les poumons (figure 2B). Si l’encre est injectée par erreur dans d’autres vaisseaux tels que la veine cave inférieure (IVC) ou l’aorte abdominale, la circulation systémique de l’encre modifie la couleur du poumon en noir. L’encre de Chine aide également à identifier la quantité de fuite de la veine porte, ce qui indique une dissémination pancréatique ou péritonéale.

Deux semaines après l’injection dans la veine caudale d’AAV-mRuby2, d’ApcΔ/Δ et de Trp53Δ/Δ, les organoïdes du cancer du côlon (tumoroïdes AP) ont été dissociés en cellules uniques et injectés dans la veine porte de la souris (Figure 3A). Pour confirmer la croissance tumorale métastatique et évaluer l’histologie, nous avons recueilli les foies 3 à 4 semaines après l’injection de la veine porte (c’est-à-dire à un point ponctuel plutôt qu’à un point d’évaluation humain), avant que la nécrose proéminente ne confonde les analyses histopathologiques. Macroscopiquement, l’injection de tumoroïdes dans la veine porte a entraîné la formation de multiples nodules tumoraux blancs dans le foie (Figure 3B). Nous avons constaté que l’injection intra-splénique du même nombre de cellules de tumoroïdes ne générait pas une grande masse tumorale métastatique. Cela suggère que l’approche d’injection veineuse porte induite plus efficacement les métastases hépatiques par rapport au modèle d’injection intra-splénique. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des métastases hépatiques du CCR induite par l’injection de veine porte a démontré une histopathologie d’un adénocarcinome tubulaire modérément différencié accompagné d’une réaction stromale desmoplastique et d’une nécrose (Figure 3C). Cette histologie riche en stroma a fidèlement récapitulé celle des métastases hépatiques du CCR humain (Figure 3C), ce qui rend ce modèle adapté à la recherche translationnelle sur le stroma tumoral métastatique. De plus, l’immunohistochimie de l’actine musculaire alpha-lisse (αSMA), un marqueur bien établi pour les CAF, a montré qu’environ 7% des zones tumorales étaient αSMA-positives, confirmant la présence de CAF dans ce modèle murin (Figure 3D, E). La coloration rouge Picro-Sirius qui colore le collagène46 a démontré une ECM abondante dans le mésenchyme tumoral avec environ 13% des zones tumorales positives pour le collagène (Figure 3D, E). L’immunohistochimie pour EPCAM, un marqueur de lignée épithéliale, a révélé que le CCR métastatique a montré un bourgeonnement tumoral (une seule cellule tumorale ou un groupe cellulaire comprenant jusqu’à quatre cellules tumorales) qui est une caractéristique du cancer colorectal de mauvais pronostic47 (Figure 3F). L’indice de marquage Ki67 dans le CCR métastatique était d’environ 80 %, ce qui indique que la plupart des cellules tumorales sont mitotiquement actives (Figure 3G, H).

Nous avons effectué des analyses de la survie de la souris et de la cinétique de croissance tumorale dans ce modèle préclinique. Les souris de notre première cohorte pilote ont montré une survie médiane de 57 jours après l’injection de tumoroïde dans la veine porte (N = 4 souris; Figure 4A). Cela a ensuite été répliqué dans des groupes témoins plus importants injectés aAV8-mRuby225. Au critère d’évaluation sans cruauté (comme indiqué dans NOTE, étape 5.2), 3 souris sur 4 du groupe pilote ont présenté une ascite, qui est également observée chez les patients présentant des métastases hépatiques avancées48. Pour évaluer la croissance tumorale, un système d’imagerie in vivo (IVIS) a été utilisé pour mesurer la luminescence dérivée des tumoroïdes (Figure 4B,C). Les signaux de bioluminescence ont été observés dans la partie supérieure de l’abdomen, suggérant une croissance tumorale spécifique du foie (Figure 4B). Si des signaux IVIS sont observés dans le bas-ventre, cela indique une dissémination péritonéale ou des métastases secondaires aux organes abdominaux. L’imagerie in vivo hebdomadaire a permis une évaluation longitudinale de la croissance tumorale chez chaque souris (Figure 4C), ce qui facilite le suivi d’un effet thérapeutique dans notre étude ultérieure à plus grande échelle. Le taux de prise de tumeur était de 100% (4/4 souris) tel qu’évalué par les signaux IVIS. Dans cette expérience, aucune métastase pulmonaire macroscopiquement apparente n’a été observée au moment de la collecte de tissus (0/4 souris).

Enfin, nous avons étudié si l’administration dirigée par l’hépatocyte médiée par l’AAV d’un gène CAF limitant le cancer, Islr 4,25, pouvait inhiber la croissance des métastases hépatiques du CCR dans ce modèle murin préclinique. Notamment, les souris traitées par AAV8-Islr ont montré une amélioration de la survie des souris et une diminution des signaux IVIS des tumeurs (Figure 5A-C)25. L’immunohistochimie pour le Smad1/5/8 phosphorylé a démontré que la surexpression hépatocytaire de l’ISLR, un potentialisateur de signalisation BMP, augmentait la signalisation BMP dans les tumeurs métastatiques (Figure 5D). Le traitement par AAV8-Islr a diminué le nombre de cellules proliférantes Ki67+ dans la métastase hépatique du CCR (Figure 5E). Pour une description complète des résultats, voir Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Nos données collectives indiquent que l’administration médiée par AAV8 d’un gène inhibiteur de la tumeur aux hépatocytes, un constituant vital du stroma29 de la tumeur métastatique du foie, pourrait être une approche préventive / thérapeutique efficace pour les métastases hépatiques du CCR (Figure 5F).

Figure 1
Figure 1 : AAV8-Islr administré par la veine caudale génère une surexpression d’Islr dans le foie. (A) Schéma expérimental montrant l’injection de la veine caudale d’AAV8, suivie de l’injection veineuse porte d’organoïdes du cancer colorectal (CCR). ISH, hybridation in situ; IHC, immunohistochimie; qRT-PCR, réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase. (B) Photos représentatives. L’hybridation in situ de l’ARN pour Islr a été réalisée à l’aide de foies de souris traitées AAV8-Islr ou AAV8-mRuby2. Les foies ont été prélevés 2 semaines après l’injection de la veine caudale. Barres d’échelle, 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’injection d’encre de Chine dans la veine porte entraîne son administration au foie, mais pas au poumon. (A) Images représentatives montrant l’anatomie du haut de l’abdomen après laparotomie. Notez que, pour la visualisation de la veine porte, les intestins sont prélevés à l’extérieur de la cavité abdominale. L’image de droite montre une annotation anatomique de chaque organe et vaisseau. La flèche jaune indique le site d’injection. IVC, veine cave inférieure. B) Images représentatives du foie et des poumons après injection d’encre de Chine dans la veine porte. Les pointes de flèches jaunes indiquent les récipients tachés d’encre de Chine. Barres d’échelle, 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal génère des métastases hépatiques riches en stroma. (A) Schéma expérimental montrant l’injection veineuse porte d’organoïdes du cancer du côlon Apc Δ/Δ et Trp53Δ/Δ (tumoroïdes AP). Barre d’échelle, 200 μm. T, tumoroïdes. (B) Images macroscopiques représentatives des foies qui ont été recueillies 3 à 4 semaines après l’injection de veine porte (à gauche) ou l’injection intra-splénique (à droite). 5,0 x 105 cellules uniques provenant de tumoroïdes AP ont été injectées dans la veine porte ou la rate. L’injection intra-splénique a été effectuée comme décrit13. Les nodules blancs indiquent des tumeurs. T, Tumeur; N, Foie normal. (C) Images représentatives de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) des métastases hépatiques du CCR du modèle murin d’injection veineuse porte (gauche et milieu) et humaine (droite). T, Tumeur; N, Foie normal; S, Stroma; Nec, Nécrose. La ligne pointillée jaune indique une frontière entre la tumeur et le foie normal (à gauche). (D et E) Immunohistochimie (IHC) pour l’actine musculaire alpha-lisse (αSMA; à gauche) et la coloration rouge Picro-Sirius (à droite). (D) Photos représentatives. (E) Quantification des zones αSMA positives (à gauche) et des zones rouge-positives Picro-Sirius (à droite). N = 4 souris, 5 HPF (High Power Fields; 400x)/souris. (F) Image représentative montrant l’immunohistochimie pour l’EPCAM, un marqueur de cellules épithéliales. Les lignes pointillées vertes indiquent le bourgeonnement de la tumeur. (G et H) Immunohistochimie pour Ki67, un marqueur de prolifération cellulaire. G) Image représentative. (H) Pourcentage de cellules Ki67+ dans les cellules épithéliales totales. Les cellules épithéliales ont été visualisées par contre-coloration de l’hématoxyline. N = 4 souris, 5 HPF/souris. Dans (B)-(H), tous les tissus hépatiques de souris ont été prélevés 3 à 4 semaines après l’injection de tumoroïdes AP. Moyenne ± S.E.M. Chaque point représente une valeur moyenne de 5 HPF d’une souris (E et H). Les barres d’échelle représentent 1 cm (B), 1 mm (C; à gauche), 100 μm (C; milieu et droite) et 50 μm (D, F et G). Notez que l’étude avec des tissus humains a été approuvée par le comité d’éthique de la faculté supérieure de médecine de l’Université de Nagoya (2017-0127). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de survie et analyse cinétique de croissance tumorale par imagerie in vivo. (A) Courbes de survie de Kaplan-Meier. N = 4 souris. (B,C) Le système d’imagerie in vivo (IVIS) a été utilisé pour évaluer la cinétique de croissance tumorale. (B) Une image représentative. La zone dans la boîte rouge a été utilisée pour la quantification. (C) Cinétique de croissance. Les signaux de luciférase de chaque souris sont affichés. N = 4 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : L’administration d’Islr aux hépatocytes par le gène Médié par AAV8 augmente la signalisation BMP, réduit la prolifération tumorale et améliore la survie de la souris dans un modèle d’injection veineuse porte de métastases hépatiques CRC. (A) Courbe de survie de Kaplan-Meier. Deux semaines après l’injection d’AAV-Islr ou d’AAV-mRuby2 dans la veine caudale, une injection veineuse porte de tumoroïdes du CCR a été effectuée. (B et C) Les signaux de luciférase dérivés de tumoroïdes ont été évalués à l’aide d’IVIS. (B) Image représentative. (C) Quantification des signaux IVIS. N = 5 (AAV-mRuby2) et 8 (AAV-Islr) souris. Moyenne ± S.E.M. (D) Photos représentatives. Immunohistochimie (IHC) pour Smad1/5/8 phosphorylé (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 est une molécule en aval de la signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) qui est phosphorylée lors de l’activation de la signalisation BMP49. N = 4 souris chacune. (E) Photos représentatives. Immunohistochimie pour Ki67. N = 4 souris chacune. (F) Résumé graphique. L’administration par un gène dirigé par l’hépatocyte médié par l’AAV d’un gène stromal limitant le cancer pourrait servir de stratégie thérapeutique pour inhiber la métastagenèse du CCR. La surexpression de l’Islr médiée par l’AAV8 dans les hépatocytes a remodelé la niche métastatique en augmentant la signalisation BMP et en limitant la progression des métastases CRC. Pour des informations détaillées, reportez-vous à Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Test log-rank (A) et ANOVA (analyse de variance) à mesures répétées bidirectionnelles avec le test de comparaison multiple post-hoc de Sidak à la semaine 3 (C). Barres d’échelle, 50 μm. La figure 5A-C a été réimprimée à partir de Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans cette étude, nous avons montré que l’injection de veine porte d’organoïdes CRC de souris génère de manière reproductible des métastases hépatiques riches en fibroblastes qui imitent les caractéristiques histologiques des métastases hépatiques CRC humaines. En outre, lorsqu’il est combiné avec des thérapies dirigées par le stroma telles que la thérapie génique médiée par AAV8, ce modèle préclinique constitue un outil utile pour évaluer les effets thérapeutiques sur la survie de la souris et la croissance tumorale.

Il y a, au moins, deux étapes critiques dans le protocole. Tout d’abord, il est important de préparer une suspension unicellulaire de tumoroïdes en essayant complètement les organoïdes et en utilisant un filtre à mailles pour éliminer les amas cellulaires. La dissociation incomplète des tumoroïdes entraîne de grandes agrégations cellulaires, dont l’injection peut obstruer la veine porte. Cela provoque un infarctus du foie et la mort animale22. Deuxièmement, lors de l’injection de la veine porte, il est impératif de minimiser les saignements de la veine porte. L’aiguille doit être correctement insérée dans la veine porte. Pour éviter la perforation de l’autre côté de la veine porte, l’angle de l’aiguille insérée doit être maintenu presque parallèle à la veine porte. Pour éviter la déchirure de la veine porte pendant l’injection, l’aiguille ne doit pas être déplacée une fois qu’elle est complètement insérée dans la veine porte. Immédiatement après avoir retiré l’aiguille de la veine porte, il est essentiel d’appliquer une pression sur le site d’injection avec un coton-tige pendant au moins 5 minutes.

Le numéro de cellule pour l’injection doit être modifié en fonction de la souris receveuse (par exemple, souris immunocompétente vs immunodéficiente) et de la tumorigénicité de la lignée organoïde. Dans nos expériences, l’injection de 5,0 x 105 cellules individuelles dans une suspension de 100 μL était suffisante pour générer des métastases hépatiques chez des souris immunocompétentes. L’augmentation du nombre de cellules pourrait augmenter le risque d’embolie dans la veine porte et de mort des animaux14, et devrait donc être soigneusement envisagée. Étant donné que les articles précédents utilisaient 5 x 104 à 5 x 105 cellules dans 100 μL pour l’injection de tumoroïde dans la veine portale ou mésentérique 25,26,27,28, nous considérons que cette plage de nombres de cellules serait un bon point de départ pour l’optimisation.

L’une des limites de l’approche de l’injection veineuse porte est qu’elle ne récapitule pas complètement toute la cascade de métastagenèse du CCR. Les métastases hépatiques du cancer nécessitent cinq étapes principales: (1) invasion des cellules cancéreuses au site primaire, (2) intravasation dans le vaisseau, (3) survie cellulaire dans la circulation porte, (4) extravasation de la veine porte vers le parenchyme hépatique et (5) colonisation dans la niche métastatique50. Le modèle d’injection veineuse porte ne permet que l’étude des étapes (3) à (5). Pour mieux comprendre les autres processus métastatiques, il est nécessaire d’utiliser d’autres modèles tels que des modèles in vitro et / ou un modèle murin primaire CRC mutant Notch1 qui métastase fréquemment dans le foie51.

L’importance de la méthode d’injection de la veine porte par rapport aux méthodes existantes comprend la croissance spécifique du foie et une charge tumorale plus élevée. La dissémination péritonéale dans d’autres modèles d’injection et la croissance tumorale primaire dans les modèles primaires de CCR peuvent confondre l’analyse de la progression des métastases hépatiques. En revanche, notre approche de la veine porte génère rapidement des tumeurs spécifiques au foie, simplifiant les analyses de survie et de croissance tumorale.

L’un des principaux avantages de la transplantation organoïde par rapport à l’injection de lignée cellulaire est que l’injection de tumeurs dans la veine porte a généré le microenvironnement tumoral riche en fibroblastes qui phénocode une caractéristique desmoplastique du CCR métastatique humain. Les conditions de culture organoïde récapitulent les caractéristiques du microenvironnement tumoral et soutiennent les populations de cellules souches intestinales, y compris l’intégration de cellules dans un ECM 3D riche et complexe avec une combinaison définie de facteurs de croissance24,52. Il en résulte une propagation des cellules tumorales d’une manière qui préserve le paysage génétique de la tumeur source52,53. En revanche, la culture 2D traditionnelle de lignées cellulaires tumorales est associée à une sélection clonale et à des altérations génomiques /transcriptomiques aberrantes qui ne reflètent pas fidèlement les caractéristiques des cancers d’origine54. Nous supposons que les conditions de culture relativement difficiles pour la culture 2D de lignées cellulaires cancéreuses forcent les cellules à s’adapter à l’absence de signaux ECM / facteur de croissance qui peuvent ensuite entraîner des tumeurs pauvres en stroma in vivo, car les cellules n’ont plus besoin de signaux dérivés du stroma pour survivre.

En combinant le modèle d’injection de veine porte organoïde avec la thérapie génique médiée par AAV8, nous avons constaté que l’administration d’une charge utile inhibitrice du cancer aux hépatocytes avant la colonisation des cellules cancéreuses dans le foie pouvait modifier la niche (pré-)métastatique pour inhiber la croissance des métastases duCCR 25. De manière encourageante, les essais cliniques ont démontré que le transfert de gènes in vivo médié par l’AAV vers le foie induit l’expression à long terme d’un transgène et pourrait être une modalité efficace et sûre pour traiter les maladies génétiques non néoplasiques 30,31,55. À l’avenir, l’exploitation des hépatocytes pour prévenir les métastases hépatiques grâce à l’approche AAV pourrait avoir une valeur clinique potentielle chez les patients cancéreux à haut risque de métastases.

En résumé, notre article montre que la transplantation d’organoïdes CRC via la veine porte génère des métastases hépatiques riches en fibroblastes, qui peuvent être exploitées pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblant le stroma. En couplant l’injection de la veine porte avec un traitement dirigé par le stroma, tel que l’administration de gènes médiés par l’AAV, on peut identifier de nouvelles cibles stromales pour limiter la progression des métastases du CCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (APP1156391 à D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 à D.L.W., APP1140236 à S.L.W., APP1099283 à D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project au nom de ses donateurs et du gouvernement de l’État d’Australie-Méridionale par l’intermédiaire du ministère de la Santé (MCF0418 à S.L.W., D.L.W.); une subvention pour la recherche scientifique (B) (20H03467 à M.T.) commandée par le Ministère de l’éducation, de la culture, des sports, des sciences et de la technologie du Japon; AMED-CREST (Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 et 19gm1210008s0101 à A.E.); le Projet de recherche sur le cancer et l’évolution thérapeutique (P-CREATE) de AMED (19cm0106332h0002 à A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (à H.K.), Bourse de la Fondation Takeda science (à H.K.), Bourse de doctorat Greaton International (à H.K.), Bourse de la Fondation de recherche médicale Lions (à K.G.).

Nous remercions le Dr Leszek Lisowski du Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIE) d’avoir produit des vecteurs AAV recombinants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Tags

Recherche sur le cancer numéro 175
Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter