Summary
Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.
Abstract
Levermetastase van colorectale kanker (CRC) is een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte. Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), een belangrijk onderdeel van de tumormicro-omgeving, spelen een cruciale rol bij gemetastaseerde CRC-progressie en voorspellen een slechte prognose van de patiënt. Er is echter een gebrek aan bevredigende muismodellen om de kruisverwijzing tussen gemetastaseerde kankercellen en CAFs te bestuderen. Hier presenteren we een methode om te onderzoeken hoe levermetastaseprogressie wordt gereguleerd door de metastatische niche en mogelijk kan worden beperkt door stroma-gerichte therapie. Poortaderinjectie van CRC-organoïden genereerde een desmoplastische reactie, die de fibroblastrijke histologie van menselijke CRC-levermetastasen getrouw samenvatte. Dit model was weefselspecifiek met een hogere tumorbelasting in de lever in vergelijking met een intra-miltinjectiemodel, waardoor overlevingsanalyses van muizen werden vereenvoudigd. Door luciferase-tot expressie brengende tumororganoïden te injecteren, kon de tumorgroeikinetiek worden gevolgd door in vivo beeldvorming. Bovendien biedt dit preklinische model een nuttig platform om de werkzaamheid van therapeutica gericht op het tumormes te beoordelen. We beschrijven methoden om te onderzoeken of adeno-geassocieerde virus-gemedieerde levering van een tumorremmend stromaal gen aan hepatocyten de tumormicro-omgeving zou kunnen hermodelleren en de overleving van muizen zou kunnen verbeteren. Deze aanpak maakt de ontwikkeling en beoordeling van nieuwe therapeutische strategieën mogelijk om levermetastase van CRC te remmen.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankersterfte1. Meer dan de helft van de CRC-patiënten ontwikkelt levermetastase die optreedt via de poortaderverspreiding1. Momenteel zijn er geen effectieve therapieën die geavanceerde levermetastasen kunnen genezen en de meeste patiënten bezwijken aan gemetastaseerde ziekte.
De gemetastaseerde niche of tumormicro-omgeving speelt een sleutelrol bij de engraftment en groei van gedissemineerde CRC-cellen2. Kankergeassocieerde fibroblasten (CAFs), een prominent onderdeel van de tumormicro-omgeving, bevorderen of beperken de progressie van kanker door groeifactoren af te scheiden, de extracellulaire matrix (ECM) te hermodelleren en immuunlandschappen en angiogenese te moduleren 3,4,5. CAFs verlenen ook resistentie tegen chemotherapieën en immunotherapieën3. Bovendien reguleren CAFs de initiatie en progressie van CRC-levermetastase en voorspellen ze de prognose bij patiënten met CRC 3,6,7,8. CAF-gerelateerde factoren kunnen dus worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën om CRC-levermetastasen te remmen. Het gebrek aan bevredigende muismodellen om het gemetastaseerde tumorstroma te bestuderen, is echter een groot obstakel geweest voor het ontwikkelen van stroma-gerichte therapieën.
Momenteel omvatten diermodellen om CRC-levermetastasen te bestuderen primaire CRC-modellen die spontaan levermetastase en kankerceltransplantatiemodellen in de lever ontwikkelen. Primaire CRC-muismodellen, zoals genetisch gemanipuleerde muismodellen en coloninjectie van kankercellen, tonen zelden metastase aan de lever 9,10,11,12. Bovendien, zelfs als een levermetastase wordt waargenomen, vertonen deze modellen een lange latentie van de primaire tumorinductie tot metastase en sterven ze mogelijk aan primaire tumorlast12. Om efficiënt CRC-levermetastasen te genereren, worden gekweekte CRC-cellen in de lever getransplanteerd met behulp van drie injectiebenaderingen: intra-miltinjectie, directe intra-parenchymale injectie in de lever en poortaderinjectie. Intra-splenisch geïnjecteerde kankercellen verspreidden zich in de miltader, de poortader en uiteindelijk naar de lever13,14. De intra-miltinjectie levert echter een lagere tumoropnameratio op in vergelijking met andere transplantatiemodellen15,16. Met intra-miltinjectie wordt chirurgische verwijdering van de milt uitgevoerd om kankergroei in de milt te voorkomen, wat mogelijk de rijping van immuuncellen in gevaar kan brengen17. Bovendien kan intra-miltinjectie ook leiden tot onbedoelde tumorgroei in de milt en buikholte18, wat levermetastaseanalyses bemoeilijkt. Directe intra-parenchymale injectie in de lever induceert efficiënt levermetastase 16,19,20. Niettemin vat deze benadering een biologische stap van levermetastase die van nature voorkomt via verspreiding van poortaders niet volledig samen. Met behulp van directe injectie in de lever, het binnendringen van kankercellen in een niet-portale, maar systemische circulatie kan ook resulteren in meerdere grote longmetastasen16. Hoewel een meerderheid van de patiënten met CRC-levermetastase meerdere tumorknobbels in de leververtoont 21, genereert directe injectie in een specifieke leverkwab een enkele tumormassa19,20. Portale aderinjectie of mesenteriale aderinjectie, hoewel technisch uitdagend, maakt efficiënte afgifte van tumorcellen in de lever mogelijk op een manier die de groeipatronen bij patiëntenvan 17 samenvat. Deze strategie kan de mogelijkheid van secundaire metastasen minimaliseren en maakt een snelle groei van kankercellen in de lever mogelijk, waardoor de overlevingsanalyses van muizen worden vereenvoudigd.
Historisch gezien werden colorectale kankercellijnen zoals muis MC-38, humaan HT-29 en SW-620 gebruikt om muismodellen van levermetastase te genereren22,23. Deze colorectale kankercellijnen induceren echter geen desmoplastische stromale reactie. Een laag stromaal gehalte in de tumoren maakt het moeilijk om de biologische rollen van kanker-geassocieerde fibroblasten te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CRC-organoïden en hun transplantatie hebben nuttige platforms geboden om de vitale rollen van het stroma in de progressie van kanker te beoordelen24. Levertransplantatie van CRC-organoïden genereert een fibroblastrijke tumormicro-omgeving en heeft nieuwe inzichten opgeleverd in stromaal onderzoek 6,25. Momenteel is portale of mesenteriale aderinjectie van organoïden een gouden standaardbenadering geworden om CRC-levermetastase te genereren 6,25,26,27,28. Niettemin, voor zover wij weten, hebben geen eerdere artikelen gedetailleerde methoden beschreven voor de poortaderinjectie van colorectale tumoroïden. Hier presenteren we een methodologie voor het gebruik van portale aderininjectie van CRC-organoïden om nieuwe adeno-geassocieerde virus (AAV) -gemedieerde stroma-gerichte therapie te ontwikkelen.
Hepatocyten zijn een belangrijk bestanddeel van de gemetastaseerde tumormicro-omgeving in de lever en spelen een cruciale rol bij de progressie van gemetastaseerde kanker29. Geïnspireerd door het succes van AAV-gentherapiebenaderingen om eiwitexpressie in hepatocyten te induceren bij niet-neoplastische patiënten30,31, onderzochten we een vergelijkbare aanpak, maar gericht op het wijzigen van de micro-omgeving van de levertumor in CRC25. Als zodanig beschrijven we hierin ook de staartaderinjectie van AAV8 om expressie van anti-tumorogene eiwitten te induceren om de micro-omgeving van de levertumor te wijzigen. Het AAV8-serotype, aangeduid door de keuze van virale capsid-eiwit tijdens de virusproductie, leidt tot een hoge transductie-efficiëntie, met name van hepatocyten (d.w.z. gerichte genexpressie in de micro-omgeving van de levertumor)32. We hebben eerder aangetoond dat Islr (immunoglobuline superfamilie met leucine-rijke herhaling) een CAF-specifiek gen is dat botmorfogenetisch eiwit (BMP) signalering induceert, CRC tumoroïde groei vermindert en Lgr5 + intestinale stamceldifferentiatiebevordert 25. We testten of AAV8-gemedieerde overexpressie van het kankerbeperkende stromale gen, Islr, in hepatocyten de progressie van levermetastase kon verzwakken door portale aderininjectie van CRC-tumoroïden uit te voeren in met AAV8-Islr behandelde muizen.
In dit artikel beschrijven we eerst de staartaderinjectieprocedure van levertropeskeer AAV. Vervolgens beschrijven we een methode voor tumoroïde celvoorbereiding en poortaderinjectie in de met AAV behandelde muizen. Ten slotte presenteren we benaderingen om de progressie van gemetastaseerde tumoren te volgen om de werkzaamheid van stroma-gerichte therapieën te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures in dit artikel zijn beoordeeld en goedgekeurd door de South Australian Health and Medical Research Institute Animal Ethics Committee (goedkeuringsnummer, SAM322).
1. Staartader injectie van adeno-geassocieerd virus
OPMERKING: Adeno-geassocieerd virus (AAV) moet worden behandeld als een biorisico volgens de richtlijnen van bioveiligheidsniveau 1. Raadpleeg het gepubliceerde protocol voor AAV-bereiding, -zuivering en -titratie33. Hepatocyt-tropic AAV, AAV834, coderend voor het cytomegalovirus (CMV) promotor-Islr gen, werd gebruikt in deze studie25. Om AAV-gemedieerde overexpressie te induceren, kan AAV-dosering optimalisatie vereisen, afhankelijk van de promotoractiviteit, het gen en het gewicht van de muis.
- Verdun de AAV-vector in aliquots van 150 μL met 1,0 x 1011 virale genomen, met behulp van steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en houd deze op ijs. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen om de AAV te hanteren.
OPMERKING: Herhaalde bevriezings- en dooicyclus vermindert de virustiter en moet worden vermeden. De virale oplossing moet worden bewaard in een vriezer van -80 °C. - Zet een warmtebak (dierenverwarmingskamer) aan om voor te verwarmen tot 35 °C.
- Houd een muis vast en breng een actuele anesthesiecrème aan op de gehele lengte van de staart ten minste 15 minuten voorafgaand aan de staartaderinjectie.
OPMERKING: Dit is een optionele stap en is mogelijk niet nodig als dit niet vereist is door de dierethiekcommissie van het instituut. Volg het protocol dat is goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren. In dit experiment25 werd een Rosa26-Cas9-muis gebruikt voor AAV-injectie en daaropvolgende poortaderinjectie van CRC-organoïden. Aangezien tumoroïden die in deze studie werden gebruikt, waren afgeleid van een Rosa26-Cas9-muis (C57BL / 6 x 129 genetische achtergrond), werd deze muizenstam ook gebruikt als immunocompetente, syngenetische ontvangers van de tumortransplantatie. Mannelijke en vrouwelijke Rosa26-Cas9 muizen (6 tot 24 weken oud) werden gebruikt. - Plaats de muis in de warmtebox. Laat de muis maximaal 15 minuten staan om de staartaders op te warmen en te verwijden.
- Zet de muis voorzichtig vast in een knaagdierverstoter. Plaats de staart onder een warmtelamp om volledige verwijding van de staartaders te garanderen.
- Zuig 150 μL verdunde AAV (bereid in stap 1.1) op in een steriele spuit met een 27-30 G naald in een lage dode ruimte.
- Verplaats het warmtelicht en identificeer de laterale staartader aan de zijkanten van de staart. Zet met de vingers lichte spanning op de staart zodat de staart recht wordt.
- Steek langzaam 2-3 mm van de naald, schuin omhoog, in de ader. De naald moet bijna evenwijdig aan de staart zijn (tot 15 ° van de staart).
OPMERKING: Bloedinstroom in de spuit kan worden waargenomen als de naald zich met succes in de ader bevindt. - Injecteer langzaam. Als een weerstand wordt gevoeld of zwelling van de huid wordt waargenomen, verwijdert u de naald en brengt u deze opnieuw in boven de eerste plaats of naar de andere laterale ader.
- Wacht ongeveer 5 s na het voltooien van de injectie en verwijder vervolgens langzaam de naald. Oefen onmiddellijk zachte druk uit op de injectieplaats met een schoon gaasje of keukenpapier totdat het bloeden stopt.
- Laat de muis voorzichtig los in zijn kooi. Controleer het dier om er zeker van te zijn dat het bloeden is gestopt.
OPMERKING: Genoverexpressie in de lever kan 1 tot 2 weken na AAV-staartaderinjectie worden beoordeeld. Dit kan bijvoorbeeld worden bevestigd door RNA in situ hybridisatie (ISH), immunohistochemie (IHC), western blotting of kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR; Figuur 1A,B). In een eerder gepubliceerde studie25 werd AAV8-Islr gebruikt om het Islr-gen van de muis in hepatocyten te overexpressie en de overexpressie werd gedetecteerd door RNA ISH (figuur 1A,B).
2. Celvoorbereiding voor colorectale kankerorganoïden
OPMERKING: CRC-organoïden die voor dit experiment worden gebruikt, bevatten uitsluitend epitheelcellen. Cultuur en generatie van CRC organoïden is eerder beschreven25,35. Kortom, normale colonepitheelcellen werden geïsoleerd uit de dikke darm van een Rosa26-Cas9-muis met behulp van een cryptisolatiebuffer (5 mM EDTA (ethyleendiaminetetraacetaat) in ijskoud PBS), en vervolgens ingebed in keldermembraanmatrixmedium en gekweekt in organoïde groeimedium zoals beschreven in referentie35. Vervolgens werden Apc- en Trp53-mutaties geïntroduceerd in de colonepitheelcellen door overexpressie van single-guide RNA's die zich richten op Apc en Trp53 met behulp van lentivirusexpressieprotocol. Enkele organoïde klonen werden met de hand geselecteerd25. EenpcΔ/Δen Trp53Δ/Δ darmkanker organoïden (AP tumoroïden), werden geïnjecteerd als 5,0 x 105 enkele cellen in 100 μL PBS met 10 μM Y-27632 in de poortader per muis, met organoïde cultuur en eencellig preparaat hieronder beschreven.
- Kweek de CRC-organoïden in de keldermembraanmatrix medium koepels in een 24-well plaat of 10 cm schotel 3-5 dagen vóór de poortaderinjectie om organoïden met een diameter van 50-400 μm te verkrijgen.
- Bereid voldoende hoeveelheid celloslatingsoplossing voor door Y-27632 toe te voegen aan een concentratie van 10 μM, voldoende om het aantal organoïden dat voor de injectie wordt gekweekt te verteren. Voorverwarmen in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: De celloslatingsoplossing die in dit protocol wordt gebruikt, is een recombinant celdissociatie-enzymmengsel en wordt gebruikt als vervanging voor trypsine in organoïdecultuur (zie Materialentabel). Het vermindert cellulaire schade veroorzaakt door celdissociatie in vergelijking met trypsine36. Y-27632 is een Rho-kinaseremmer en remt dissociatie-geïnduceerde celdood, waardoor de eencellige overleving wordt verhoogd37.- Bereid voor injectie in maximaal vijf muizen twee buizen voor met 40 ml celloslatingsoplossing om 10-24 x 50 μL keldermembraanmatrixkoepels te verteren met elke koepel met ongeveer 300 organoïden (50-400 μm diameter), d.w.z. elke muis wordt geïnjecteerd met 2-4,8 koepels organoïden (equivalent aan ongeveer 600-1440 organoïden). Het aantal organoïden dat nodig is om voldoende celnummer te verkrijgen, is afhankelijk van de organoïdelijn en moet daarom worden geoptimaliseerd.
OPMERKING: De tweede buis van 40 ml maakt een herhaalde vertering mogelijk met verse celloslatingsoplossing om gedissocieerde afzonderlijke cellen te verkrijgen.
- Bereid voor injectie in maximaal vijf muizen twee buizen voor met 40 ml celloslatingsoplossing om 10-24 x 50 μL keldermembraanmatrixkoepels te verteren met elke koepel met ongeveer 300 organoïden (50-400 μm diameter), d.w.z. elke muis wordt geïnjecteerd met 2-4,8 koepels organoïden (equivalent aan ongeveer 600-1440 organoïden). Het aantal organoïden dat nodig is om voldoende celnummer te verkrijgen, is afhankelijk van de organoïdelijn en moet daarom worden geoptimaliseerd.
- Aspirateer het organoïde medium voorzichtig uit elke put.
- Voeg 1 ml ijskoude PBS toe aan elke put in een bord met 24 putten. Als een schaal van 10 cm wordt gebruikt, voeg dan 10 ml ijskoude PBS toe aan het gerecht.
- Kras het keldermembraanmatrixmedium af met behulp van een P1000-pipetpunt. Breng de PBS/medium slurry over in een centrifugebuis van 15 ml.
- Spoel elke put af met dezelfde hoeveelheid PBS om keldermembraanmatrixfragmenten te verzamelen en voeg toe aan de buis (en) van 15 ml.
- Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Deze incubatie helpt het keldermembraanmatrixmedium op te lossen.
- Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op om ervoor te zorgen dat het gepelleteerde medium en de cellen niet worden verstoord.
- Voeg 5 ml voorverwarmde celloslatingsoplossing bereid in stap 2.2 toe aan de pellet, resuspend de pellet 10 keer en breng deze terug in een buis van 50 ml met verse, voorverwarmde celloslatingsoplossing.
- Plaats de tube in het waterbad van 37 °C. Incubeer gedurende 5 min.
- Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij 400 x g bij 4 °C.
- Herhaal stap 2.9-2.11.
OPMERKING: Herhaalde enzymatische spijsvertering zorgt voor de efficiënte celdissociatie in afzonderlijke cellen. - Controleer of de organoïden zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen door 100 μL in een 96-well plaat te pipetteren en onder een microscoop te observeren. Als veel organoïden celklonten vertonen die uit meer dan vier cellen bestaan, kan een langere incubatie met de celloslatingsoplossing en fysieke dissociatie door trituratie met een pipet van 10 ml noodzakelijk zijn.
- Zodra de meeste cellen enkele cellen zijn, voegt u 4 ml foetaal runderserum (FBS) toe aan de 40 ml celsuspensie om de spijsvertering te stoppen. Spoel een celzeef van 40 μm af met 5 ml PBS.
- Breng de celsuspensie door de celzeef in een opvangbuis van 50 ml om eventuele celklonten te verwijderen.
- Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Aspirateer de supernatant. Voeg 10 ml koude PBS toe aan de celkorrel en breng deze over in een centrifugebuis van 15 ml.
- Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Aspirateer de supernatant. Resuspend de pellet in 500 μL koude PBS met 10 μM Y-27632. Tel de cellen.
- Pas de celconcentratie aan op 5,0 x 105 enkele cellen/100 μL, met behulp van PBS met 10 μM Y-27632. Plaats de buis op ijs totdat de poortaderinjectie is uitgevoerd.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om gedissocieerde cellen binnen 4 uur na dissociatie te injecteren.
3. Poortader injectie van CRC organoïden
OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten en chirurgische gaasjes moeten vóór de operatie worden geautoclaveerd of gesteriliseerd. Dit protocol is aangepast ten opzichte van een eerder protocol17. In dit experiment25 werd poortaderinjectie uitgevoerd met Rosa26-Cas9-muizen die in stap 1 werden behandeld met AAV-mRuby2 of AAV-Islr .
- Bereid een aseptisch chirurgisch gebied voor met behulp van steriele gordijnen op een verwarmingskussen.
- Bereid chirurgische instrumenten (schaar en tang), chirurgische en hemostatische spons, 4-0 polyglactine hechting, wattenstaafjes, huid nietmachines, nietmachine applicator, zoutoplossing, buprenorfine en 33 G naald bevestigd aan een Hamilton spuit. Snijd de hemostatische spons in stukjes van 1,0 cm x 1,0 cm.
- Pas de positie van de lichtbron aan om het operatiegebied te verlichten.
- Injecteer 0,1 mg/kg lichaamsgewicht buprenorfine subcutaan in een muis voor chirurgische pijnbestrijding.
- Verdoof de muis met isofluraan in een anesthesiekamer. De isofluraanconcentratie voor inductie en onderhoud is meestal respectievelijk 5% en 2,5%. Controleer op de afwezigheid van een reactie op teenknijpen voordat u met de volgende procedure begint.
- Scheer het midden tot de bovenbuik van de muis met een elektrisch scheerapparaat. Scheren moet worden uitgevoerd in een gebied ver van het aseptische chirurgische gebied om te voorkomen dat het haar de plaats verontreinigt.
- Reinig de incisieplaats afwisselend met Betadine en 80% ethanol om het operatiegebied te steriliseren. Herhaal dit drie keer.
- Plaats de muis op een verwarmingskussen in rugligging met onderhoudsisofluraan-anesthesie. Plaats een chirurgische drape met een gat over de buik van de muis.
- Til de buikhuid op met een tang en maak een huidincisie van 2-3 cm op de middellijn met een schaar, waarbij alleen de huid wordt afgesneden (niet onderliggend peritoneum). De incisie moet variëren van het midden van de buik tot het xiphoid-proces van het borstbeen. De incisie mag niet boven het onderste uiteinde van het xiphoid-proces komen.
- Til de peritoneale wand volledig op met een tang en maak een vergelijkbare incisie van 2-3 cm in het peritoneum met een schaar. Vermijd het doorsnijden van de darm en het middenrif.
- Week het chirurgische gaas met warme zoutoplossing en plaats het aan de linkerkant van de incisie (aan de linkerkant van het lichaam van de muis; rechts van de chirurg).
- Trek voorzichtig de inwendige organen (dunne en dikke darm) eruit met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in zoutoplossing. Plaats de darmen op het gaas gedrenkt met zoutoplossing.
OPMERKING: De linkerdarmen van de muis (d.w.z. darmen aan de rechterkant van de chirurg) moeten eerst worden uitgetrokken en vervolgens kunnen de rechterdarmen van de muis (d.w.z. darmen aan de linkerkant van de chirurg) worden uitgetrokken. - Pas de positie van de darmen aan om de poortader te visualiseren. Bedek de darmen met extra nat gaas om de darmen vochtig te houden.
- Trek de darm voorzichtig naar de linkerkant met het natte gaas en breng zachte spanning aan op de linkerkant. Dit vergemakkelijkt de visualisatie van de poortader (figuur 2A).
OPMERKING: Als visualisatie van de poortader moeilijk is, kan het voorzichtig aanpassen van de positie van de maag met een nat wattenstaafje de visualisatie helpen. - Pipetteer tumoroïde suspensie meerdere keren voorzichtig om een homogene celsuspensie te verkrijgen. Zuig langzaam 100 μL van de celsuspensie op in een Hamilton-spuit die aan een naald van 33 G is bevestigd. Vermijd luchtbellen.
- Steek de naald langzaam, schuin omhoog, in de poortader. De inbrengdiepte langs de naald moet 3-4 mm zijn, waarbij de naaldhoek bijna evenwijdig is aan de poortader.
OPMERKING: Injectie moet worden uitgevoerd in het goed gevisualiseerde deel van de poortader (meestal tot 2 cm afstand van het leveractische hilum). Vermijd beweging van de naald nadat deze volledig in de poortader is ingebracht. - Injecteer tumorcellen gedurende 30 s. De injectie moet langzaam worden uitgevoerd om occlusie van de poortader te voorkomen. Als de injectie succesvol is, verandert de kleur van de lever tijdelijk van rood naar wit.
- Verwijder de naald langzaam. Oefen onmiddellijk zachte druk uit op de injectieplaats met een droog wattenstaafje en wacht 5 minuten.
- Verwijder het wattenstaafje en breng tegelijkertijd een hemostatische spons aan op de injectieplaats. Houd de hemostatische spons vast met een wattenstaafje of tang en oefen nog 5 minuten zachte druk uit.
- Verwijder de druk op de hemostatische spons en bevestig dat er geen bloeding van de injectieplaats is.
OPMERKING: De bio-absorbeerbare hemostatische spons hoeft niet te worden verwijderd. Proberen om het gaas te verwijderen kan leiden tot het opnieuw bloeden van de injectieplaats. - Als er bloeding optreedt, voer dan onmiddellijk drukhemostase uit met een wattenstaafje gedurende ongeveer 10 minuten. Breng vervolgens nog 5 minuten een extra hemostatische spons aan.
OPMERKING: Als oncontroleerbaar bloedverlies wordt waargenomen, moet de muis worden geëuthanaseerd volgens het protocol dat is goedgekeurd door de dierethische commissie van het instituut. - Verwijder de chirurgische gaasjes op de darmen. Spuit met behulp van een spuit gevuld met zoutoplossing van 5 ml zoutoplossing naar de darmen om orgaanhechting te voorkomen.
OPMERKING: Breng geen zoutoplossing aan op de injectieplaats van de poortader. Dit kan een nieuwe bloeding veroorzaken. - Plaats de darmen voorzichtig terug in de buikholte.
- Hecht het peritoneum met behulp van 4-0 polyglactine hechtingen.
- Til beide zijden van de huid op met een tang. Breng huidnietmachines aan om de huidincisie te sluiten. Pas op dat u de darm niet niet niett.
- Schakel het isofluraan uit, maar houd de zuurstofstroom draaiende. Houd de muis zorgvuldig in de gaten. Wanneer de muis ontwaakt, plaatst u de muis in een lege kooi op een verwarmingskussen. De muis ontwaakt meestal binnen 5 minuten.
- Houd de muis zorgvuldig in de gaten totdat deze bij bewustzijn is en normaal kauwt.
- Injecteer subcutaan 0,1 mg/kg buprenorfine 4 uur na de operatie in de muis.
- Injecteer 0,1 mg/kg buprenorfine elke 24 uur in de muis gedurende de volgende 2 dagen.
- Controleer de muizen dagelijks gedurende een week na de operatie. Controleer hechtingen en wondgenezing.
- dagen na de operatie, verwijder huid nietmachines met behulp van een nietmachine remover.
4. Beoordeling van tumorgroeikinetiek door in vivo bioluminescente beeldvorming
OPMERKING: Als Firefly-expressing tumoroïden worden gebruikt voor injectie, kan de progressie van gemetastaseerde tumoren wekelijks worden gevolgd door in vivo beeldvorming zoals beschreven38,39. Luciferase uitgedrukt door kankercellen kan immuunreacties tegen de kankercellen uitlokken en de tumorgroei beperken40. Voorzichtigheid is dus geboden bij het analyseren van immuunfenotypen en kankerprogressie in een muismodel met behulp van luciferase-tot expressie brengende tumorcellen.
- Bereid een 30 mg /ml oplossing van D-luciferine met behulp van steriele PBS. Bescherm het tegen licht. D-luciferine moet tot gebruik worden bewaard in aliquots bij -20 °C.
- Scheer de buik en thorax met een elektronisch scheerapparaat. Dit kan tot 1 dag voor in vivo beeldvorming.
- Injecteer 150 mg/kg lichaamsgewicht D-luciferine intraperitoneaal in muizen (d.w.z. als het lichaamsgewicht van de muis 30 g is, injecteer dan 150 μL van de D-luciferine-oplossing).
- Plaats de muizen in een anesthesiekamer en verdoof ze. Gebruik 5% isofluraan voor inductie en 2%-3% voor onderhoud.
- leg de muizen min later in een zijwaartse positie (rechtsboven). Verkrijg bioluminescentiebeelden met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) zoals eerder beschreven38,39.
OPMERKING: Muizen zijn stabieler in een laterale positie in vergelijking met de rugligging. Daarom verdient een laterale positie de voorkeur om een luminescentiebeeld te verkrijgen vanuit een consistent brandpuntsvlak. - Plaats de muizen in een lege kooi en bewaak hun herstel.
- Definieer interessante gebieden op de bovenbuik met behulp van Living Image Software zoals beschreven38. Kwantificeer de totale flux als een surrogaat voor het aantal tumorcellen.
5. Overlevingsanalyse en weefselverzameling
- Controleer muizen zorgvuldig op klinische symptomen van metastasen zoals een opgezwollen buik.
- Euthanaseer een muis door CO 2-inademing zodra deze humane eindpunten bereikt.
OPMERKING: Gebruik een onderzoekseindpunt dat is goedgekeurd door de dierethische commissie van het instituut. Om een humaan eindpunt te bepalen, werd een klinisch registratieblad gebruikt; scores werden berekend door één punt te geven voor de aanwezigheid van elk van de volgende observaties: gewichtsverlies > 15%, gebogen houding, gegolfde vacht, uitdroging, verminderde beweging, opgezwollen buik of grimas in het gezicht. Zodra een score van 3 was bereikt, werden de muizen op humane wijze geëuthanaseerd. - Voer onmiddellijk na euthanasie transcardiale perfusiefixatie uit met 30-50 ml 10% formaline in een zuurkast, zoals beschreven41. Maak vóór de perfusie verschillende kleine incisies (tot 1 cm elk) met een schaar in het normale deel van de lever om uitlaatkleppen voor bloed en formaline te genereren. Bij perfusie zal de leverkleur veranderen van rood naar bruin.
OPMERKING: Als micrometastasen in macroscopisch normale levergebieden een onderwerp van studie zijn, raden we onderzoekers aan om de lever niet te snijden, maar in plaats daarvan de superieure vena cava te knippen. Wanneer we deze methode echter hebben gebruikt, lijkt fixatie van de lever slechter in vergelijking met het snijden van de lever. Vooral als RNA in situ hybridisatie (ISH) gepland is om te worden uitgevoerd op leversecties, raden we aan om incisies in de lever te maken vóór intra-cardiale injectie van formaline, zoals hierboven beschreven. Dit maakt voldoende fixatie van het leverweefsel mogelijk, wat resulteert in behoud van RNA-integriteit voor ISH. - Plaats de lever en longweefsels in 10% formaline en fixeer 's nachts. Vervang de formaline door 70% ethanol, gevolgd door paraffine-inbedding.
- Voer hematoxyline- en eosinekleuring uit om het tumorgebied histologisch te evalueren. Voer immunohistochemie uit voor stromale markers van belang. Voer Picro-Sirus Red-kleuring uit om collageenpositieve gebieden te evalueren.
OPMERKING: De ImageJ-software42 kan worden gebruikt om immunohistochemie en Picro-Sirius Res-kleuringsgegevens te kwantificeren. Een kleurdeconvolutiefunctie en de MRI-fibrosetool kunnen worden gebruikt om respectievelijk 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-positieve gebieden en Picro-Sirius rood-positieve gebieden te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om AAV-gemedieerde overexpressie van een tumor-remmend stromaal gen, Islr 4,25,43,44, in hepatocyten te induceren, injecteerden we intraveneus Islr-coderende AAV8. 1,0 x 1011 virale genomen (vg) van AAV8-Islr, of als controlemiddel, AAV8-mRuby2, werd geïnjecteerd in de volwassen muizenstaartader (figuur 1A). Twee weken na de staartaderinjectie werden levers geoogst om de overexpressie van Islr in hepatocyten te valideren. We voerden RNAscope in situ hybridisatie45 uit en bevestigden dat 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)+ signalen werden waargenomen in de hele lever (figuur 1B). Er werden geen DAB+-signalen gedetecteerd in de lever van een met AAV8-mRuby2 behandelde muis.
We oefenden de portaladerinjectieprocedure door India-inkt te injecteren (1:1000 verdunning in PBS). Na het maken van een incisie in de bovenbuik werden de darmen voorzichtig uit de buikruimte gehaald om visualisatie van de poortader mogelijk te maken (figuur 2A). Poortaderinjectie van India-inkt leverde de inkt door de hele lever, maar niet naar de longen (figuur 2B). Als de inkt per ongeluk in andere vaten wordt geïnjecteerd, zoals de inferieure vena cava (IVC) of abdominale aorta, verandert de systemische circulatie van de inkt de longkleur in zwart. India-inkt helpt ook bij het identificeren van de hoeveelheid lekkage uit de poortader, wat wijst op pancreas- of peritoneale verspreiding.
Twee weken na de staartaderinjectie van AAV-mRuby2 werden ApcΔ/Δ en Trp53Δ/Δ darmkankerorganoïden (AP-tumoroïden) gedissocieerd naar afzonderlijke cellen en geïnjecteerd in de muisportaalader (figuur 3A). Om de metastatische tumorgroei te bevestigen en de histologie te evalueren, verzamelden we de levers 3-4 weken na de poortaderinjectie (d.w.z. op een getimed punt in plaats van op een humaan eindpunt), voordat prominente necrose histopathologische analyses verstoort. Macroscopisch resulteerde de poortaderinjectie van tumoroïden in meerdere witte tumorknobbels in de lever (figuur 3B). We ontdekten dat intra-miltinjectie van hetzelfde celnummer van tumoroïden geen grote gemetastaseerde tumormassa genereerde. Dit suggereert dat de portale aderinjectie efficiënter geïnduceerde levermetastasen in vergelijking met het intra-miltinjectiemodel. Hematoxyline- en eosinekleuring van de CRC-levermetastasen geïnduceerd door de poortaderinjectie toonden histopathologie van matig gedifferentieerd tubulair adenocarcinoom vergezeld van een desmoplastische stromale reactie en necrose (figuur 3C). Deze stromarijke histologie vatte getrouw die van menselijke CRC-levermetastasen samen (figuur 3C), waardoor dit model geschikt is voor translationeel onderzoek naar het gemetastaseerde tumorstroma. Bovendien toonde immunohistochemie voor alfa-gladde spier actine (αSMA), een gevestigde marker voor CAFs, aan dat ongeveer 7% van de tumorgebieden αSMA-positief was, wat de aanwezigheid van CAFs in dit muismodel bevestigde (figuur 3D,E). Picro-Sirius rode kleuring die collageen46 kleurt, toonde overvloedige ECM in het tumormes met ongeveer 13% van de tumorgebieden positief voor collageen (figuur 3D, E). Immunohistochemie voor EPCAM, een epitheliale afstammingsmarker, onthulde dat de gemetastaseerde CRC tumorontluiking vertoonde (een enkele tumorcel of een celcluster van maximaal vier tumorcellen) die kenmerkend is voor een slechte prognose colorectale kanker47 (figuur 3F). De Ki67-labelingsindex in de gemetastaseerde CRC was ongeveer 80%, wat aangeeft dat de meeste tumorcellen mitotisch actief zijn (figuur 3G,H).
We voerden muisoverlevings- en tumorgroeikinetiekanalyses uit in dit preklinische model. De muizen in ons eerste pilotcohort vertoonden een mediane overleving van 57 dagen na tumoroïde injectie in de poortader (N = 4 muizen; Figuur 4A). Dit werd later gerepliceerd in grotere controle AAV8-mRuby2-geïnjecteerde groepen25. Bij humaan eindpunt (zoals weergegeven in NOTE, stap 5.2) vertoonden 3 van de 4 muizen in de pilotgroep ascites, wat ook wordt waargenomen bij patiënten met gevorderde levermetastase48. Om de tumorgroei te beoordelen, werd een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) gebruikt om tumoroïde-afgeleide luminescentie te meten (figuur 4B,C). De bioluminescentiesignalen werden waargenomen in de bovenbuik, wat wijst op leverspecifieke tumorgroei (figuur 4B). Als IVIS-signalen worden waargenomen in de onderbuik, duidt dit op peritoneale verspreiding of secundaire metastasen naar buikorganen. De wekelijkse in vivo beeldvorming maakte een longitudinale beoordeling van tumorgroei in elke muis mogelijk (figuur 4C), waardoor het gemakkelijker werd om een therapeutisch effect te volgen in onze daaropvolgende grotere studie. De tumoropnamesnelheid was 100% (4/4 muizen) zoals beoordeeld door IVIS-signalen. In dit experiment werd geen macroscopisch duidelijke longmetastase waargenomen op het moment van weefselverzameling (0/4 muizen).
Ten slotte onderzochten we of AAV-gemedieerde hepatocyt-gerichte toediening van een kankerbeperkend CAF-gen, Islr 4,25, de groei van CRC-levermetastase in dit preklinische muismodel kon remmen. Met name met AAV8-Islr behandelde muizen vertoonden een verbeterde muisoverleving en verminderde IVIS-signalen van tumoren (figuur 5A-C)25. Immunohistochemie voor gefosforyleerd Smad1/5/8 toonde aan dat hepatocytenoverexpressie van ISLR, een BMP-signaleringspotentiator, de BMP-signalering in gemetastaseerde tumoren verhoogde (figuur 5D). Behandeling met AAV8-Islr verminderde het aantal Ki67+ prolifererende cellen in de CRC levermetastase (figuur 5E). Voor een volledige beschrijving van de resultaten, zie Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Onze collectieve gegevens geven aan dat AAV8-gemedieerde toediening van een tumor-remmend gen aan hepatocyten, een vitaal bestanddeel van het lever gemetastaseerde tumorstroma29, een effectieve preventieve / therapeutische aanpak zou kunnen zijn voor CRC-levermetastasen (figuur 5F).
Figuur 1: Staartader toegediend AAV8-Islr genereert Islr-overexpressie in de lever. (A) Experimenteel schema met de staartaderinjectie van AAV8, gevolgd door poortaderinjectie van colorectale kanker (CRC) organoïden. ISH, in situ hybridisatie; IHC, immunohistochemie; qRT-PCR, kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie. (B) Representatieve foto's. RNA in situ hybridisatie voor Islr werd uitgevoerd met behulp van levers van AAV8-Islr of AAV8-mRuby2-behandelde muizen. De levers werden 2 weken na staartaderinjectie verzameld. Schaalbalken, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Poortaderinjectie van India-inkt resulteert in de levering aan de lever, maar niet aan de long. (A) Representatieve foto's met de anatomie van de bovenbuik na laparotomie. Merk op dat, voor visualisatie van de poortader, de darmen buiten de buikholte worden genomen. De rechter foto toont een anatomische annotatie van elk orgaan en vat. De gele pijl geeft de injectieplaats aan. IVC, Inferieure vena cava. (B) Representatieve foto's van de lever en longen na poortaderinjectie van India-inkt. De gele pijlpunten geven schepen aan die bevlekt zijn met de India-inkt. Schaalbalken, 1 cm . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Poortaderinjectie van colorectale kankerorganoïden genereert stromarijke levermetastasen. (A) Experimenteel schema met poortaderinjectie van ApcΔ/Δ en Trp53Δ/Δ darmkankerorganoïden (AP-tumoroïden). Schaalbalk, 200 μm. T, tumoroïden. (B) Representatieve macroscopische foto's van de levers die 3-4 weken na poortaderinjectie (links) of intra-miltinjectie (rechts) werden verzameld. 5,0 x 105 enkele cellen van AP-tumoroïden werden geïnjecteerd in de poortader of milt. Intra-milt injectie werd uitgevoerd zoals beschreven13. Witte knobbeltjes duiden op tumoren. T, Tumor; N, Normale lever. (C) Representatieve hematoxyline en eosine (H&E) kleuring foto's van de CRC levermetastasen van het portale ader injectie muis model (links en midden) en mens (rechts). T, Tumor; N, Normale lever; S, Stroma; Nec, Necrose. De gele stippellijn geeft een grens aan tussen de tumor en de normale lever (links). (D en E) Immunohistochemie (IHC) voor alfa-gladde spier actine (αSMA; links) en Picro-Sirius rode kleuring (rechts). (D) Representatieve foto's. (E) Kwantificering van αSMA-positieve gebieden (links) en Picro-Sirius rood-positieve gebieden (rechts). N = 4 muizen, 5 HPF's (High Power Fields; 400x)/muis. (F) Representatief beeld met immunohistochemie voor EPCAM, een epitheelcelmarker. De groene stippellijnen duiden op ontluikende tumor. (G en H) Immunohistochemie voor Ki67, een celproliferatiemarker. (G) Representatieve afbeelding. (H) Percentage Ki67+ cellen in totaal epitheelcellen. Epitheelcellen werden gevisualiseerd door hematoxyline counterstaining. N = 4 muizen, 5 HPF's/muis. In (B)-(H) werden alle leverweefsels van muizen 3-4 weken na injectie van AP-tumoroïden verzameld. Gemiddelde ± S.E.M. Elke stip vertegenwoordigt een gemiddelde waarde van 5 HPF's van een muis (E en H). Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm (B), 1 mm (C; links), 100 μm (C; midden en rechts) en 50 μm (D, F en G). Merk op dat de studie met menselijke weefsels werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Overlevingsanalyse en tumorgroeikinetische analyse door in vivo beeldvorming. (A) Kaplan-Meier overlevingscurves. N = 4 muizen. (B,C) In vivo beeldvormingssysteem (IVIS) werd gebruikt om de kinetiek van tumorgroei te evalueren. (B) Een representatief beeld. Het gebied in het rode vak werd gebruikt voor kwantificering. (C) Groeikinetiek. Luciferasesignalen van elke muis worden getoond. N = 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: AAV8-gemedieerde genafgifte van Islr aan hepatocyten verhoogt de BMP-signalering, vermindert tumorproliferatie en verbetert de overleving van muizen in een portale aderinjectiemodel van CRC-levermetastase. (A) Kaplan-Meier overlevingscurve. Twee weken na staartaderinjectie van AAV-Islr of AAV-mRuby2 werd poortaderinjectie van CRC-tumoroïden uitgevoerd. (B en C) Tumoroïde-afgeleide luciferasesignalen werden geëvalueerd met behulp van IVIS. (B) Representatief beeld. (C) Kwantificering van IVIS-signalen. N = 5 (AAV-mRuby2) en 8 (AAV-Islr) muizen. Gemiddelde ± S.E.M. (D) Representatieve foto's. Immunohistochemie (IHC) voor gefosforyleerd Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 is een stroomafwaarts molecuul van botmorfogenetisch eiwit (BMP) signalering dat wordt gefosforyleerd bij BMP signalering activering49. N = elk 4 muizen. (E) Representatieve foto's. Immunohistochemie voor Ki67. N = elk 4 muizen. (F) Grafische samenvatting. AAV-gemedieerde hepatocyt-gerichte genafgifte van een kankerbeperkend stromaal gen kan dienen als een therapeutische strategie om CRC-metastagenese te remmen. AAV8-gemedieerde overexpressie van Islr in hepatocyten hermodelleerde de gemetastaseerde niche door BMP-signalering te vergroten en de progressie van CRC-metastase te beperken. Voor gedetailleerde informatie, zie Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Log-rank test (A), en twee-weg herhaalde-metingen ANOVA (analyse van variantie) met post-hoc Sidak's meervoudige vergelijkingstest in week 3 (C). Schaalbalken, 50 μm. Figuur 5A-C is herdrukt uit Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we aangetoond dat poortaderinjectie van CRC-organoïden van muizen reproduceerbaar fibroblastrijke levermetastasen genereert die histologische kenmerken van menselijke CRC-levermetastasen nabootsen. Bovendien, in combinatie met stroma-gerichte therapieën zoals AAV8-gemedieerde gentherapie, dient dit preklinische model als een nuttig hulpmiddel om therapeutische effecten op de overleving van muizen en tumorgroei te beoordelen.
Er zijn in ieder geval twee cruciale stappen in het protocol. Ten eerste is het belangrijk om een eencellige suspensie van tumoroïden voor te bereiden door de organoïden volledig te trypsiniseren en een gaasfilter te gebruiken om celklonten te verwijderen. Onvolledige dissociatie van tumoroïden resulteert in grote celaggregaten, waarvan injectie de poortader kan afsluiten. Dit veroorzaakt een infarct van de lever en de dood van dieren22. Ten tweede is het tijdens poortaderinjectie noodzakelijk om bloedingen uit de poortader te minimaliseren. De naald moet op de juiste manier in de poortader worden ingebracht. Om punctie van de andere kant van de poortader te voorkomen, moet de hoek van de ingebrachte naald bijna parallel aan de poortader worden gehouden. Om scheuren van de poortader tijdens de injectie te voorkomen, mag de naald niet worden verplaatst zodra deze volledig in de poortader is ingebracht. Onmiddellijk na het verwijderen van de naald uit de poortader, is het van vitaal belang om gedurende ten minste 5 minuten druk uit te oefenen op de injectieplaats met een wattenstaafje.
Het celnummer voor injectie moet worden aangepast aan de ontvangende muis (bijv. immunocompetente versus immunodeficiënte muis) en tumorigeniciteit van de organoïde lijn. In onze experimenten was injectie van 5,0 x 105 enkele cellen in 100 μL suspensie voldoende om levermetastasen te genereren bij immunocompetente muizen. Het verhogen van het celaantal zou het risico op embolie in de poortader en de dood van dieren14 kunnen vergroten en moet daarom zorgvuldig worden overwogen. Gezien het feit dat eerdere artikelen 5 x 104 tot 5 x 105 cellen in 100 μL gebruikten voor tumoroïde injectie in het portaal of mesenteriale ader 25,26,27,28, zijn we van mening dat dit celgetalbereik een goed startpunt zou zijn voor optimalisatie.
Een beperking van de portale aderinjectiebenadering is dat deze niet de volledige cascade van CRC-metastagenese volledig samenvat. Levermetastase van kanker vereist vijf belangrijke stappen: (1) invasie van kankercellen op de primaire plaats, (2) intravasatie in het vat, (3) celoverleving in de portale circulatie, (4) extravasatie van de poortader naar het leverparenchym en (5) kolonisatie in de gemetastaseerde niche50. Het portaaladerinjectiemodel laat alleen onderzoek van stappen (3)-(5) toe. Om inzicht te krijgen in de andere metastatische processen, is het noodzakelijk om andere modellen te gebruiken, zoals in vitro modellen en /of een Notch1-mutant primair CRC-muismodel dat vaak uitzaait naar de lever51.
De betekenis van de poortaderinjectiemethode ten opzichte van de bestaande methoden omvat leverspecifieke groei en hogere tumorbelasting. Peritoneale verspreiding in andere injectiemodellen en primaire tumorgroei in primaire CRC-modellen kunnen de analyse van levermetastaseprogressie verstoren. Onze poortaderbenadering genereert daarentegen snel leverspecifieke tumoren, waardoor overlevings- en tumorgroeianalyses worden vereenvoudigd.
Een groot voordeel van organoïde transplantatie ten opzichte van cellijninjectie is dat poortaderinjectie van tumoroïden de fibroblastrijke tumormicro-omgeving genereerde die een desmoplastisch kenmerk van menselijke gemetastaseerde CRC fenocopiseert. Organoïde kweekomstandigheden recapituleren kenmerken van de tumormicro-omgeving en ondersteunen intestinale stamcelpopulaties, inclusief het inbedden van cellen in een rijke en complexe 3D ECM met een gedefinieerde combinatie van groeifactoren24,52. Dit resulteert in tumorcelvoortplanting op een manier die het genetische landschap van de brontumorbehoudt 52,53. Daarentegen is traditionele 2D-cultuur van tumorcellijnen geassocieerd met klonale selectie en afwijkende genomische / transcriptomische veranderingen die de kenmerken van de oorspronkelijke kankers niet getrouw weerspiegelen54. We speculeren dat de relatief barre kweekomstandigheden voor 2D-kweek van kankercellijnen cellen dwingen zich aan te passen aan een gebrek aan ECM / groeifactorsignalen die vervolgens in vivo kunnen resulteren in stromaarme tumoren, omdat de cellen niet langer stroma-afgeleide signalen nodig hebben om te overleven.
Door het organoïde portale aderinjectiemodel te combineren met AAV8-gemedieerde gentherapie, ontdekten we dat levering van een kankerremmende lading aan hepatocyten vóór de kolonisatie van kankercellen in de lever de (pre-)gemetastaseerde niche kon wijzigen om de groei van CRC-metastase te remmen25. Bemoedigend is dat klinische studies hebben aangetoond dat AAV-gemedieerde in vivo genoverdracht naar de lever langdurige expressie van een transgen induceert en een effectieve en veilige modaliteit kan zijn om niet-neoplastische genetische ziekten te behandelen 30,31,55. In de toekomst kan het gebruik van hepatocyten om levermetastasen te voorkomen via de AAV-aanpak potentiële klinische waarde hebben bij kankerpatiënten met een hoog risico op metastasen.
Samenvattend toont ons artikel aan dat CRC organoïde transplantatie via de poortader fibroblastrijke levermetastasen genereert, die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën gericht op het stroma. Door de poortaderinjectie te koppelen aan stroma-gerichte therapie zoals AAV-gemedieerde genafgifte, kan men nieuwe stromale doelen identificeren om de progressie van CRC-metastase te beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Health and Medical Research Council (APP1156391 aan D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 naar D.L.W., APP1140236 naar S.L.W., APP1099283 naar D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project namens zijn donoren en de staatsregering van Zuid-Australië via het ministerie van Volksgezondheid (MCF0418 tot S.L.W., D.L.W.); een grant-in-aid voor wetenschappelijk onderzoek (B) (20H03467 aan M.T.) in opdracht van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 en 19gm1210008s0101 to A.E.); het Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) van AMED (19cm0106332h0002 tot A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (to H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (to H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (to H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (to K.G.).
We bedanken Dr. Leszek Lisowski van Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIË) voor het produceren van recombinante AAV-vectoren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
- Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
- Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
- Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
- Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
- Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
- Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
- Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
- Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
- Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
- McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
- Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
- Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
- Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
- Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
- de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
- Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
- Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
- George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
- Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
- Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
- Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
- Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
- Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
- Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
- Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).
