Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Portal vene injeksjon av kolorektal kreft organoider for å studere levermetastase Stroma

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62630
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5, 1,2, 2, 1,2, 6, 3,4,7, 3, 2, 1,2
1Adelaide Medical School, University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy, Fujita Health University

Summary

Portal vene injeksjon av kolorektal kreft (CRC) organoider genererer stroma-rik levermetastase. Denne musemodellen av CRC levermetastase representerer et nyttig verktøy for å studere tumor-stroma interaksjoner og utvikle nye stroma-rettet terapeutiske som adeno-assosierte virusmediert genterapi.

Abstract

Levermetastase av kolorektal kreft (CRC) er en ledende årsak til kreftrelatert død. Kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er), en viktig del av tumormikromiljøet, spiller en avgjørende rolle i metastatisk CRC-progresjon og forutsier dårlig pasientprognose. Det er imidlertid mangel på tilfredsstillende musemodeller for å studere krysstale mellom metastatiske kreftceller og CAF-er. Her presenterer vi en metode for å undersøke hvordan levermetastaseprogresjon reguleres av den metastatiske nisjen og muligens kan begrenses av stromastyrt terapi. Portal vene injeksjon av CRC organoider genererte en desmoplastisk reaksjon, som trofast recapitulated fibroblast-rik histologi av humane CRC lever metastaser. Denne modellen var vevsspesifikk med en høyere tumorbyrde i leveren sammenlignet med en intra-splenic injeksjonsmodell, noe som forenkler musens overlevelsesanalyser. Ved å injisere luciferase-uttrykkende tumororganoider, kan tumorvekstkinetikk overvåkes ved in vivo-avbildning . Videre gir denne prekliniske modellen en nyttig plattform for å vurdere effekten av terapeutiske behandlinger rettet mot tumormesenchyme. Vi beskriver metoder for å undersøke om adeno-assosiert virusmediert levering av et tumorhemmende stromal gen til hepatocytter kan ombygge tumormikromiljøet og forbedre musens overlevelse. Denne tilnærmingen muliggjør utvikling og vurdering av nye terapeutiske strategier for å hemme levermetastase av CRC.

Introduction

Kolorektal kreft (CRC) er en viktig årsak til kreftdødelighet over hele verden1. Mer enn halvparten av CRC-pasientene utvikler levermetastase som oppstår gjennom portalveneformidlingen1. For tiden er det ingen effektive terapeutiske midler som kan kurere avansert levermetastase, og de fleste pasienter bukker under for metastatisk sykdom.

Den metastatiske nisjen eller tumormikromiljøet spiller en nøkkelrolle i engraftment og vekst av spredte CRC-celler2. Kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er), en fremtredende komponent i tumormikromiljøet, fremmer eller begrenser kreftprogresjon gjennom utskillelse av vekstfaktorer, ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM), og modulerer immunlandskap og angiogenese 3,4,5. CAF-er gir også motstand mot kjemoterapi og immunterapi3. Videre regulerer CAF-er initiering og progresjon av CRC levermetastase og forutsi prognose hos pasienter med CRC 3,6,7,8. Dermed kan CAF-relaterte faktorer utnyttes for utvikling av terapeutiske strategier for å hemme CRC levermetastase. Mangelen på tilfredsstillende musemodeller for å studere den metastatiske tumorstrommaen har imidlertid vært et stort hinder for å utvikle stroma-målrettede terapier.

For tiden inkluderer dyremodeller for å studere CRC levermetastase primære CRC-modeller som spontant utvikler levermetastase og kreftcelletransplantasjonsmodeller i leveren. Primære CRC-musemodeller, som genetisk konstruerte musemodeller og kolonisk injeksjon av kreftceller, viser sjelden metastase til leveren 9,10,11,12. Videre, selv om en levermetastase observeres, viser disse modellene lang latens fra den primære tumorinduksjonen til metastase, og potensielt dør av primær tumorbyrde12. For å effektivt generere CRC levermetastaser, blir dyrkede CRC-celler transplantert i leveren ved hjelp av tre injeksjonsmetoder: intra-splenic injeksjon, direkte intra-parenchymal injeksjon i leveren, og portal vene injeksjon. Intra-praktisk injiserte kreftceller spredt inn i miltveien, portalvenen, og til slutt til leveren13,14. Imidlertid gir den intra-spleniske injeksjonen et lavere tumortakforhold sammenlignet med andre transplantasjonsmodeller 15,16. Med intra-splenic injeksjon utføres kirurgisk fjerning av milten for å unngå kreftvekst i milten, noe som potensielt kan kompromittere immuncellemodning17. Videre kan intra-splenic injeksjon også resultere i utilsiktet tumorvekst i milten og bukhulen18, noe som kompliserer levermetastaseanalyser. Direkte intraparenchymal injeksjon i leveren induserer effektivt levermetastase 16,19,20. Likevel, denne tilnærmingen ikke fullt ut rekapitulere et biologisk trinn i levermetastase som naturlig oppstår gjennom portal vene formidling. Ved hjelp av direkte injeksjon i leveren, oppføring av kreftceller i en ikke-portal, men systemisk sirkulasjon kan også resultere i flere store lungemetastaser16. Selv om et flertall av pasienter med CRC levermetastase viser flere tumor knuter i leveren21, direkte injeksjon i en bestemt lever lobe genererer en enkelt tumormasse 19,20. Portal vene injeksjon eller mesenterisk vene injeksjon, men teknisk utfordrende, tillater effektiv levering av tumorceller i leveren på en måte som rekapitulerer vekstmønstre sett hos pasienter17. Denne strategien kan minimere muligheten for sekundære metastaser og muliggjør rask vekst av kreftceller i leveren, noe som forenkler musens overlevelsesanalyser.

Historisk ble kolorektal kreftcellelinjer som mus MC-38, human HT-29 og SW-620 brukt til å generere musemodeller av levermetastase22,23. Imidlertid induserer disse kolorektal kreftcellelinjene ikke en desmoplastisk stromal reaksjon. Lavt stromalt innhold i svulstene gjør det vanskelig å undersøke de biologiske rollene til kreftrelaterte fibroblaster. Nylige fremskritt innen CRC organoider og deres transplantasjon har tilbudt nyttige plattformer for å vurdere vitale roller av stroma i kreftprogresjon24. Levertransplantasjon av CRC organoider genererer et fibroblastrikt tumormikromiljø og har gitt ny innsikt i stromal forskning 6,25. For tiden har portal eller mesenterisk veneinjeksjon av organoider blitt en gullstandard tilnærming for å generere CRC levermetastase 6,25,26,27,28. Likevel, så vidt vi vet, har ingen tidligere papirer beskrevet detaljerte metoder for portalveneinjeksjon av kolorektale tumoroider. Her presenterer vi en metodikk for bruk av portal vene injeksjon av CRC organoider for å utvikle nye adeno-assosiert virus (AAV)-mediert stroma-rettet terapi.

Hepatocytter er en viktig bestanddel av det metastatiske tumormikromiljøet i leveren og spiller en kritisk rolle i metastatisk kreftprogresjon29. Inspirert av suksessen til AAV genterapi tilnærminger for å indusere proteinuttrykk i hepatocytter hos ikke-neoplastiske pasienter30,31, undersøkte vi en lignende tilnærming, men hadde som mål å modifisere leversvulstmikromiljøet i CRC25. Som sådan beskriver vi også heri hale vene injeksjon av AAV8 å indusere uttrykk for anti-tumorigene proteiner for å endre leveren tumor mikromiljøet. AAV8-serotypen, utpekt ved valg av viralt kapsidprotein under virusproduksjon, fører til høy transduksjonseffektivitet spesielt av hepatocytter (dvs. målrettet genuttrykk i leversvulstmikromiljøet)32. Vi har tidligere vist at Islr (immunglobulin superfamilie som inneholder leucinrik repetisjon) er et CAF-spesifikt gen som induserer beinmorfogenetisk protein (BMP) signalering, reduserer CRC tumoroid vekst, og fremmer Lgr5 + intestinal stamcelle differensiering25. Vi testet om AAV8-mediert overekspression av det kreftbegrensende stromale genet Islr, i hepatocytter kunne dempe levermetastaseprogresjon ved å utføre portalveneinjeksjon av CRC tumoroider hos AAV8-Islr-behandlede mus.

I dette papiret beskriver vi først hale vene injeksjon prosedyren for lever tropic AAV. Deretter beskriver vi en metode for tumoroid cellepreparat og portalveneinjeksjon i de AAV-behandlede musene. Til slutt presenterer vi tilnærminger for å overvåke metastatisk tumorprogresjon for å vurdere effekten av stroma-rettet terapeutisk behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer i denne artikkelen ble gjennomgått og godkjent av South Australian Health and Medical Research Institute Animal Ethics Committee (Godkjenningsnummer, SAM322).

1. Hale vene injeksjon av adeno-assosiert virus

MERK: Adeno-assosiert virus (AAV) bør håndteres som en biofare under Biosafety Level 1 retningslinjer. Se den publiserte protokollen for AAV-forberedelse, rensing og titrering33. Hepatocyte-tropic AAV, AAV834, som koder cytomegaloviruset (CMV) promotor-Islr-genet , ble brukt i denne studien25. For å indusere AAV-mediert overekspression kan AAV-dosering kreve optimalisering avhengig av promoteringsaktiviteten, genet og musevekten.

  1. Fortynn AAV-vektoren i 150 μL aliquots som inneholder 1,0 x10 11 virale genomer, ved hjelp av steril fosfatbufret saltvann (PBS) og hold den på is. Personlig verneutstyr bør brukes til å håndtere AAV.
    MERK: Gjentatt fryse- og tinesyklus reduserer virustitren og bør unngås. Den lager virale løsningen skal lagres i en -80 °C fryser.
  2. Slå på en varmeboks (dyrevarmekammer) for å forvarme til 35 °C.
  3. Hold en mus og påfør en aktuell anestesikrem på hele lengden av halen minst 15 min før haleveneinjeksjonen.
    MERK: Dette er et valgfritt skritt og er kanskje ikke nødvendig hvis det ikke kreves av instituttets dyreetiske komité. Følg protokollen godkjent av den lokale dyreetiske komiteen. I dette eksperimentet25 ble en Rosa26-Cas9-mus brukt til AAV-injeksjon og påfølgende portalveneinjeksjon av CRC-organoider. Gitt at tumoroider som ble brukt i denne studien ble avledet fra en Rosa26-Cas9 mus (C57BL / 6 x 129 genetisk bakgrunn), ble denne musestammen også brukt som immunotokmpetent, syngeneiske mottakere av tumortransplantasjonen. Mannlige og kvinnelige Rosa26-Cas9 mus (6- til 24 uker gamle) ble brukt.
  4. Plasser musen i varmeboksen. La musen stå i opptil 15 min for å varme og utvide haleårene.
  5. Sikre musen forsiktig i en gnagerbeherskelse. Plasser halen under en varmelampe for å sikre full utvidelse av hale årer.
  6. Trekk opp 150 μL fortynnet AAV (fremstilt i trinn 1.1) i en steril sprøyte med lavt dødt rom med en 27-30 G nål.
  7. Flytt varmelampen og identifiser sidehalevenen som ligger på sidene av halen. Sett liten spenning på halen med fingrene slik at halen blir rett.
  8. Sett sakte 2-3 mm av nålen, skrå opp, inn i venen. Nålen skal være nesten parallell med halen (opptil 15° fra halen).
    MERK: Blodtilstrømning i sprøyten kan observeres hvis kanylen er plassert i venen.
  9. Injiser sakte. Hvis det observeres en motstand eller hevelse i huden observeres, fjern nålen og sett den inn over det første stedet eller til den andre laterale venen.
  10. Vent i ca 5 s etter at injeksjonen er fullført, og fjern deretter kanylen sakte. Påfør straks forsiktig trykk på injeksjonsstedet med en ren gasbind eller papirhåndkle til blødningen stopper.
  11. Slipp musen forsiktig inn i buret. Overvåk dyret for å sikre at blødningen har stoppet.
    MERK: Genoverekspression i leveren kan vurderes 1 til 2 uker etter AAV hale vene injeksjon. Dette kan for eksempel bekreftes ved RNA in situ hybridisering (ISH), immunhiistokjemi (IHC), vestlig blotting eller kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR; Figur 1A,B). I en tidligere publisert studie25 ble AAV8-Islr brukt til å overekspressere mus islr gen i hepatocytter og overekspressionen ble oppdaget av RNA ISH (figur 1A, B).

2. Celleforberedelse for kolorektal kreftorganoider

MERK: CRC-organoider som brukes til dette eksperimentet inneholder utelukkende epitelceller. Kultur og generering av CRC organoider har tidligere blitt beskrevet 25,35. Kort sagt, normale koloniske epitelceller ble isolert fra tykktarmen til en Rosa26-Cas9 mus ved hjelp av en kryptisolasjonsbuffer (5 mM EDTA (etylendiamintetraacetat) i iskald PBS), og deretter innebygd i kjellermembranmatrisemedium, og dyrket i organoid vekstmedium som beskrevet i referanse35. Deretter ble Apc- og Trp53-mutasjoner introdusert til de koloniske epitelcellene ved å overtrykke enkeltguide RNAer som retter seg mot Apc og Trp53 ved hjelp av lentivirusuttrykksprotokoll. Enkle organoid kloner ble håndplukket25. EnpcΔ/Δog Trp53Δ/Δ tykktarmskreftorganoider (AP tumoroider), ble injisert som 5,0 x 105 enkeltceller i 100 μL PBS med 10 μM Y-27632 i portalvenen per mus, med organoidkultur og encellet forberedelse beskrevet nedenfor.

  1. Kultur CRC organoider i kjelleren membran matrise middels kupler i en 24-brønns plate eller 10 cm tallerken 3-5 dager før portalen vene injeksjon for å oppnå 50-400 μm diameter organoider.
  2. Forbered tilstrekkelig mengde celleavløsningsløsning ved å legge til Y-27632 til 10 μM konsentrasjon, nok til å fordøye antall organoider som dyrkes for injeksjonen. Forvarm i et 37 °C vannbad.
    MERK: Celleavløsningsløsningen som brukes i denne protokollen er en rekombinant celle-dissosiasjonsenzymblanding og brukes som erstatning for trypsin i organoid kultur (se Materialtabell). Det reduserer cellulær skade forårsaket av celledissosiasjon sammenlignet med trypsin36. Y-27632 er en Rho kinase inhibitor og hemmer dissosiasjonsindusert celledød, og øker dermed encellet overlevelse37.
    1. For injeksjon i opptil fem mus, lag to rør som inneholder 40 ml av celleavløsningsløsningen for å fordøye 10-24 x 50 μL kjellermembranmatrisekupler med hver kuppel som inneholder ca. 300 organoider (50-400 μm diameter), dvs. hver mus injiseres med 2-4,8 kupler organoider (tilsvarende ca. 600-1440 organoider). Antall organoider som er nødvendige for å oppnå tilstrekkelig cellenummer, er avhengig av organoidlinjen, og bør derfor optimaliseres.
      MERK: Det andre 40 ml røret muliggjør en gjentatt fordøyelse med fersk celleavløsningsløsning for å oppnå dissosierte enkeltceller.
  3. Aspirer forsiktig det organoide mediet fra hver brønn.
  4. Tilsett 1 ml iskald PBS til hver brønn i en 24-brønnsplate. Hvis en 10 cm tallerken brukes, tilsett 10 ml iskald PBS til parabolen.
  5. Skrap av kjellermembranmatrisemediet ved hjelp av en P1000 pipettespiss. Overfør PBS/medium slurry til et 15 ml sentrifugerør.
  6. Skyll hver brønn med samme mengde PBS for å samle kjellermembranmatrisefragmenter og legg til 15 ml rør(er).
  7. Inkuber i 5 min på is. Denne inkubasjonen bidrar til å oppløse kjellermembranmatrisemediet.
  8. Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
  9. Aspirer supernatanten og sørg for ikke å forstyrre det pelleterte mediet og cellene.
  10. Tilsett 5 ml forvarmet celleavløsning fremstilt i trinn 2.2 til pelletsen, resuspender pellet 10 ganger, og overfør den tilbake til et 50 ml rør som inneholder fersk, forvarmet celleavløsningsløsning.
  11. Plasser røret i vannbadet på 37 °C. Inkuber i 5 min.
  12. Sentrifuger røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C.
  13. Gjenta trinn 2.9-2.11.
    MERK: Gjentatt enzymatisk fordøyelse gir effektiv celledissosiasjon i enkeltceller.
  14. Kontroller om organoidene er dissosiert i enkeltceller ved å pipettere 100 μL inn i en 96-brønns plate og observere under et mikroskop. Hvis mange organoider viser celleklumper som består av mer enn fire celler, kan det være nødvendig med lengre inkubasjon med celleavløsningsløsningen og fysisk dissosiasjon ved triturasjon med en 10 ml pipette.
  15. Når de fleste celler er enkeltceller, legg til 4 ml foster bovint serum (FBS) i 40 ml cellefjæring for å stoppe fordøyelsen. Skyll en 40 μm cellesil med 5 ml PBS.
  16. Før cellesuspensjonen gjennom cellesilen inn i et 50 ml oppsamlingsrør for å fjerne eventuelle celleklumper.
  17. Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
  18. Aspirer supernatanten. Tilsett 10 ml kald PBS i cellepelleten og overfør den til et 15 ml sentrifugerør.
  19. Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
  20. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 500 μL kald PBS med 10 μM Y-27632. Tell cellene.
  21. Juster cellekonsentrasjonen til 5,0 x 105 enkeltceller/ 100 μL, ved hjelp av PBS med 10 μM Y-27632. Plasser røret på isen til portalveneinjeksjonen er utført.
    MERK: Det anbefales å injisere dissosierte celler innen 4 timer etter dissosiasjon.

3. Portal vene injeksjon av CRC organoider

MERK: Alle kirurgiske instrumenter og kirurgiske gasbind må autoklaveres eller steriliseres før operasjonen. Denne protokollen er endret fra en tidligere protokoll17. I dette eksperimentet25 ble portal veneinjeksjon utført ved hjelp av Rosa26-Cas9 mus behandlet med AAV-mRuby2 eller AAV-Islr i trinn 1.

  1. Forbered et aseptisk kirurgisk område ved hjelp av sterile gardiner på en varmepute.
  2. Forbered kirurgiske instrumenter (saks og tang), kirurgisk og hemostatisk svamp, 4-0 polyglaktin sutur, bomullsknopper, hudstiftere, stifteapplikator, saltvann, buprenorfin og 33 G nål festet til en Hamilton-sprøyte. Skjær den hemostatiske svampen i 1,0 cm x 1,0 cm stykker.
  3. Juster posisjonen til lyskilden for å belyse det kirurgiske området.
  4. Injiser 0,1 mg/kg kroppsvekt av buprenorfin subkutant til en mus for kirurgisk smertebehandling.
  5. Bedøv musen med isofluran i et anestesikammer. Isoflurankonsentrasjon for induksjon og vedlikehold er vanligvis henholdsvis 5% og 2,5%. Kontroller om det ikke er noen reaksjon på tåklemmen før du starter neste prosedyre.
  6. Barber midten til musens øvre underliv med en elektrisk barbermaskin. Barbering bør utføres i et område fjernt fra det aseptiske kirurgiske området for å unngå hår som forurenser stedet.
  7. Rengjør snittstedet vekslende med Betadine og 80% etanol for å sterilisere det kirurgiske området. Gjenta tre ganger.
  8. Plasser musen på en varmepute i en liggende stilling med vedlikehold isofluran anestesi. Plasser en kirurgisk gardin med et hull over musens underliv.
  9. Løft bukhuden med tang og lag et 2-3 cm hudinnsnitt i midtlinjen med saks, kutt huden bare (ikke underliggende bukhinne). Snittet skal variere fra midt i magen til xiphoid-prosessen i brystbenet. Snittet bør ikke gå over den nedre enden av xiphoid-prosessen.
  10. Løft bukveggen helt med tang og gjør et lignende 2-3 cm snitt til bukhinnen med saks. Unngå å kutte tarmen og membranen.
  11. Soak kirurgisk gasbind med varm saltvann og plasser den på venstre side av snittet (på venstre side av musens kropp; til kirurgens høyre).
  12. Trekk forsiktig de indre organene (små og store tarmer) ut ved hjelp av en bomullsknopp gjennomvåt med saltvann. Plasser tarmene på gasbindet gjennomvåt med saltvann.
    MERK: Musens venstre tarm (dvs. tarmene til høyre) skal trekkes ut først, og deretter kan musens høyre tarm (dvs. tarmene til kirurgens venstre) trekkes ut.
  13. Juster tarmens posisjon for å visualisere portalvenen. Dekk tarmene med ekstra våt gasbind for å holde tarmene fuktige.
  14. Trekk tarmen forsiktig til venstre side med den våte gasbindet og påfør forsiktig spenning til venstre. Dette forenkler visualiseringen av portalvenen (figur 2A).
    MERK: Hvis visualisering av portalvenen er vanskelig, kan det å justere magens posisjon forsiktig med en våt bomullspinne hjelpe visualiseringen.
  15. Forsiktig pipette tumoroid suspensjon flere ganger for å oppnå en homogen celle suspensjon. Trekk sakte opp 100 μL av cellefjæringen i en Hamilton-sprøyte festet til en 33 G nål. Unngå luftbobler.
  16. Sett langsomt nålen, skrå opp, inn i portalvenen. Innsettingsdybden langs nålen skal være 3-4 mm, med nålevinkelen nesten parallell med portalvenen.
    MERK: Injeksjonen skal utføres i den godt visualiserte delen av portalvenen (vanligvis opptil 2 cm fra leveren). Unngå bevegelse av nålen etter at den er satt helt inn i portalvenen.
  17. Injiser tumorceller i 30 s. Injeksjonen bør utføres sakte for å forhindre okklusjon av portalvenen. Hvis injeksjonen er vellykket, endres leverens farge midlertidig fra rødt til hvitt.
  18. Fjern kanylen langsomt. Påfør umiddelbart forsiktig trykk på injeksjonsstedet med en tørr bomullspinne og vent i 5 min.
  19. Fjern bomullspinnen og påfør samtidig en hemostatisk svamp på injeksjonsstedet. Hold hemostatisk svamp med en bomullspinne eller tang og påfør forsiktig trykk i 5 min.
  20. Fjern trykket til den hemostatiske svampen og bekreft at det ikke er blødning fra injeksjonsstedet.
    MERK: Den bioabsorberbare hemostatiske svampen trenger ikke fjernes. Hvis du prøver å fjerne gasbindet, kan det føre til re-blødning fra injeksjonsstedet.
  21. Hvis blødning oppstår, utfør umiddelbart trykk hemostase med en bomullspinne i ca 10 min. Påfør deretter en ekstra hemostatisk svamp i ytterligere 5 minutter.
    MERK: Hvis det observeres ukontrollerbart blodtap, bør musen avlives i henhold til protokollen som er godkjent av instituttets dyreetiske komité.
  22. Fjern kirurgiske gasbind på tarmene. Bruk en sprøyte fylt med 5 ml saltvann, sprute saltvann til tarmene for å forhindre organadhesjon.
    MERK: Ikke påfør saltvann på injeksjonsstedet for portalvenen. Dette kan føre til re-blødning.
  23. Plasser tarmene forsiktig tilbake inne i bukhulen.
  24. Suturer bukhinnen ved hjelp av 4-0 polyglaktin suturer.
  25. Løft opp begge sider av huden med tang. Påfør hudstiftere for å lukke hudsnittet. Vær forsiktig så du ikke stifter tarmen.
  26. Slå av isofluranen, men hold oksygenstrømmen i gang. Overvåk musen nøye. Når musen våkner, plasser musen i et tomt bur på en varmepute. Musen våkner vanligvis innen 5 min.
  27. Overvåk musen nøye til den er bevisst og ambulerende normalt.
  28. Subkutant injisere 0,1 mg/kg buprenorfin til musen 4 timer etter operasjonen.
  29. Injiser 0,1 mg/kg buprenorfin i musen hver 24.
  30. Overvåk musene nøye daglig i en uke etter operasjonen. Kontroller suturer og sårheling.
  31. dager etter operasjonen, fjern hudstiftere ved hjelp av en stiftefjerner.

4. Vurdering av tumorvekstkinetikk ved in vivo bioluminescent avbildning

MERK: Hvis Firefly-uttrykkende tumoroider brukes til injeksjon, kan metastatisk tumorprogresjon overvåkes ukentlig ved in vivo-avbildning som beskrevet38,39. Luciferase uttrykt av kreftceller kan fremkalle immunresponser mot kreftcellene og begrense tumorvekst40. Dermed er forsiktighet garantert i å analysere immunfenotyper og kreftprogresjon i en musemodell ved hjelp av luciferase-uttrykkende tumorceller.

  1. Forbered en 30 mg/ml oppløsning av D-luciferin ved hjelp av steril PBS. Beskytt den mot lys. D-luciferin skal oppbevares i aliquots ved -20 °C til bruk.
  2. Barber magen og thoraxen med en elektronisk barbermaskin. Dette kan gjøres opptil 1 dag før in vivo-avbildning .
  3. Injiser 150 mg/kg kroppsvekt av D-luciferin intraperitonealt i mus (dvs. hvis musens kroppsvekt er 30 g, injiser 150 μL av D-luciferin-oppløsningen).
  4. Plasser musene i et anestesikammer og bedøv dem. Bruk 5% isofluran for induksjon og 2%-3% for vedlikehold.
  5. min senere, plasser musene i en lateral posisjon (høyre side opp). Anskaffe bioluminescensbilder ved hjelp av et in vivo-bildebehandlingssystem (IVIS) som beskrevet tidligere38,39.
    MERK: Musene er mer stabile i en lateral posisjon sammenlignet med liggende stilling. Derfor er en lateral posisjon å foretrekke for å få et luminescensbilde fra et konsistent fokusplan.
  6. Plasser musene i et tomt bur og overvåk utvinningen.
  7. Definer interesseområder på overlivet ved hjelp av Living Image Software som beskrevet38. Kvantifisere total flux som surrogat for tumorcellenummer.

5. Overlevelsesanalyse og vevsinnsamling

  1. Overvåk mus nøye for kliniske symptomer på metastaser som en distended abdomen.
  2. Avlive en mus ved CO 2-innånding når den når humane endepunkter.
    MERK: Bruk et studieendepunkt godkjent av instituttets dyreetiske komité. For å bestemme et humant endepunkt ble det brukt et klinisk journalark; score ble beregnet av ett punkt som ble gitt for tilstedeværelsen av hver av følgende observasjoner: vekttap > 15%, hunched holdning, ruffled frakk, dehydrering, redusert bevegelse, distended abdomen, eller ansikts grimace. Når en poengsum på 3 ble nådd, ble musene humant euthanized.
  3. Umiddelbart etter eutanasi, utfør transkardiell perfusjonsfiksering med 30-50 ml 10% formalin i en avtrekkshette, som beskrevet41. Lag flere små snitt (opptil 1 cm hver) med saks i den normale delen av leveren før perfusjon for å generere utløp for blod og formalin. Ved perfusjon vil leverfargen endres fra rød til brun.
    MERK: Hvis mikrometastaser i makroskopisk normale leverområder er gjenstand for studier, anbefaler vi forskere å ikke kutte leveren, men å klippe den overlegne vena cava i stedet. Men når vi har brukt denne metoden, virker fiksering av leveren dårligere sammenlignet med å kutte leveren. Spesielt hvis RNA in situ hybridisering (ISH) er planlagt å bli utført på leverseksjoner, anbefaler vi å gjøre snitt i leveren før intra-hjerte injeksjon av formalin, som beskrevet ovenfor. Dette muliggjør tilstrekkelig fiksering av levervevet, noe som resulterer i bevaring av RNA-integritet for ISH.
  4. Plasser lever- og lungevevet i 10% formalin og fikser over natten. Erstatt formalinet med 70% etanol, etterfulgt av parafin-innebygging.
  5. Utfør hematoksylin og eosinfarging for å histologisk evaluere tumorområdet. Utfør immunhiistokjemi for stromale markører av interesse. Utfør Picro-Sirus Red farging for å evaluere kollagen-positive områder.
    MERK: ImageJ-programvaren42 kan brukes til å kvantifisere immunhiistokjemi og Picro-Sirius Res-fargedata. En fargedekonvolusjonsfunksjon og MR-fibroseverktøyet kan brukes til å evaluere henholdsvis 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-positive områder og Picro-Sirius rødpositive områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å indusere AAV-mediert overekspression av et tumor-begrensende stromal gen, Islr 4,25,43,44, i hepatocytter, injiserte vi intravenøst Islr-koding AAV8. 1,0 x 1011 virale genomer (vg) av AAV8-Islr, eller som en kontroll, AAV8-mRuby2, ble injisert i den voksne musehalevenen (figur 1A). To uker etter hale vene injeksjon, leveren ble høstet for å validere overekspression av Islr i hepatocytter. Vi utførte RNAscope in situ hybridisering45 og bekreftet at 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)+ signaler ble observert gjennom hele leveren (figur 1B). Ingen DAB+-signaler ble oppdaget i leveren fra en AAV8-mRuby2-behandlet mus.

Vi praktiserte portal vene injeksjon prosedyren ved å injisere India blekk (1:1000 fortynning i PBS). Etter å ha gjort et snitt i overlivet, ble tarmene forsiktig tatt ut fra bukrommet for å tillate visualisering av portalvenen (figur 2A). Portal vene injeksjon av India blekk leverte blekk gjennom hele leveren, men ikke til lungen (Figur 2B). Hvis blekket injiseres ved en feiltakelse i andre kar som den dårligere vena cava (IVC) eller abdominal aorta, endrer systemisk sirkulasjon av blekket lungefargen til svart. India blekk bidrar også til å identifisere mengden lekkasje fra portalvenen, noe som indikerer bukspyttkjertel eller peritoneal formidling.

To uker etter hale vene injeksjon av AAV-mRuby2, ApcΔ/Δ og Trp53Δ/Δ tykktarmskreft organoider (AP tumoroider) ble dissosiert til enkeltceller og injisert i musen portal vene (Figur 3A). For å bekrefte metastatisk tumorvekst og evaluere histologi, samlet vi leveren 3-4 uker etter portalveneinjeksjonen (dvs. på et tidsbestemt punkt i stedet for på et humant endepunkt), før fremtredende nekrose forvirrer histopatologiske analyser. Makroskopisk resulterte portalveneinjeksjonen av tumoroider i flere hvite tumorknuter i leveren (figur 3B). Vi fant at intra-splenic injeksjon av samme celle antall tumoroider ikke generere en stor metastatisk tumormasse. Dette antyder at portal vene injeksjon tilnærming mer effektivt indusert lever metastaser sammenlignet med intra-splenic injeksjon modell. Hematoksylin og eosinfarging av CRC levermetastaser indusert av portalveneinjeksjonen viste histopatologi av moderat differensiert rørformet adenokarsinom ledsaget av en desmoplastisk stromal reaksjon og nekrose (figur 3C). Denne stromarike histologien rekapitulerte trofast den for humane CRC levermetastaser (figur 3C), noe som gjør denne modellen egnet for translasjonell forskning som undersøker metastatisk tumor stroma. Videre viste immunhiistokjemi for alfa-glatt muskel actin (αSMA), en veletablert markør for CAF-er, at ca 7% av tumorområdene var αSMA-positive, noe som bekrefter tilstedeværelsen av CAFer i denne musemodellen (Figur 3D, E). Picro-Sirius rød farging som flekker kollagen46 demonstrert rikelig ECM i tumor mesenchyme med ca 13% av tumor områder positiv for kollagen (Figur 3D, E). Immunohistokjemi for EPCAM, en epitelial avstamningsmarkør, avslørte at den metastatiske CRC viste tumorbuldering (en enkelt tumorcelle eller en celleklynge på opptil fire tumorceller) som er karakteristisk for dårlig prognose kolorektal kreft47 (figur 3F). Ki67 merking indeks i metastatisk CRC var ca 80%, noe som indikerer at de fleste tumorceller er mitotically aktive (Figur 3G, H).

Vi utførte museoverlevelse og tumorvekstkinetikkanalyser i denne prekliniske modellen. Musene i vår første pilotkohort viste en median overlevelse på 57 dager etter tumoroid injeksjon i portalvenen (N = 4 mus; Figur 4A). Dette ble senere replikert i større kontroll AAV8-mRuby2-injiserte grupper25. Ved humant endepunkt (som vist i NOTE, trinn 5.2), viste 3 av 4 mus i pilotgruppen ascites, som også observeres hos pasienter med avansert levermetastase48. For å vurdere tumorveksten ble in vivo imaging system (IVIS) brukt til å måle tumoroid-avledet luminescens (figur 4B, C). Bioluminescenssignalene ble observert i overlivet, noe som tyder på leverspesifikk tumorvekst (figur 4B). Hvis IVIS-signaler observeres i underlivet, indikerer dette peritoneal formidling eller sekundære metastaser til bukorganer. Den ukentlige in vivo-avbildningen tillot en langsgående vurdering av tumorvekst i hver mus (figur 4C), noe som gjør det lettere å overvåke en terapeutisk effekt i vår påfølgende større studie. Tumortakraten var 100% (4/4 mus) vurdert av IVIS-signaler. I dette eksperimentet ble det ikke observert noen makroskopisk tilsynelatende lungemetastase på tidspunktet for vevsinnsamling (0/4 mus).

Til slutt undersøkte vi om AAV-mediert hepatocyttstyrt levering av et kreftbegrensende CAF-gen, Islr 4,25, kunne hemme CRC levermetastasevekst i denne prekliniske musemodellen. Spesielt viste AAV8-Islr-behandlede mus forbedret museoverlevelse og reduserte IVIS-signaler fra svulster (figur 5A-C)25. Immunohistokjemi for fosforylaterte Smad1/5/8 viste at hepatocyttoverekspression av ISLR, en BMP-signal-potensiering, forsterket BMP-signalisering i metastatiske svulster (figur 5D). Behandling med AAV8-Islr reduserte antall Ki67+ prolifererende celler i CRC levermetastase (figur 5E). For fullstendig beskrivelse av resultatene, se Kobayashi et al., Gastroenterologi, 202125. Våre kollektive data indikerer at AAV8-mediert levering av et tumorhemmende gen til hepatocytter, en viktig bestanddel av leveren metastatisk tumor stroma29, kan være en effektiv forebyggende / terapeutisk tilnærming for CRC levermetastaser (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Hale vene-administrert AAV8-Islr genererer Islr overekspression i leveren. (A) Eksperimentell ordning som viser hale vene injeksjon av AAV8, etterfulgt av portal vene injeksjon av kolorektal kreft (CRC) organoider. ISH, in situ hybridisering; IHC, immunhiistokjemi; qRT-PCR, kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon. (B) Representative bilder. RNA in situ hybridisering for Islr ble utført ved hjelp av lever fra AAV8-Islr eller AAV8-mRuby2-behandlede mus. Leveren ble samlet 2 uker etter hale vene injeksjon. Skalastenger, 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Portal vene injeksjon av India blekk resulterer i levering til leveren, men ikke lungen. (A) Representative bilder som viser anatomien i overlivet etter laparotomi. Merk at for visualisering av portalvenen blir tarmene tatt utenfor bukhulen. Bildet til høyre viser en anatomisk merknad av hvert organ og kar. Den gule pilen angir injeksjonsstedet. IVC, Dårligere vena cava. (B) Representative bilder av lever og lunge etter portal vene injeksjon av India blekk. De gule pilspissene indikerer fartøy farget med India-blekket. Skalastenger, 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Portal vene injeksjon av kolorektal kreft organoider genererer stroma-rike lever metastaser. (A) Eksperimentell ordning som viser portal vene injeksjon av ApcΔ / Δ og Trp53Δ / Δ tykktarmskreft organoider (AP tumoroider). Skala bar, 200 μm. T, tumoroider. (B) Representative makroskopiske bilder av leveren som ble samlet inn 3-4 uker etter portal vene injeksjon (venstre) eller intra-splenic injeksjon (høyre). 5,0 x 105 enkeltceller fra AP tumoroider ble injisert i portalvenen eller milten. Intra-miltinjeksjon ble utført som beskrevet13. Hvite knuter indikerer svulster. T, Svulst; N, Normal lever. (C) Representative hematoksylin og eosin (H&E) farging bilder av CRC lever metastaser fra portalen vene injeksjon mus modell (venstre og midten) og menneskelig (høyre). T, Svulst; N, Normal lever; S, Stroma; Nec, Nekrose. Den gule stiplede linjen indikerer en kant mellom svulsten og normal lever (venstre). (D og E) Immunohistokjemi (IHC) for alfa-glatt muskel actin (αSMA; venstre) og Picro-Sirius rød farging (høyre). (D) Representative bilder. (E) Kvantifisering av αSMA-positive områder (venstre) og Picro-Sirius rødpositive områder (høyre). N = 4 mus, 5 HPFer (høyeffektsfelt, 400x)/mus. (F) Representativt bilde som viser immunhiistokjemi for EPCAM, en epitelcellemarkør. De grønne stiplede linjene betegner tumorbuldding. (G og H) Immunhiistokjemi for Ki67, en celleproliferasjonsmarkør. (G) Representativt bilde. (H) Prosentandel av Ki67+ celler i totale epitelceller. Epitelceller ble visualisert ved hematoksylintellere. N = 4 mus, 5 HPF-er/mus. I (B)-(H) ble alle levervev hos mus samlet inn 3-4 uker etter injeksjon av AP-tumoroider. Mener ± S.E.M. Hver prikk representerer en gjennomsnittsverdi på 5 HPFer fra en mus (E og H). Skalastenger representerer 1 cm (B), 1 mm (C, venstre), 100 μm (C, midten og høyre) og 50 μm (D, F og G). Merk at studien med humant vev ble godkjent av Etikkkomiteen ved Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Overlevelsesanalyse og tumorvekstkinetisk analyse ved in vivo-avbildning . (A) Kaplan-Meier overlevelse kurver. N = 4 mus. (B,C) In vivo avbildningssystem (IVIS) ble brukt til å evaluere tumorvekstkinetikk. (B) Et representativt bilde. Området i den røde boksen ble brukt til kvantifisering. (C) Vekstkinetikk. Luciferase-signaler fra hver mus vises. N = 4 mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: AAV8-mediert genlevering av Islr til hepatocytter øker BMP-signalering, reduserer tumorproliferasjon og forbedrer musens overlevelse i en portalveneinjeksjonsmodell av CRC levermetastase. (A) Kaplan-Meier overlevelseskurve. To uker etter hale vene injeksjon av AAV-Islr eller AAV-mRuby2, portal vene injeksjon av CRC tumoroider ble utført. (B og C) Tumoroid-avledede luciferasesignaler ble evaluert ved hjelp av IVIS. (B) Representativt bilde. (C) Kvantifisering av IVIS-signaler. N = 5 (AAV-mRuby2) og 8 (AAV-Islr) mus. Bety ± S.E.M. (D) Representative bilder. Immunhiistokjemi (IHC) for fosforylatert Smad1/5/8 (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 er et nedstrøms molekyl av benmorfogenetisk protein (BMP) som signaliserer som er fosforylert ved BMP-signalaktivering49. N = 4 mus hver. (E) Representative bilder. Immunhiistokjemi for Ki67. N = 4 mus hver. (F) Grafisk sammendrag. AAV-mediert hepatocyttstyrt genlevering av et kreftbegrensende stromalt gen kan tjene som en terapeutisk strategi for å hemme CRC-metastogenese. AAV8-mediert overekspression av Islr i hepatocytter ombygde den metastatiske nisjen ved å forsterke BMP-signalering og begrenset CRC-metastaseprogresjon. For detaljert informasjon, se Kobayashi et al., Gastroenterology, 202125. Log-rank test (A) og toveis gjentatte mål ANOVA (analyse av varians) med post-hoc Sidaks multi-sammenligningstest i uke 3 (C). Skalastenger, 50 μm. Figur 5A-C har blitt trykt på nytt fra Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., Balansen mellom Stromal BMP Signaling Formidlet av GREM1 og ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Side 1224-1239.e30, Copyright (2021), med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien har vi vist at portal vene injeksjon av mus CRC organoider reprodusere genererer fibroblastrike lever metastaser som etterligner histologiske egenskaper av menneskelige CRC lever metastaser. Videre, når den kombineres med stroma-regisserte terapeutiske behandlinger som AAV8-mediert genterapi, fungerer denne prekliniske modellen som et nyttig verktøy for å vurdere terapeutiske effekter på musens overlevelse og tumorvekst.

Det er i det minste to kritiske trinn i protokollen. For det første er det viktig å forberede en encellet suspensjon av tumoroider ved å fullstendig prøve å inspisere organoidene og bruke et maskefilter for å fjerne celleklumper. Ufullstendig dissosiasjon av tumoroider resulterer i store celleaggregasjoner, hvorav injeksjon kan okkludere portalvenen. Dette forårsaker infarkt av leveren ogdyredøden 22. For det andre, under portal vene injeksjon, er det viktig å minimere blødning fra portalvenen. Nålen skal settes riktig inn i portalvenen. For å unngå punktering av den andre siden av portalvenen, bør vinkelen på den innsatte nålen holdes nesten parallelt med portalvenen. For å forhindre riving av portalvenen under injeksjon, bør nålen ikke flyttes når den er satt helt inn i portalvenen. Umiddelbart etter å ha fjernet nålen fra portalvenen, er det viktig å legge trykk på injeksjonsstedet med en bomullspinne i minst 5 min.

Cellenummeret for injeksjon må endres i henhold til mottakermusen (f.eks. immunotokmpetent vs. immunodeficient mus) og tumorogenitet av organoidlinjen. I våre eksperimenter var injeksjon av 5,0 x 105 enkeltceller i 100 μL suspensjon tilstrekkelig til å generere levermetastaser hos immunompetente mus. Å øke cellenummeret kan øke risikoen for embolisme i portalvenen og død av dyr14, og bør derfor vurderes nøye. Gitt at tidligere papirer brukte 5 x 104 til 5 x 105 celler i 100 μL for tumoroid injeksjon i portalen eller mesenterisk vene 25,26,27,28, anser vi at dette cellenummerområdet ville være et godt utgangspunkt for optimalisering.

En begrensning ved portal vene injeksjon tilnærming er at den ikke fullt ut rekapitulere hele kaskaden av CRC metastagenese. Levermetastase av kreft krever fem hovedtrinn: (1) kreftcelleinvasjon på primærstedet, (2) intravasasjon i fartøyet, (3) celleoverlevelse i portalsirkulasjonen, (4) ekstravasasjon fra portalvenen til leverparenchyma, og (5) kolonisering i den metastatiskenisjen 50. Portal vene injeksjonsmodellen tillater bare undersøkelse av trinn (3)-(5). For å få innsikt i de andre metastatiske prosessene, er det nødvendig å bruke andre modeller som in vitro-modeller og / eller en Notch1-mutant primær CRC-musemodell som ofte metastaser til leveren51.

Betydningen av portal vene injeksjon metoden med hensyn til eksisterende metoder inkluderer leverspesifikk vekst og høyere tumor byrde. Peritoneal formidling i andre injeksjonsmodeller og primær tumorvekst i primære CRC-modeller kan forvirre analyse av levermetastaseprogresjon. I kontrast genererer vår portal vene tilnærming raskt leverspesifikke svulster, noe som forenkler overlevelses- og tumorvekstanalyser.

En stor fordel med organoid transplantasjon over cellelinjeinjeksjon er at portal veneinjeksjon av tumoroider genererte det fibroblastrike tumormikromiljøet som fenokronerer et desmoplastisk trekk ved human metastatisk CRC. Organoide kulturtilstander rekapitulerer egenskapene til tumormikromiljøet og støtter tarmstammecellepopulasjoner, inkludert innebygging av celler i en rik og kompleks 3D ECM med en definert kombinasjon av vekstfaktorer24,52. Dette resulterer i tumorcelleforplantning på en måte som bevarer det genetiske landskapet i kildesvulsten52,53. I kontrast er tradisjonell 2D-kultur av tumorcellelinjer forbundet med klonisk seleksjon og avvikende genomiske / transkripsjonsendringer som ikke trofast reflekterer egenskapene til de opprinnelige kreftformene54. Vi spekulerer i at de relativt harde kulturforholdene for 2D-kultur av kreftcellelinjer tvinger celler til å tilpasse seg mangel på ECM / vekstfaktorsignaler som da kan resultere i stromafattige svulster in vivo, da cellene ikke lenger krever stroma-avledede signaler for overlevelse.

Ved å kombinere den organoide portal vene injeksjonsmodellen med AAV8-mediert genterapi, fant vi at levering av en kreft-hemmende nyttelast til hepatocytter før kreftcellekolonisering i leveren kunne endre (pre-)metastatisk nisje for å hemme CRC-metastasevekst25. Oppmuntrende har kliniske studier vist at AAV-mediert in vivo genoverføring til leveren induserer langsiktig uttrykk for en transgene og kan være en effektiv og sikker modalitet for å behandle ikke-neoplastiske genetiske sykdommer 30,31,55. I fremtiden kan det å utnytte hepatocytter for å forhindre levermetastaser gjennom AAV-tilnærmingen ha potensiell klinisk verdi hos kreftpasienter med høy risiko for metastaser.

Oppsummert viser vår artikkel at CRC organoid transplantasjon via portalvenen genererer fibroblastrike levermetastaser, som kan utnyttes til utvikling av terapeutiske strategier rettet mot stroma. Ved å koble portalveneinjeksjonen med stroma-rettet terapi som AAV-mediert genlevering, kan man identifisere nye stromale mål for å begrense CRC-metastaseprogresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (APP1156391 til D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 til D.L.W., APP1140236 til S.L.W., APP1099283 til D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project på vegne av sine givere og den statlige regjeringen i Sør-Australia gjennom Department of Health (MCF0418 til S.L.W., D.L.W.); en Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03467 til M.T.) bestilt av Departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 og 19gm1210008s0101 til A.E.); Prosjektet for kreftforskning og terapeutisk evolusjon (P-CREATE) fra AMED (19cm0106332h0002 til A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (til H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (til H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (til H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (til K.G.).

Vi takker Dr. Leszek Lisowski ved Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) for å produsere rekombinante AAV-vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Tags

Kreftforskning utgave 175
Portal vene injeksjon av kolorektal kreft organoider for å studere levermetastase Stroma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng,… More

Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter