Summary
حقن الوريد البابي من سرطان القولون والمستقيم (CRC) العضوية يولد ورم خبيث الكبد الغنية بالسدى. يمثل نموذج الفأر هذا من الانبثاث الكبدي CRC أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الورم والسدى وتطوير علاجات جديدة موجهة للسدى مثل العلاجات الجينية المرتبطة بالفيروسات الغدية.
Abstract
يعد الانبثاث الكبدي لسرطان القولون والمستقيم (CRC) سببا رئيسيا للوفاة المرتبطة بالسرطان. تلعب الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) ، وهي مكون رئيسي في البيئة الدقيقة للورم ، دورا حاسما في تطور CRC النقيلي والتنبؤ بسوء تشخيص المريض. ومع ذلك ، هناك نقص في نماذج الفئران المرضية لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية النقيلية و CAFs. هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في كيفية تنظيم تطور ورم خبيث في الكبد بواسطة مكانة النقيلي وربما يمكن تقييده عن طريق العلاج الموجه بالسدى. ولد حقن الوريد البابي للعضويات CRC تفاعلا ديسموبلاستيكيا ، والذي لخص بأمانة الأنسجة الغنية بالخلايا الليفية لنقائل الكبد البشرية CRC. كان هذا النموذج خاصا بالأنسجة مع وجود عبء ورم أعلى في الكبد عند مقارنته بنموذج الحقن داخل الطحال ، مما يبسط تحليلات بقاء الفئران. عن طريق حقن الأعضاء العضوية للورم المعبر عن اللوسيفيراز ، يمكن مراقبة حركية نمو الورم عن طريق التصوير في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، يوفر هذا النموذج قبل السريري منصة مفيدة لتقييم فعالية العلاجات التي تستهدف اللحمة المتوسطة للورم. نحن نصف طرقا لفحص ما إذا كان التسليم بوساطة الفيروس المرتبط بالفيروس الغدي لجين لحمي مثبط للورم إلى خلايا الكبد يمكن أن يعيد تشكيل البيئة الدقيقة للورم ويحسن بقاء الفئران. يتيح هذا النهج تطوير وتقييم استراتيجيات علاجية جديدة لمنع الانبثاث الكبدي ل CRC.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو سبب رئيسي لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم1. يصاب أكثر من نصف مرضى CRC بورم كبدي يحدث من خلال نشر الوريد البابي1. حاليا ، لا توجد علاجات فعالة يمكنها علاج ورم خبيث متقدم في الكبد ، ومعظم المرضى يستسلمون للمرض النقيلي.
يلعب المكان النقيلي أو البيئة الدقيقة للورم دورا رئيسيا في تطعيم ونمو خلايا CRC المنتشرة2. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) ، وهي عنصر بارز في البيئة الدقيقة للورم ، تعزز أو تقيد تطور السرطان من خلال إفراز عوامل النمو ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتعديل المناظر الطبيعية المناعية وتكوين الأوعيةالدموية 3،4،5. تمنح CAFs أيضا مقاومة للعلاجات الكيميائية والعلاجات المناعية3. علاوة على ذلك ، تنظم CAFs بدء وتطور ورم خبيث في الكبد CRC وتتنبأ بالتشخيص في المرضى الذين يعانون من CRC3،6،7،8. وبالتالي ، يمكن استغلال العوامل المتعلقة ب CAF لتطوير استراتيجيات علاجية لمنع ورم خبيث في الكبد CRC. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نماذج مرضية للفئران لدراسة سدى الورم النقيلي كان عقبة رئيسية أمام تطوير علاجات تستهدف السدى.
حاليا ، تشمل النماذج الحيوانية لدراسة ورم خبيث في الكبد CRC نماذج CRC الأولية التي تطور تلقائيا ورم خبيث كبدي ونماذج زرع الخلايا السرطانية في الكبد. نادرا ما تظهر نماذج الفئران CRC الأولية ، مثل نماذج الفئران المعدلة وراثيا وحقن القولون للخلايا السرطانية ، ورم خبيث في الكبد9،10،11،12. علاوة على ذلك ، حتى لو لوحظ ورم خبيث في الكبد ، فإن هذه النماذج تظهر كمونا طويلا من تحريض الورم الأولي إلى ورم خبيث ، وربما تموت من عبء الورم الأولي12. لتوليد نقائل الكبد CRC بكفاءة ، يتم زرع خلايا CRC المستزرعة في الكبد باستخدام ثلاث طرق حقن: الحقن داخل الطحال ، والحقن المباشر داخل المتني في الكبد ، وحقن الوريد البابي. تنتشر الخلايا السرطانية المحقونة داخل الطحال في الوريد الطحالي ، الوريد البابي ، وفي النهاية إلى الكبد13,14. ومع ذلك ، فإن الحقن داخل الطحال ينتج نسبة أقل من أخذ الورم مقارنة بنماذج الزرع الأخرى15,16. مع الحقن داخل الطحال ، يتم إجراء الاستئصال الجراحي للطحال لتجنب نمو السرطان في الطحال ، والذي يمكن أن يضر بنضج الخلايا المناعية17. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الحقن داخل الطحال أيضا إلى نمو الورم غير المقصود في الطحال وتجويف البطن18 ، مما يعقد تحليلات ورم خبيث الكبد. الحقن المباشر داخل المتني في الكبد يحفز بكفاءة ورم خبيث كبدي16،19،20. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يلخص تماما خطوة بيولوجية من ورم خبيث في الكبد يحدث بشكل طبيعي من خلال نشر الوريد البابي. باستخدام الحقن المباشر في الكبد ، ودخول الخلايا السرطانية إلى غير البوابة ، ولكن الدورة الدموية الجهازية يمكن أن يؤدي أيضا إلى العديد من النقائل الرئوية الكبيرة16. على الرغم من أن غالبية المرضى الذين يعانون من ورم خبيث في الكبد CRC يظهرون عقيدات ورم متعددة في الكبد21 ، إلا أن الحقن المباشر في فص كبد معين يولد كتلة ورم واحدة 19,20. يسمح حقن الوريد البابي أو حقن الوريد المساريقي ، على الرغم من تحديه تقنيا ، بتوصيل الخلايا السرطانية بكفاءة إلى الكبد بطريقة تلخص أنماط النمو التي شوهدت في المرضى17. يمكن لهذه الاستراتيجية أن تقلل من إمكانية النقائل الثانوية وتمكن من النمو السريع للخلايا السرطانية في الكبد ، مما يبسط تحليلات بقاء الفئران.
تاريخيا ، تم استخدام خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم مثل الفأر MC-38 و HT-29 البشري و SW-620 لتوليد نماذج الفئران من ورم خبيث كبدي22,23. ومع ذلك ، فإن خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم هذه لا تحفز رد فعل اللحمية الديسموبلاستيكية. المحتوى اللحمي المنخفض في الأورام يجعل من الصعب التحقيق في الأدوار البيولوجية للخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. قدمت التطورات الحديثة في المواد العضوية CRC وزرعها منصات مفيدة لتقييم الأدوار الحيوية للسدى في تطور السرطان24. يولد زرع الكبد من المواد العضوية CRC بيئة دقيقة غنية بالخلايا الليفية للورم وقد قدم رؤى جديدة في الأبحاث اللحمية 6,25. حاليا ، أصبح حقن الوريد البابي أو المساريقي للعضويات نهجا قياسيا ذهبيا لتوليد ورم خبيث في الكبد CRC 6,25,26,27,28. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم تصف أي أوراق سابقة طرقا مفصلة لحقن الوريد البابي لأورام القولون والمستقيم. هنا ، نقدم منهجية لاستخدام حقن الوريد البابي من المواد العضوية CRC لتطوير علاج جديد بوساطة الفيروس الغدي (AAV) بوساطة السدى.
خلايا الكبد هي مكون مهم للبيئة الدقيقة للورم النقيلي في الكبد وتلعب دورا حاسما في تطور السرطان النقيلي29. مستوحاة من نجاح أساليب العلاج الجيني AAV للحث على التعبير عن البروتين في خلايا الكبد في المرضى غير الورمية30,31 ، قمنا بالتحقيق في نهج مماثل ولكن يهدف إلى تعديل البيئة الدقيقة لورم الكبد في CRC25. على هذا النحو ، نصف أيضا هنا حقن الوريد الذيل من AAV8 للحث على التعبير عن البروتينات المضادة للأورام لتعديل البيئة الدقيقة لورم الكبد. يؤدي النمط المصلي AAV8 ، المعين من خلال اختيار بروتين القفيصة الفيروسية أثناء إنتاج الفيروس ، إلى كفاءة نقل عالية خاصة لخلايا الكبد (أي التعبير الجيني المستهدف في البيئة الدقيقة لورم الكبد)32. لقد أظهرنا سابقا أن Islr (عائلة الغلوبولين المناعي التي تحتوي على تكرار غني بالليوسين) هو جين خاص ب CAF يحفز إشارات البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) ، ويقلل من نمو الورم CRC ، ويعزز تمايز الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 + 25. لقد اختبرنا ما إذا كان الإفراط في التعبير بوساطة AAV8 عن الجين اللحمي المقيد للسرطان ، Islr ، في خلايا الكبد يمكن أن يخفف من تطور ورم خبيث كبدي عن طريق إجراء حقن الوريد البابي للأورام CRC في الفئران المعالجة ب AAV8-Islr.
في هذه الورقة ، نصف أولا إجراء حقن الوريد الذيل ل AAV المدارية الكبدية. بعد ذلك ، نصف طريقة لإعداد الخلايا السرطانية وحقن الوريد البابي في الفئران المعالجة ب AAV. أخيرا ، نقدم طرقا لمراقبة تطور الورم النقيلي لتقييم فعالية العلاجات الموجهة بالسدى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه المقالة والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة لمعهد جنوب أستراليا للصحة والبحوث الطبية (رقم الموافقة ، SAM322).
1. حقن الوريد الذيل من الفيروس المرتبط بالغدية
ملاحظة: ينبغي التعامل مع الفيروس المرتبط بالأدينو (AAV) كخطر بيولوجي بموجب المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية من المستوى 1. يرجى الرجوع إلى البروتوكول المنشور لإعداد AAV وتنقيته ومعايرته بالتحليل الحجمي33. تم استخدام AAV ، AAV834 ، الذي يشفر جين الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المروج Islr ، في هذه الدراسة25. للحث على الإفراط في التعبير بوساطة AAV ، قد تتطلب جرعات AAV التحسين اعتمادا على نشاط المروج والجين ووزن الماوس.
- قم بتخفيف ناقل AAV إلى 150 ميكرولتر أليكوت يحتوي على 1.0 × 1011 جينوم فيروسي ، باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) واحتفظ به على الجليد. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية للتعامل مع AAV.
ملاحظة: دورة التجميد والذوبان المتكررة تقلل من عيار الفيروس ويجب تجنبها. يجب تخزين المحلول الفيروسي للمخزون في ثلاجة -80 درجة مئوية. - قم بتشغيل صندوق حرارة (غرفة تسخين الحيوانات) للتسخين المسبق إلى 35 درجة مئوية.
- امسك الماوس وقم بتطبيق كريم تخدير موضعي على كامل طول الذيل قبل 15 دقيقة على الأقل من حقن الوريد الذيلي.
ملاحظة: هذه خطوة اختيارية وقد لا تكون ضرورية إذا لم تكن مطلوبة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد. اتبع البروتوكول المعتمد من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية. في هذه التجربة25 ، تم استخدام فأر Rosa26-Cas9 لحقن AAV وحقن الوريد البابي اللاحق للعضويات CRC. بالنظر إلى أن الأورام المستخدمة في هذه الدراسة كانت مشتقة من فأر Rosa26-Cas9 (الخلفية الوراثية C57BL / 6 × 129) ، فقد تم استخدام سلالة الفئران هذه أيضا كمتلقين مختصين بالمناعة ومتجانسين لعملية زرع الورم. تم استخدام ذكور وإناث الفئران Rosa26-Cas9 (من 6 إلى 24 أسبوعا). - ضع الماوس في صندوق الحرارة. اترك الماوس لمدة تصل إلى 15 دقيقة لتدفئة وتوسيع عروق الذيل.
- قم بتأمين الماوس بلطف في مانع القوارض. ضع الذيل تحت مصباح حراري لضمان التمدد الكامل لعروق الذيل.
- اسحب 150 ميكرولتر من AAV المخفف (المحضر في الخطوة 1.1) في حقنة معقمة منخفضة المساحة الميتة بإبرة 27-30 جم.
- حرك المصباح الحراري وحدد الوريد الذيل الجانبي الموجود على جانبي الذيل. ضع توترا طفيفا على الذيل بالأصابع بحيث يصبح الذيل مستقيما.
- أدخل ببطء 2-3 مم من الإبرة ، مشطوفة ، في الوريد. يجب أن تكون الإبرة موازية تقريبا للذيل (حتى 15 درجة من الذيل).
ملاحظة: يمكن ملاحظة تدفق الدم إلى المحقنة إذا تم تحديد موقع الإبرة بنجاح في الوريد. - حقن ببطء. إذا شعرت بمقاومة أو لوحظ تورم في الجلد ، فقم بإزالة الإبرة وإعادة إدخالها فوق الموقع الأول أو إلى الوريد الجانبي الآخر.
- انتظر حوالي 5 ثوان بعد الانتهاء من الحقن ، ثم قم بإزالة الإبرة ببطء. ضع ضغطا لطيفا على الفور على موقع الحقن بشاش نظيف أو منشفة ورقية حتى يتوقف النزيف.
- حرر الماوس بلطف في قفصه. راقب الحيوان للتأكد من توقف النزيف.
ملاحظة: يمكن تقييم فرط التعبير الجيني في الكبد بعد 1 إلى 2 أسابيع من حقن الوريد الذيل AAV. ويمكن تأكيد ذلك، على سبيل المثال، عن طريق تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع (ISH)، أو الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)، أو النشاف الغربي، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR; الشكل 1 ألف، باء). في دراسة نشرت سابقا25 ، تم استخدام AAV8-Islr للمبالغة في التعبير عن جين Islr للفأر في خلايا الكبد وتم اكتشاف التعبير الزائد بواسطة RNA ISH (الشكل 1A ، B).
2. إعداد الخلايا لسرطان القولون والمستقيم العضوي
ملاحظة: تحتوي المواد العضوية CRC المستخدمة في هذه التجربة على خلايا ظهارية فقط. تم وصف ثقافة وتوليد المواد العضوية CRC سابقا25,35. باختصار ، تم عزل الخلايا الظهارية القولونية الطبيعية من قولون فأر Rosa26-Cas9 باستخدام مخزن مؤقت لعزل السرداب (5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetate) في PBS البارد الجليدي) ، ثم تم تضمينه في وسط مصفوفة الغشاء السفلي ، وزرعها في وسط نمو عضوي كما هو موضح في المرجع35. بعد ذلك ، تم إدخال طفرات Apc و Trp53 إلى الخلايا الظهارية القولونية عن طريق المبالغة في التعبير عن الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الذي يستهدف Apc و Trp53 باستخدام بروتوكول التعبير عن الفيروس lentivirus. تم اختيار استنساخ عضوي واحدبعناية 25. تمحقن جهاز كمبيوتر Δ / Δ و Trp53 Δ / Δ عضويات سرطان القولون (AP tumoroids) ، كخلايا مفردة 5.0 × 105 في 100 ميكرولتر من PBS مع 10 μM Y-27632 في الوريد البابي لكل فأر ، مع زراعة عضوية وإعداد خلية واحدة موصوفة أدناه.
- استزرع المواد العضوية CRC في مصفوفة الغشاء السفلي القباب المتوسطة في طبق من 24 بئرا أو طبق 10 سم قبل 3-5 أيام من حقن الوريد البابي للحصول على عضويات قطرها 50-400 ميكرومتر.
- قم بإعداد كمية كافية من محلول انفصال الخلايا عن طريق إضافة تركيز Y-27632 إلى 10 ميكرومتر ، وهو ما يكفي لهضم عدد المواد العضوية التي يتم استزراعها للحقن. يسخن مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: محلول انفصال الخلايا المستخدم في هذا البروتوكول هو مزيج إنزيم مؤتلف لتفكك الخلايا ويستخدم كبديل للتريبسين في الثقافة العضوية (انظر جدول المواد). يقلل من الضرر الخلوي الناجم عن تفكك الخلايا مقارنة بالتريبسين36. Y-27632 هو مثبط Rho kinase ويمنع موت الخلايا الناجم عن التفكك ، وبالتالي زيادة بقاء خلية واحدة37.- للحقن في ما يصل إلى خمسة فئران ، قم بإعداد أنبوبين يحتويان على 40 مل من محلول انفصال الخلية لهضم 10-24 × 50 ميكرولتر من قباب مصفوفة الغشاء السفلي مع كل قبة تحتوي على ما يقرب من 300 مادة عضوية (قطرها 50-400 ميكرومتر) ، أي يتم حقن كل فأر ب 2-4.8 قبة من المواد العضوية (أي ما يعادل حوالي 600-1440 عضوية). يعتمد عدد المواد العضوية اللازمة للحصول على عدد كاف من الخلايا على الخط العضوي ، وبالتالي يجب تحسينه.
ملاحظة: يتيح الأنبوب الثاني سعة 40 مل تكرار الهضم باستخدام محلول انفصال الخلايا الطازج للحصول على خلايا مفردة منفصلة.
- للحقن في ما يصل إلى خمسة فئران ، قم بإعداد أنبوبين يحتويان على 40 مل من محلول انفصال الخلية لهضم 10-24 × 50 ميكرولتر من قباب مصفوفة الغشاء السفلي مع كل قبة تحتوي على ما يقرب من 300 مادة عضوية (قطرها 50-400 ميكرومتر) ، أي يتم حقن كل فأر ب 2-4.8 قبة من المواد العضوية (أي ما يعادل حوالي 600-1440 عضوية). يعتمد عدد المواد العضوية اللازمة للحصول على عدد كاف من الخلايا على الخط العضوي ، وبالتالي يجب تحسينه.
- استنشق بعناية الوسط العضوي من كل بئر.
- أضف 1 مل من PBS المثلج إلى كل بئر في طبق من 24 بئرا. إذا تم استخدام طبق 10 سم ، أضف 10 مل من PBS المثلج البارد إلى الطبق.
- قم بخدش وسط مصفوفة الغشاء السفلي باستخدام طرف ماصة P1000. انقل الملاط PBS / المتوسط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- شطف كل بئر بنفس الكمية من PBS لجمع شظايا مصفوفة الغشاء السفلي وإضافة إلى أنبوب (أنابيب) 15 مل.
- احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. تساعد هذه الحضانة على إذابة وسط مصفوفة الغشاء السفلي.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- شفط supernatant لضمان عدم إزعاج الوسط والخلايا الكروية.
- أضف 5 مل من محلول انفصال الخلايا المسخن مسبقا المحضر في الخطوة 2.2 إلى الكريات ، وأعد تعليق الكريات 10 مرات ، وانقلها مرة أخرى إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على محلول مفرزة خلية طازج ومسخن مسبقا.
- ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 5 دقائق.
- جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 400 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوات 2.9-2.11.
ملاحظة: يسمح الهضم الأنزيمي المتكرر بتفكك الخلايا بكفاءة إلى خلايا مفردة. - تحقق مما إذا كانت المواد العضوية تنفصل إلى خلايا مفردة عن طريق سحب 100 ميكرولتر إلى صفيحة 96 بئرا والمراقبة تحت المجهر. إذا أظهرت العديد من المواد العضوية كتلا خلوية تتكون من أكثر من أربع خلايا ، فقد يكون من الضروري حضانة أطول باستخدام محلول انفصال الخلايا والتفكك الفيزيائي عن طريق الترتوريون باستخدام ماصة 10 مل.
- بمجرد أن تكون معظم الخلايا خلايا مفردة ، أضف 4 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى تعليق الخلايا 40 مل لوقف الهضم. شطف مصفاة خلايا 40 ميكرومتر مع 5 مل PBS.
- مرر تعليق الخلية عبر مصفاة الخلية إلى أنبوب تجميع سعة 50 مل لإزالة أي كتل خلايا.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- شفط السوبرناتانت. أضف 10 مل من PBS البارد إلى حبيبة الخلية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الكريات في PBS بارد 500 ميكرولتر مع 10 ميكرومتر Y-27632. عد الخلايا.
- اضبط تركيز الخلية على 5.0 × 105 خلايا مفردة / 100 ميكرولتر ، باستخدام PBS مع 10 ميكرومتر Y-27632. ضع الأنبوب على الثلج حتى يتم إجراء حقن الوريد البابي.
ملاحظة: يوصى بحقن الخلايا المنفصلة في غضون 4 ساعات من التفكك.
3. حقن الوريد البابي من المواد العضوية CRC
ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية والشاش الجراحي أو تعقيمها قبل الجراحة. تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول سابق17. في هذه التجربة25 ، تم إجراء حقن الوريد البابي باستخدام الفئران Rosa26-Cas9 المعالجة باستخدام AAV-mRuby2 أو AAV-Islr في الخطوة 1.
- قم بإعداد منطقة جراحية معقمة باستخدام ستائر معقمة على وسادة تدفئة.
- تحضير الأدوات الجراحية (المقص والملقط) ، الإسفنج الجراحي والمرقئ ، خياطة 4-0 polyglactin ، براعم القطن ، دباسات الجلد ، قضيب دباسة ، محلول ملحي ، بوبرينورفين ، وإبرة 33 G متصلة بحقنة هاميلتون. قطع الإسفنجة المرقئة إلى قطع 1.0 سم × 1.0 سم.
- اضبط موضع مصدر الضوء لإضاءة المنطقة الجراحية.
- حقن 0.1 مغ/كغ من وزن الجسم من البوبرينورفين تحت الجلد إلى فأر لإدارة الألم الجراحي.
- تخدير الفأر مع الايزوفلوران في غرفة التخدير. عادة ما يكون تركيز الأيزوفلوران للحث والصيانة 5٪ و 2.5٪ على التوالي. تحقق من عدم وجود رد فعل على قرصة إصبع القدم قبل البدء في الإجراء التالي.
- حلق من المنتصف إلى أعلى البطن من الماوس باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. يجب إجراء الحلاقة في منطقة بعيدة عن المنطقة الجراحية المعقمة لتجنب تلويث الشعر للموقع.
- تنظيف موقع الشق بالتناوب مع بيتادين و 80٪ من الإيثانول لتعقيم المنطقة الجراحية. كرر ثلاث مرات.
- ضع الماوس على وسادة تسخين في وضع ضعيف مع تخدير أيسوفلوران للصيانة. ضع ستارة جراحية مع ثقب على بطن الماوس.
- ارفع جلد البطن باستخدام ملقط وقم بعمل شق جلدي 2-3 سم عند خط الوسط باستخدام مقص ، وقطع الجلد فقط (وليس الصفاق الأساسي). يجب أن يتراوح الشق من منتصف البطن إلى عملية الخنفساء في القص. يجب ألا يتجاوز الشق الطرف السفلي من عملية الخنازير.
- ارفع الجدار البريتوني بالكامل باستخدام ملقط وقم بعمل شق مماثل 2-3 سم إلى الصفاق باستخدام المقص. تجنب قطع الأمعاء والحجاب الحاجز.
- انقع الشاش الجراحي بمحلول ملحي دافئ وضعه على الجانب الأيسر من الشق (على الجانب الأيسر من جسم الفأر ؛ إلى يمين الجراح).
- اسحب الأعضاء الداخلية بلطف (الأمعاء الدقيقة والغليظة) إلى الخارج باستخدام برعم قطني منقوع بمحلول ملحي. ضع الأمعاء على الشاش المنقوع بمحلول ملحي.
ملاحظة: يجب سحب أمعاء الجانب الأيسر للفأر (أي الأمعاء الموجودة على يمين الجراح) أولا ، ثم يمكن سحب أمعاء الجانب الأيمن للفأر (أي الأمعاء الموجودة على يسار الجراح). - اضبط موضع الأمعاء لتصور الوريد البابي. قم بتغطية الأمعاء بشاش رطب إضافي للحفاظ على رطوبة الأمعاء.
- اسحب الأمعاء بلطف إلى الجانب الأيسر باستخدام الشاش الرطب وقم بتطبيق توتر لطيف على اليسار. وهذا يسهل تصور الوريد البابي (الشكل 2 ألف).
ملاحظة: إذا كان تصور الوريد البابي صعبا، فقد يساعد ضبط موضع المعدة بلطف باستخدام برعم قطني مبلل في التصور. - قم بسحب تعليق الورم بلطف عدة مرات للحصول على تعليق خلية متجانسة. اسحب ببطء 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة هاميلتون متصلة بإبرة 33 G. تجنب فقاعات الهواء.
- أدخل الإبرة ببطء ، مشطوفة ، في الوريد البابي. يجب أن يكون عمق الإدخال على طول الإبرة 3-4 مم ، مع زاوية الإبرة موازية تقريبا لوريد الباب.
ملاحظة: يجب إجراء الحقن في الجزء المرئي جيدا من الوريد البابي (عادة ما يصل إلى 2 سم بعيدا عن الحلمة الكبدية). تجنب حركة الإبرة بعد إدخالها بالكامل في الوريد البابي. - حقن الخلايا السرطانية لمدة 30 ثانية. يجب إجراء الحقن ببطء لمنع انسداد الوريد البابي. إذا نجحت الحقن ، يتغير لون الكبد مؤقتا من الأحمر إلى الأبيض.
- إزالة الإبرة ببطء. ضع ضغطا لطيفا على الفور على موقع الحقن باستخدام برعم قطني جاف وانتظر لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة برعم القطن وقم بتطبيق إسفنجة مرقئ في وقت واحد على موقع الحقن. امسك إسفنجة مرقئ ببرعم قطني أو ملقط واضغط بضغط لطيف لمدة 5 دقائق أخرى.
- قم بإزالة الضغط على الإسفنجة المرقئة وتأكد من عدم وجود نزيف من موقع الحقن.
ملاحظة: لا يلزم إزالة الإسفنجة المرقئة القابلة للامتصاص الحيوي. محاولة إزالة الشاش يمكن أن يسبب إعادة النزيف من موقع الحقن. - في حالة حدوث نزيف ، قم بإجراء الإرقاء بالضغط على الفور باستخدام برعم قطني لمدة 10 دقائق. ثم ، ضع إسفنجة مرقئ إضافية لمدة 5 دقائق أخرى.
ملاحظة: إذا لوحظ فقدان الدم الذي لا يمكن السيطرة عليه ، فيجب قتل الفأر الرحيم وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد. - إزالة الشاش الجراحي على الأمعاء. باستخدام حقنة مملوءة بمحلول ملحي سعة 5 مل ، قم برش محلول ملحي على الأمعاء لمنع التصاق الأعضاء.
ملاحظة: لا تضع محلول ملحي على موقع حقن الوريد البابي. هذا يمكن أن يسبب إعادة النزيف. - ضع الأمعاء بلطف داخل تجويف البطن.
- خياطة الصفاق باستخدام 4-0 خيوط بوليجلاكتين.
- ارفع جانبي الجلد باستخدام الملقط. ضع دبابيس الجلد لإغلاق شق الجلد. احرص على عدم تدبيس الأمعاء.
- قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران ولكن حافظ على تدفق الأكسجين قيد التشغيل. راقب الماوس بعناية. عندما يستيقظ الماوس ، ضع الماوس في قفص فارغ على وسادة تدفئة. عادة ما يستيقظ الماوس في غضون 5 دقائق.
- راقب الماوس بعناية حتى يصبح واعيا ومتنقلا بشكل طبيعي.
- حقن تحت الجلد 0.1 مغ / كغ من البوبرينورفين إلى الفأر 4 ساعات بعد الجراحة.
- حقن 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين إلى الماوس كل 24 ساعة لمدة يومين لاحقين.
- راقب الفئران بعناية يوميا لمدة أسبوع بعد الجراحة. تحقق من الغرز والتئام الجروح.
- بعد أيام من الجراحة، قم بإزالة دبابيس الجلد باستخدام مزيل دباسة.
4. تقييم حركية نمو الورم عن طريق التصوير الحيوي في الجسم الحي
ملاحظة: إذا تم استخدام الأورام المعبرة عن اليراع للحقن ، فيمكن مراقبة تطور الورم النقيلي أسبوعيا عن طريق التصوير في الجسم الحي كما هو موضح في38,39. يمكن أن يثير Luciferase الذي تعبر عنه الخلايا السرطانية استجابات مناعية ضد الخلايا السرطانية ويحد من نمو الورم40. وبالتالي ، هناك ما يبرر توخي الحذر في تحليل الأنماط الظاهرية المناعية وتطور السرطان في نموذج الفأر باستخدام الخلايا السرطانية التي تعبر عن لوسيفيراز.
- تحضير محلول 30 ملغ / مل من D-luciferin باستخدام PBS معقمة. حمايته من الضوء. يجب تخزين D-luciferin في aliquots عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- حلق البطن والصدر باستخدام ماكينة حلاقة إلكترونية. يمكن القيام بذلك حتى 1 يوم قبل التصوير في الجسم الحي .
- حقن 150 مغ/كغ من وزن الجسم من D-luciferin داخل الصفاق في الفئران (أي إذا كان وزن جسم الفأر 30 غراما، حقن 150 ميكرولتر من محلول D-luciferin).
- ضع الفئران في غرفة تخدير وقم بتخديرها. استخدم 5٪ من الأيزوفلوران للحث و 2٪ -3٪ للصيانة.
- دقيقة في وقت لاحق ، ضع الفئران في وضع جانبي (الجانب الأيمن لأعلى). الحصول على صور التلألؤ الحيوي باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) كما هو موضح سابقا38,39.
ملاحظة: الفئران أكثر استقرارا في وضع جانبي مقارنة بالوضع الضعيف. لذلك ، يفضل الحصول على موضع جانبي للحصول على صورة تلألؤ من مستوى بؤري متسق. - ضع الفئران في قفص فارغ وراقب تعافيها.
- حدد المناطق ذات الأهمية في الجزء العلوي من البطن باستخدام برنامج Living Image Software كما هو موضحفي 38. تحديد التدفق الكلي كبديل لعدد الخلايا السرطانية.
5. تحليل البقاء على قيد الحياة وجمع الأنسجة
- راقب الفئران بعناية بحثا عن الأعراض السريرية للنقائل مثل البطن المنتفخ.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 بمجرد وصوله إلى نقاط النهاية الإنسانية.
ملاحظة: استخدم نقطة نهاية الدراسة المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد. لتحديد نقطة نهاية إنسانية ، تم استخدام ورقة سجل سريري ؛ تم حساب الدرجات من خلال نقطة واحدة تعطى لوجود كل من الملاحظات التالية: فقدان الوزن > 15 ٪ ، والموقف المنحني ، والمعطف الكشكش ، والجفاف ، وانخفاض الحركة ، وانتفاخ البطن ، أو كآبة الوجه. بمجرد الوصول إلى درجة 3 ، تم قتل الفئران إنسانيا. - مباشرة بعد القتل الرحيم ، قم بإجراء تثبيت التروية عبر القلب باستخدام 30-50 مل من الفورمالين بنسبة 10٪ في غطاء الدخان ، كما هو موضح41. قم بعمل عدة شقوق صغيرة (يصل كل منها إلى 1 سم) باستخدام مقص في الجزء الطبيعي من الكبد قبل التروية لتوليد منافذ للدم والفورمالين. عند التروية ، سيتغير لون الكبد من الأحمر إلى البني.
ملاحظة: إذا كانت النقائل الدقيقة في مناطق الكبد الطبيعية عيانية موضوعا للدراسة ، فإننا نوصي الباحثين بعدم قطع الكبد ، ولكن لقص الوريد الأجوف المتفوق بدلا من ذلك. ومع ذلك ، عندما استخدمنا هذه الطريقة ، يبدو تثبيت الكبد أكثر فقرا بالمقارنة مع قطع الكبد. خاصة إذا كان من المخطط إجراء تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع (ISH) على أقسام الكبد ، فإننا نوصي بإجراء شقوق في الكبد قبل حقن الفورمالين داخل القلب ، كما هو موضح أعلاه. وهذا يتيح التثبيت الكافي لأنسجة الكبد ، مما يؤدي إلى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي ل ISH. - ضع أنسجة الكبد والرئة في 10٪ من الفورمالين وركز بين عشية وضحاها. استبدل الفورمالين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، يليه تضمين البارافين.
- إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لتقييم منطقة الورم من الناحية النسيجية. أداء الكيمياء النسيجية المناعية للعلامات اللحمية ذات الاهتمام. قم بإجراء تلطيخ Picro-Sirus Red لتقييم المناطق الإيجابية للكولاجين.
ملاحظة: يمكن استخدام برنامج ImageJ42 لقياس كيمياء الأنسجة المناعية وبيانات تلطيخ Picro-Sirius Res. يمكن استخدام وظيفة إزالة الالتفاف اللوني وأداة التليف بالرنين المغناطيسي لتقييم المناطق الإيجابية 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) ومناطق Picro-Sirius الحمراء الإيجابية ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحث على التعبير المفرط بوساطة AAV عن جين لحمية مقيد للورم ، Islr 4,25,43,44 ، في خلايا الكبد ، قمنا بحقن AAV8 المشفر عن طريق الوريد. تم حقن 1.0 × 1011 جينوم فيروسي (vg) من AAV8-Islr ، أو كعنصر تحكم ، AAV8-mRuby2 ، في وريد ذيل الفأر البالغ (الشكل 1A). بعد أسبوعين من حقن الوريد الذيل ، تم حصاد الكبد للتحقق من صحة التعبير المفرط عن Islr في خلايا الكبد. أجرينا التهجين RNAscope في الموقع45 وأكدنا أنه تم ملاحظة إشارات 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) + في جميع أنحاء الكبد (الشكل 1B). لم يتم الكشف عن أي إشارات DAB + في الكبد من فأر معالج ب AAV8-mRuby2.
لقد مارسنا إجراء حقن الوريد البابي عن طريق حقن حبر الهند (تخفيف 1:1000 في PBS). بعد إجراء شق في الجزء العلوي من البطن ، تم إخراج الأمعاء بلطف من مساحة البطن للسماح بتصور الوريد البابي (الشكل 2A). حقن الوريد البابي للحبر الهندي قام بتوصيل الحبر في جميع أنحاء الكبد ، ولكن ليس إلى الرئة (الشكل 2B). إذا تم حقن الحبر عن طريق الخطأ في أوعية أخرى مثل الوريد الأجوف السفلي (IVC) أو الشريان الأورطي البطني، فإن الدورة الدموية الجهازية للحبر تغير لون الرئة إلى اللون الأسود. يساعد حبر الهند أيضا في تحديد كمية التسرب من الوريد البابي ، مما يشير إلى نشر البنكرياس أو الصفاق.
بعد أسبوعين من حقن الوريد الذيل ل AAV-mRuby2 ، تم فصل Apc Δ / Δ و Trp53Δ / Δ عضويات سرطان القولون (AP tumoroids) إلى خلايا مفردة وحقنها في الوريد البابي للفأر (الشكل 3A). لتأكيد نمو الورم النقيلي وتقييم الأنسجة ، جمعنا الكبد بعد 3-4 أسابيع من حقن الوريد البابي (أي في نقطة زمنية بدلا من نقطة نهاية إنسانية) ، قبل أن يربك النخر البارز التحليلات النسيجية المرضية. من الناحية العيانية، أدى حقن الوريد البابي للأورام إلى عقيدات ورم بيضاء متعددة في الكبد (الشكل 3B). وجدنا أن الحقن داخل الطحال لنفس عدد الخلايا من الأورام لم يولد كتلة ورم نقيلية كبيرة. هذا يشير إلى أن نهج حقن الوريد البابي يحفز بشكل أكثر كفاءة نقائل الكبد مقارنة بنموذج الحقن داخل الطحال. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للنقائل الكبدية CRC الناجمة عن حقن الوريد البابي علم الأنسجة المرضي للسرطان الغدي الأنبوبي المتمايز بشكل معتدل مصحوبا بتفاعل لحمية ونخر من البلاستيك الوهمي (الشكل 3C). هذا علم الأنسجة الغني بالسدى يلخص بأمانة نقائل الكبد البشرية CRC (الشكل 3C) ، مما يجعل هذا النموذج مناسبا للبحوث الانتقالية التي تحقق في سدى الورم النقيلي. علاوة على ذلك ، أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية لأكتين ألفا العضلات الملساء (αSMA) ، وهي علامة راسخة ل CAFs ، أن حوالي 7٪ من مناطق الورم كانت إيجابية αSMA ، مما يؤكد وجود CAFs في نموذج الماوس هذا (الشكل 3D ، E). أظهر تلطيخ Picro-Sirius الأحمر الذي يلطخ الكولاجين46 وجود ECM وفير في اللحمة المتوسطة للورم مع ما يقرب من 13٪ من مناطق الورم إيجابية للكولاجين (الشكل 3D ، E). كشفت الكيمياء النسيجية المناعية ل EPCAM ، وهي علامة نسب ظهارية ، أن CRC النقيلي أظهر الورم في مهده (خلية ورم واحدة أو مجموعة خلايا تصل إلى أربع خلايا سرطانية) وهي سمة من سمات سوء تشخيص سرطان القولون والمستقيم47 (الشكل 3F). كان مؤشر وضع العلامات Ki67 في CRC النقيلي حوالي 80٪ ، مما يشير إلى أن معظم الخلايا السرطانية نشطة قفيا (الشكل 3G ، H).
أجرينا تحليلات حركية بقاء الفئران ونمو الورم في هذا النموذج قبل السريري. أظهرت الفئران في مجموعتنا التجريبية الأولى متوسط بقاء على قيد الحياة لمدة 57 يوما بعد حقن الورم في الوريد البابي (N = 4 فئران; الشكل 4 ألف). تم تكرار هذا في وقت لاحق في مجموعات أكبر من AAV8-mRuby2 المحقونة25. عند نقطة النهاية الإنسانية (كما هو موضح في NOTE ، الخطوة 5.2) ، أظهر 3 من أصل 4 فئران في المجموعة التجريبية استسقاء ، والذي لوحظ أيضا في المرضى الذين يعانون من ورم خبيث متقدم في الكبد48. لتقييم نمو الورم ، تم استخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) لقياس التلألؤ المشتق من الورم (الشكل 4B ، C). لوحظت إشارات التلألؤ الحيوي داخل الجزء العلوي من البطن ، مما يشير إلى نمو الورم الخاص بالكبد (الشكل 4B). إذا لوحظت إشارات IVIS في أسفل البطن ، فهذا يشير إلى الانتشار البريتوني أو النقائل الثانوية إلى أعضاء البطن. سمح التصوير الأسبوعي في الجسم الحي بإجراء تقييم طولي لنمو الورم في كل فأر (الشكل 4C) ، مما يسهل مراقبة التأثير العلاجي في دراستنا الأكبر اللاحقة. كان معدل أخذ الورم 100٪ (4/4 الفئران) كما تم تقييمه بواسطة إشارات IVIS. في هذه التجربة ، لم يلاحظ أي نقائل رئوية واضحة بالمنظار في وقت جمع الأنسجة (0/4 الفئران).
أخيرا ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان التسليم الموجه بواسطة خلايا الكبد AAV لجين CAF المقيد للسرطان ، Islr 4,25 ، يمكن أن يمنع نمو ورم خبيث كبدي CRC في نموذج الفأر قبل السريري هذا. ومن الجدير بالذكر أن الفئران المعالجة ب AAV8-Islr أظهرت تحسنا في بقاء الفئران على قيد الحياة وانخفضت إشارات IVIS من الأورام (الشكل 5A-C)25. أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية ل Smad1/5/8 المفسفرة أن فرط تعبير خلايا الكبد عن ISLR ، وهو مقوي إشارة BMP ، زاد من إشارات BMP في الأورام النقيلية (الشكل 5D). أدى العلاج باستخدام AAV8-Islr إلى تقليل عدد الخلايا المنتشرة Ki67 + في ورم خبيث كبدي CRC (الشكل 5E). للحصول على وصف كامل للنتائج ، راجع Kobayashi et al. ، أمراض الجهاز الهضمي ، 202125. تشير بياناتنا الجماعية إلى أن توصيل جين مثبط للورم بوساطة AAV8 إلى خلايا الكبد ، وهو مكون حيوي لسدى ورم الكبد النقيلي29 ، يمكن أن يكون نهجا وقائيا / علاجيا فعالا لنقائل الكبد CRC (الشكل 5F).
الشكل 1: يولد AAV8-Islr الذي يديره الوريد الذيل تعبيرا زائدا عن Islr في الكبد. (أ) مخطط تجريبي يوضح حقن الوريد الذيل ل AAV8 ، يليه حقن الوريد البابي للعضويات العضوية لسرطان القولون والمستقيم (CRC). ISH ، التهجين في الموقع ؛ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية, الكيمياء النسيجية المناعية; qRT-PCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. (ب) صور تمثيلية. تم إجراء تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع ل Islr باستخدام كبد من الفئران المعالجة AAV8-Islr أو AAV8-mRuby2. تم جمع الكبد بعد 2 أسابيع من حقن الوريد الذيل. أشرطة المقياس ، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حقن الوريد البابي للحبر الهندي يؤدي إلى توصيله إلى الكبد ، ولكن ليس الرئة . (أ) صور تمثيلية تظهر تشريح الجزء العلوي من البطن بعد بضع البطن. لاحظ أنه لتصور الوريد البابي ، يتم أخذ الأمعاء خارج تجويف البطن. تظهر الصورة الجانبية اليمنى شرحا تشريحيا لكل عضو وعاء. يشير السهم الأصفر إلى موقع الحقن. IVC ، الوريد الأجوف السفلي. (ب) صور تمثيلية للكبد والرئة بعد حقن الوريد البابي للحبر الهندي. تشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى أوعية ملطخة بالحبر الهندي. أشرطة القياس، 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: حقن الوريد البابي للعضويات العضوية لسرطان القولون والمستقيم يولد نقائل الكبد الغنية بالسدى. (أ) مخطط تجريبي يوضح حقن الوريد البابي ل Apc Δ / Δ و Trp53 Δ / Δ عضويات سرطان القولون (AP tumoroids). شريط مقياس ، 200 ميكرومتر T ، الأورام. (ب) صور تمثيلية مجهرية للكبد التي تم جمعها بعد 3-4 أسابيع من حقن الوريد البابي (يسار) أو الحقن داخل الطحال (يمين). تم حقن 5.0 × 105 خلايا مفردة من أورام AP في الوريد البابي أو الطحال. تم إجراء الحقن داخل الطحال كما هو موضح13. تشير العقيدات البيضاء إلى الأورام. T ، ورم. N ، الكبد الطبيعي. (C) صور تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) التمثيلية لنقائل الكبد CRC من نموذج فأر حقن الوريد البابي (اليسار والوسط) والإنسان (يمين). T ، ورم. N ، الكبد الطبيعي. S ، سدى. ، النخر. يشير الخط الأصفر المنقط إلى وجود حد بين الورم والكبد الطبيعي (يسار). (دال وهاء) الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) لأكتين العضلات الملساء ألفا (αSMA ؛ يسار) وتلطيخ Picro-Sirius الأحمر (يمين). (د) صور تمثيلية. (ه) التحديد الكمي للمناطق الموجبة αSMA (يسار) ومناطق بيكرو - سيريوس ذات الموجبة الحمراء (يمين). N = 4 فئران ، 5 HPFs (حقول الطاقة العالية ؛ 400x) / الماوس. (و) صورة تمثيلية تبين الكيمياء النسيجية المناعية ل EPCAM، وهي علامة خلية ظهارية. تشير الخطوط الخضراء المنقطة إلى تبرعم الورم. (ز و ح) الكيمياء النسيجية المناعية ل Ki67 ، وهي علامة على انتشار الخلايا. (ز) صورة تمثيلية. (ح) النسبة المئوية لخلايا Ki67+ في إجمالي الخلايا الظهارية. تم تصور الخلايا الظهارية عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين. N = 4 فئران ، 5 HPFs / الماوس. في (B)-(H) ، تم جمع جميع أنسجة كبد الفئران بعد 3-4 أسابيع من حقن أورام AP. يعني ± S.E.M. تمثل كل نقطة قيمة متوسطة قدرها 5 HPFs من الماوس (E و H). تمثل أشرطة المقياس 1 سم (B) و 1 مم (C ؛ يسار) ، و 100 ميكرومتر (C ؛ الوسط واليمين) ، و 50 ميكرومتر (D و F و G). لاحظ أن الدراسة التي أجريت على الأنسجة البشرية تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الدراسات العليا للطب بجامعة ناغويا (2017-0127). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل البقاء على قيد الحياة والتحليل الحركي لنمو الورم عن طريق التصوير في الجسم الحي . (أ) منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير. N = 4 فئران. (ب، ج) تم استخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) لتقييم حركية نمو الورم. (ب) صورة تمثيلية. تم استخدام المنطقة الموجودة في المربع الأحمر للقياس الكمي. (ج) حركية النمو. يتم عرض إشارات Luciferase من كل ماوس. N = 4 فئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يزيد توصيل الجينات بوساطة AAV8 من Islr إلى خلايا الكبد من إشارات BMP ، ويقلل من انتشار الورم ، ويحسن بقاء الفئران في نموذج حقن الوريد البابي لورم كبد CRC. (أ) منحنى بقاء كابلان-ماير. بعد أسبوعين من حقن الوريد الذيل من AAV-Islr أو AAV-mRuby2 ، تم إجراء حقن الوريد البابي للأورام CRC. (باء وجيم) تم تقييم إشارات لوسيفيراز المشتقة من البواسير باستخدام IVIS. (ب) صورة تمثيلية. (ج) التحديد الكمي لإشارات IVIS. N = 5 (AAV-mRuby2) و 8 (AAV-Islr) الفئران. متوسط ± S.E.M. (D) الصور التمثيلية. الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل Smad1/5/8 المفسفرة (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 هو جزيء المصب من إشارات البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) الذي يتم فسفرته عند تنشيط إشارات BMP49. N = 4 فئران لكل منهما. (ه) صور تمثيلية. الكيمياء النسيجية المناعية ل Ki67. N = 4 فئران لكل منهما. (و) موجز بياني. قد يكون تسليم الجينات الموجهة بوساطة خلايا الكبد AAV لجين لحمي مقيد للسرطان بمثابة استراتيجية علاجية لمنع انتشار CRC. أعاد التعبير المفرط بوساطة AAV8 عن Islr في خلايا الكبد تشكيل مكانة النقيلي عن طريق زيادة إشارات BMP وتطور ورم خبيث CRC محدود. للحصول على معلومات مفصلة ، راجع Kobayashi et al. ، أمراض الجهاز الهضمي ، 202125. اختبار سجل الرتبة (A) ، ومقاييس ANOVA المتكررة ثنائية الاتجاه (تحليل التباين) مع اختبار المقارنة المتعددة بعد Sidak المخصص في الأسبوع 3 (C). تم إعادة طباعة الشكل 5A-C من Gastroenterology ، المجلد 160 (4) ، كوباياشي وآخرون ، توازن إشارات BMP السترومالية بوساطة GREM1 و ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis ، الصفحات 1224-1239.e30 ، حقوق الطبع والنشر (2021) ، بإذن من Elsevier. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، أظهرنا أن حقن الوريد البابي للفئران CRC العضوية يولد بشكل متكرر نقائل الكبد الغنية بالخلايا الليفية التي تحاكي السمات النسيجية للنقائل الكبدية CRC البشرية. علاوة على ذلك ، عندما يقترن هذا النموذج قبل السريري بالعلاجات الموجهة بالسدى مثل العلاج الجيني بوساطة AAV8 ، فإنه يعمل كأداة مفيدة لتقييم الآثار العلاجية على بقاء الفئران ونمو الورم.
هناك ، على الأقل ، خطوتان حاسمتان في البروتوكول. أولا ، من المهم إعداد تعليق أحادي الخلية للأورام عن طريق التربسين الكامل للعضويات واستخدام مرشح شبكي لإزالة كتل الخلايا. يؤدي التفكك غير الكامل للأورام إلى تجمعات خلايا كبيرة ، يمكن أن يؤدي حقنها إلى سد الوريد البابي. هذا يسبب احتشاء الكبد وموت الحيوان22. ثانيا ، أثناء حقن الوريد البابي ، من الضروري تقليل النزيف من الوريد البابي. يجب إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد البابي. لتجنب ثقب الجانب الآخر من الوريد البابي ، يجب أن تبقى زاوية الإبرة المدرجة موازية تقريبا لوريد الباب. لمنع تمزق الوريد البابي أثناء الحقن ، لا ينبغي تحريك الإبرة بمجرد إدخالها بالكامل في الوريد البابي. مباشرة بعد إزالة الإبرة من الوريد البابي ، من الضروري الضغط على موقع الحقن باستخدام برعم قطني لمدة 5 دقائق على الأقل.
يجب تعديل رقم خلية الحقن وفقا للفأر المتلقي (على سبيل المثال ، الفأر المناعي مقابل الفأر الذي يعاني من نقص المناعة) والورم في الخط العضوي. في تجاربنا ، كان حقن 5.0 × 105 خلايا مفردة في تعليق 100 ميكرولتر كافيا لتوليد نقائل الكبد في الفئران المناعية. زيادة عدد الخلايا يمكن أن تزيد من خطر الانسداد في الوريد البابي وموت الحيوانات14 ، وبالتالي ينبغي النظر فيها بعناية. بالنظر إلى أن الأوراق السابقة استخدمت 5 × 104 إلى 5 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر لحقن الورم في البوابة أو الوريد المساريقي25،26،27،28 ، فإننا نعتبر أن نطاق عدد الخلايا هذا سيكون نقطة انطلاق جيدة للتحسين.
أحد القيود على نهج حقن الوريد البابي هو أنه لا يلخص تماما سلسلة كاملة من النقائل CRC. يتطلب الانبثاث الكبدي للسرطان خمس خطوات رئيسية: (1) غزو الخلايا السرطانية في الموقع الأساسي ، (2) الأوعية الدموية في الوعاء ، (3) بقاء الخلية في الدورة الدموية للبوابة ، (4) الإسراف من الوريد البابي إلى حمة الكبد ، و (5) الاستعمار في المكان النقيلي50. يسمح نموذج حقن الوريد البابي فقط بالتحقيق في الخطوات (3)-(5). للحصول على رؤى ثاقبة في العمليات النقيلية الأخرى ، من الضروري استخدام نماذج أخرى مثل النماذج المختبرية و / أو نموذج الماوس CRC الأساسي المتحور Notch1 الذي ينتقل بشكل متكرر إلى الكبد51.
تشمل أهمية طريقة حقن الوريد البابي فيما يتعلق بالطرق الحالية النمو الخاص بالكبد وارتفاع عبء الورم. يمكن أن يؤدي الانتشار البريتوني في نماذج الحقن الأخرى ونمو الورم الأولي في نماذج CRC الأولية إلى إرباك تحليل تطور ورم خبيث في الكبد. في المقابل ، فإن نهج الوريد البابي لدينا يولد بسرعة أورام خاصة بالكبد ، مما يبسط تحليلات البقاء على قيد الحياة ونمو الورم.
إحدى المزايا الرئيسية لزرع الأعضاء على حقن خط الخلية هي أن حقن الوريد البابي للأورام ولد البيئة الدقيقة الغنية بالخلايا الليفية التي تنسخ الفينومات سمة من سمات إزالة التنسج من CRC النقيلي البشري. ظروف الثقافة العضوية تلخص ميزات البيئة الدقيقة للورم وتدعم مجموعات الخلايا الجذعية المعوية ، بما في ذلك تضمين الخلايا في ECM 3D الغنية والمعقدة مع مزيج محدد من عوامل النمو24,52. هذا يؤدي إلى انتشار الخلايا السرطانية بطريقة تحافظ على المشهد الجيني للورم المصدر52,53. في المقابل ، ترتبط الثقافة التقليدية 2D لخطوط الخلايا السرطانية بالانتقاء النسيلي والتغيرات الجينومية / النسخية الشاذة التي لا تعكس بأمانة خصائص السرطانات الأصلية54. نحن نتوقع أن ظروف الثقافة القاسية نسبيا لزراعة 2D لخطوط الخلايا السرطانية تجبر الخلايا على التكيف مع نقص إشارات عامل ECM / النمو التي قد تؤدي بعد ذلك إلى أورام فقيرة بالسدى في الجسم الحي ، حيث لم تعد الخلايا بحاجة إلى إشارات مشتقة من السدى للبقاء على قيد الحياة.
من خلال الجمع بين نموذج حقن الوريد البابي العضوي مع العلاج الجيني بوساطة AAV8 ، وجدنا أن توصيل حمولة مثبطة للسرطان إلى خلايا الكبد قبل استعمار الخلايا السرطانية في الكبد يمكن أن يعدل مكانة النقيلي (قبل) لمنع نمو ورم خبيث CRC25. ومن المشجع أن التجارب السريرية أظهرت أن نقل الجينات بوساطة AAV في الجسم الحي إلى الكبد يحفز التعبير طويل الأجل عن الجين المتحول ويمكن أن يكون طريقة فعالة وآمنة لعلاج الأمراض الوراثية غير الورمية30،31،55. في المستقبل ، قد يكون لتسخير خلايا الكبد لمنع نقائل الكبد من خلال نهج AAV قيمة سريرية محتملة في مرضى السرطان المعرضين لخطر كبير من النقائل.
باختصار ، تظهر ورقتنا أن زرع العضوية CRC عبر الوريد البابي يولد نقائل الكبد الغنية بالخلايا الليفية ، والتي يمكن استغلالها لتطوير استراتيجيات علاجية تستهدف السدى. من خلال اقتران حقن الوريد البابي بالعلاج الموجه بالسدى مثل توصيل الجينات بوساطة AAV ، يمكن للمرء أن يحدد أهدافا لحمية جديدة لكبح تطور ورم خبيث CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP1156391 إلى D.L.W.، S.L.W.) (APP1081852 إلى D.L.W.، APP1140236 إلى S.L.W.، APPP1099283 إلى D.L.W.،)؛ مجلس السرطان SA فاز مشروع السرطان نيابة عن الجهات المانحة وحكومة ولاية جنوب أستراليا من خلال وزارة الصحة (MCF0418 إلى S.L.W., D.L.W.)؛ منحة معونة للبحث العلمي (B) (20H03467 إلى M.T) بتكليف من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان ؛ AMED-CREST (الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبيين ، البحوث الأساسية للعلوم والتكنولوجيا التطورية (19gm0810007h0104 و 19gm1210008s0101 إلى A.E.) ؛ مشروع أبحاث السرطان والتطور العلاجي (P-CREATE) من AMED (19cm0106332h0002 إلى A.E.) ؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم برنامج التحدي في الخارج للباحثين الشباب (إلى H.K.) ، زمالة مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى المملكة المتحدة) ، منحة Greaton الدولية للدكتوراه (إلى H.K.) ، منحة مؤسسة Lions Medical Research Foundation (إلى K.G).
نشكر الدكتور ليزيك ليسوفسكي في مرفق هندسة النواقل والجينوم (VGEF) ، معهد البحوث الطبية للأطفال (CMRI) (نيو ساوث ويلز ، أستراليا) لإنتاج ناقلات AAV المؤتلفة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
- Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
- Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
- Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
- Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
- Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
- Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
- Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
- Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
- Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
- McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
- Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
- Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
- Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
- Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
- de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
- Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
- Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
- George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
- Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
- Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
- Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
- Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
- Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
- Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
- Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).
