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Neuroscience

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Abstract

In Neuronen war die Mikrotubuliorientierung ein Schlüsselbewerter, um Axone zu identifizieren, die Plus-End-Out-Mikrotubuli und Dendriten haben, die im Allgemeinen eine gemischte Orientierung haben. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern von Mikrotubuli-Spitzen haben wir die axonalen Mikrotubuli abgebildet. Die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonerektomie initiieren, können mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Dieser Assay ist an andere Neuronen und genetische Hintergründe anpassbar, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen zu untersuchen.

Introduction

Neuronen haben eine ausgeklügelte Architektur mit spezialisierten Kompartimenten wie Dendriten, Zellkörpern, Axonen und Synapsen. Das neuronale Zytoskelett besteht aus den Mikrotubuli, Mikrofilamenten und Neurofilamenten und ihre unterschiedliche Organisation unterstützt die neuronalen Kompartimente strukturell und funktionell1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10 . Im Laufe der Jahre wurde die Organisation von Mikrotubuli als Schlüsseldeterminante für neuronale Polarität und Funktion identifiziert. Da Neuronen während der Entwicklung oder Regeneration einem strukturellen Umbau unterzogen werden, bestimmen die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli die Identität, den polarisierten Transport, das Wachstum und die Entwicklung verschiedener neuronaler Kompartimente7. Es ist daher unerlässlich, die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in vivo zu bewerten, um mit dem neuronalen Umbauprozess zu korrelieren.

Mikrotubuli bestehen aus Protofilamenten α und β Tubulin-Heterodimeren mit dynamischen Plusenden und relativ stabilen Minusenden11,12. Die Entdeckung des Plus-Tip-Komplexes und der damit verbundenen Endbindungsproteine haben es einer Plattform ermöglicht, die Mikrotubuli-Organisation zu bewerten13. Endbindungsproteine (EBP) assoziieren sich vorübergehend mit den wachsenden Plusenden der Mikrotubuli und ihre Assoziationsdynamik korreliert mit dem Wachstum der Mikrotubuli-Protofilamente14,15. Aufgrund der häufigen Assoziation und Dissoziation von Plusspitzenkomplex mit dem Mikrotubuli erscheint die Punktspreizfunktion von GFP-getaggtem EBP als "Komet" in einem Zeitrafferfilm15,16. Seit der bahnbrechenden Beobachtung in Säugetierneuronen16werden Endbindungsproteine, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, verwendet, um die Mikrotubulidynamik über verschiedene Modellsysteme und Neuronentypen17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen.

Aufgrund seines einfachen Nervensystems und seines transparenten Körpers hat sich C. elegans als hervorragendes Modellsystem erwiesen, um den neuronalen Umbau während der Entwicklung und Regeneration in vivo zu untersuchen. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodiertem EBP-2::GFP haben wir die Mikrotubuli im PLM-Neuron abgebildet, wodurch wir die Polarität der Mikrotubuli in zwei verschiedenen Neuriten dieses Neurons24bestimmen konnten. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung der EBP-Kometen als Maß für die Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Kontexten, zum Beispiel können die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonischer Axotomie initiieren, mit unserem Protokoll beurteilt werden. Dieser Assay kann angepasst werden, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen in verschiedenen Zelltypen und genetischen Hintergründen zu untersuchen.

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Protocol

1. Reporter-Sorte: Kultur und Pflege

HINWEIS: Um die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den PLM-Neuronen zu messen, verwendeten wir den Wurmstamm, der EBP-2::GFP unter dem Berührungsneuron-spezifischen Promotor mec-4 (juIs338-Allel) 18,25,26exprimiert. Für diesen Stamm verwenden wir Standard-Wurmkultur- und Wartungsmethoden27.

  1. Bereiten Sie das Nematodenwachstumsmedium (3,0 g / L Natriumchlorid, 2,5 g / L Pepton, 20,0 g / L Agar, 10 mg / L Cholesterin (verdünnt aus einer Stammlösung von 10 mg / ml)) in Wasser vor und autoklavieren Sie die Mischung.
  2. Kühlen Sie die Mischung kurz für 10-15 min, bevor Sie sie mit 1 mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumsulfat und 25,0 mM Kaliumphosphat monobasisch pH 6,0 ergänzen.
  3. Gießen Sie etwa 9 ml der Mischung mit einem sterilen Spender in 60 mm Petrischalen, gefolgt von einer Lagerung bei Raumtemperatur und sterilen Bedingungen für einen Tag und anschließender Lagerung bei 4 °C.
  4. 50 ml B-Brühe (5,0 g/L Natriumchlorid, 10,0 g/L Bacto-Trypton), Autoklaven vorbereiten und abkühlen, bevor sie mit einer einzigen Kolonie Escherichia coli (OP50-Stamm) geimpft werden.
  5. Kultur der Bakterien bei 37 °C für 12 Stunden. Bringen Sie die gekühlten NGM-Platten zur Aussaat auf Raumtemperatur und machen Sie mit einem sterilisierten Glasstreuer einen Abstrich von OP50-Bakterien auf die NGM-Platte.
  6. Halten Sie die geimpften NGM-Platten 12 Stunden lang bei 37 °C, wodurch ein Bakterien rasen für die Kultivierung von C. eleganserstellt werden kann. Diese Platten können bis zur Verwendung in einem 20 °C-Inkubator gelagert werden.
  7. Die transgene Belastung wird auf den ausgesäten NGM-Platten aufgezogen.
  8. Sterilisieren Sie einen Platindrahtpick auf Flamme und pflücken Sie 20-25 gravidierte erwachsene Hermaphroditen für den Transfer auf eine frisch gesäte Platte.
  9. Nach dem Transfer die Platte für 1 h in einen 20 °C-Inkubator schalten. Dann extrahieren Sie die Erwachsenen aus diesen Platten. Diese Platten enthalten nun Eier, die altersangepasst sind.
  10. Die Platten werden zur Aufzucht in den 20 °C-Inkubator verschoben, bis sie das interessierende Entwicklungsstadium erreichen, das in diesem Fall das L4-Stadium 43,5 Stunden nach der Eiablage ist. Für mehr Würmer, hintere mehrere Platten, um Eindränge zu vermeiden.
  11. Im gewünschten Entwicklungsstadium können diese Würmer zur Abbildung der EBP-2::GFP-Kometen montiert werden.

2. Probenvorbereitung: Montage von Würmern zur Bildgebung von EBP-2-Kometen

HINWEIS: Um die Live-Beobachtung der EBP-Kometen in den PLM-Neuronen zu ermöglichen, haben wir die Würmer auf Agarose-Pads montiert, um ihre Mobilität zu minimieren und gleichzeitig die Physiologie des Neurons nicht zu beeinträchtigen. Unter den verschiedenen Immobilisierungsmethoden haben wir 0,1 μm Polystyrolperlenlösung ausgewählt, die im Handel erhältlich ist. Wir haben das Montageverfahren beschrieben, das speziell für die EBP-2::GFP-Beobachtung verwendet wird.

  1. Eine Lösung von 10% Agarose wird durch Schmelzen von 0,2 g Agarose in 2 mL 1x M9-Puffer (0,02 M KH2PO4,0,02 MNa2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 MNH4Cl) in einem 5 mL Glasreagenzglas über einer Flamme zubereitet. Dieses Reagenzglas kann leicht in einen Heizblock passen, der die Agarose bis zur Verwendung im geschmolzenen Zustand hält.
  2. Mit einem Breitmaul-Tropfer einen Tropfen (ca. 100 μL) dieser geschmolzenen Agarose über einen sauberen Glasträger von 35 mm x 25 mm Abmessungen dosieren.
  3. Während es sich im geschmolzenen Zustand befindet, drücken Sie den Tropfen mit einem anderen Glasobjektträger, um einen dünnen Film der Agarose zwischen den Glasobjektträgern zu erzeugen. Die Agarose erstarrt als Film von etwa 0,5 - 1,0 mm Dicke in etwa 30 Sekunden.
  4. Sobald die Agarose erstarrt ist, halten Sie den unteren Schlitten in der nicht dominanten Hand und den oberen Schlitten in der dominanten Hand. Klappen Sie die obere Folie nach oben, während Sie die untere Rutsche stabil halten, wodurch das Agarose-Pad an einem der beiden Dias haftet.
  5. Wenn das geformte Agarose-Pad größer als die Coverlip-Größe (18 mm x 18 mm) ist, schneiden Sie die Kanten des Pads ab, um die erforderlichen Abmessungen zu erhalten, um eine ordnungsgemäße Platzierung des Coverslips zu gewährleisten. Diese Agarose-Pads sind für den sofortigen Gebrauch und nicht für die Lagerung.
  6. Untersuchen Sie das Agarose-Pad visuell auf eine glatte Oberfläche, die feucht und für die Montage geeignet ist. Wenn das Agarose-Pad der Luft ausgesetzt wird und getrocknet wird, erscheint die Oberfläche des Agarose-Pads faltig. Bereiten Sie in einem solchen Szenario ein frisches Agarose-Pad vor, wie in den Schritten 2-6 dieses Abschnitts erwähnt.
  7. Auf das Agarosepad werden 2 μL 0,1 μm Polystyrolperlenlösung als Montagemedium gelegt.
  8. Wählen Sie 3-4 Würmer mit einem Platindrahtpickel und verschieben Sie sie auf eine ungesäte NGM-Platte. Dieser Prozess gewährleistet die Entfernung von Oberflächenbakterien, die die Immobilisierung während der Montage behindern.
  9. Sobald die Würmer aus ihren Oberflächenbakterien kriechen, nehmen Sie sie zur Montage mit einem Platindrahtpickel auf und reanimieren Sie sie im Tropfen von Polystyrolperlen auf dem Agarose-Pad.
  10. Legen Sie vorsichtig einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Schlupf auf die Würmer. Um das Ausweiden der montierten Würmer zu verhindern, bewegen Sie den Abdeckungsschlupf nach dem Platzieren nicht.
  11. Montieren Sie den vorbereiteten Objektträger zur Bildgebung auf dem Mikroskop.

3. Imaging-Einrichtung und -Erfassung

HINWEIS: EBP-Kometen bewegen sich mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 0,22 μm/s, wie sie in den Säugetier- und PLM-Neuronen von C. elegans16,18beobachtet wurde. Um die Ereignisse in einer Zeitraffererfassung nach Nyquist-Kriterium28optimal abtasten zu können, sind räumliche und zeitliche Skalen von 0,09 μm bzw. 0,43 s erforderlich. Zur Vorbeugung von Phototoxizität oder Photobleaching haben wir die Spinning Disk-Erfassung verwendet. Im Folgenden haben wir unsere Imaging-Einrichtung und Erfassungseinstellungen beschrieben.

  1. Nehmen Sie die Bilder mit einem invertierten Mikroskop auf, das mit einer rotierenden Scheibeneinheit und einer Kamera ausgestattet ist. Schalten Sie das Setup gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
  2. Schalten Sie die Software ein, die das Setup steuert.
  3. Da es sich um ein invertiertes Mikroskop handelt, legen Sie den Objektträger mit den montierten Würmern auf die Bühne mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (5x oder 10x) mit dem Abdeckrlip nach unten.
  4. Richten Sie den Lichtweg zum Auge oder den sichtbaren Modus ein, der die Beleuchtung von Halogenlampen für Durchlicht und Quecksilberbogenlampen für reflektiertes Licht verwendet.
  5. Fokussieren und zentrieren Sie einen Wurm im Sichtfeld unter dem Hellfeld.
  6. Setzen Sie das Tauchöl ein und ändern Sie die Vergrößerung auf 63x (1,4NA / Öl) und fokussieren Sie den Wurmschwanz im Hellfeld für die PLM-Neuronen neu.
  7. Schalten Sie die Fluoreszenz der Quecksilberbogenlampe für eine kurze Neufokussierung der PLM-Neuronen ein. Platzieren Sie den richtigen Satz Reflektor (AF488) in den Lichtpfad für die Visualisierung von GFP.
  8. Stellen Sie das Mikroskop auf die Kameraaufnahme ein, indem Sie den Lichtweg zur Kamera lenken.
    HINWEIS: Die Steuerung der oben genannten Schritte 4-7 über den Dünnschichttransistor (TFT) -Bildschirm des Mikroskops ist schnell und verhindert unnötige Belichtung der Beleuchtung. Alternativ können Sie die Beleuchtung, den Reflektor über die Software steuern.
  9. Nach der Fokussierung des PLM-Neurons im Sichtfeld wählen Sie in der Softwareschnittstelle die Beleuchtung des 488 nm Lasers mit 30% Leistung und 300 ms Belichtung für die Kamera mit Electron Multiplying (EM) Gain-Wert 70. Variieren Sie diese Parameter je nach Ausdruck des Reporters nach Bedarf. Speichern Sie die Einstellungen als Konfiguration für nachfolgende Imaging-Sitzungen.
  10. Auf der Registerkarte Kanäle werden die Tracks mit jeweils einer bestimmten Beleuchtungs- und Kameraeinstellung gespeichert. Die hervorgehobene Spur ermöglicht eine Live-Visualisierung, während für die Aufnahme eines Bildes die Spur angekreuzt werden muss. Markieren Sie einen Kanal mit Hellfeld (DIC) für die Live-Visualisierung des Schwanzes des Wurms im Arbeitsbereich. Das Beispiel wird fokussiert und im Live-Imaging-Fenster des Arbeitsbereichs zentriert.
  11. Markieren Sie den Kanal mit 488 nm Laseranregung für eine schnelle Fokussierung des PLM-Neurons im Live-Imaging-Fenster. Beginnen Sie die Zeitraffererfassung, indem Sie die Zeitreihenparameter wie im nächsten Schritt erwähnt einstellen.
  12. Richten Sie mit 488 nm Laserbeleuchtung ein Experiment mit Zeitreihen für 2 Minuten und ohne Zeitintervall zwischen den Frames ein. Um die zeitlichen Skalen der Bildaufnahme beizubehalten, haben wir nur GFP-Fluoreszenz erfasst.
  13. Beginnen Sie mit der Erfassung auf der Registerkarte Experiment starten. Bei verwendung einer 63-fachen Vergrößerung wird die räumliche Auflösung auf 0,21 μm beschränkt, die von der Kamera mit der Pixelgröße von 0,09 μm abgetastet wird. Erfassen Sie einen Zeitraffer mit 3,3 Frames/s, um das Ereignis optimal zu erfassen. Das Zeitrafferbild hatte 396 Zeitrahmen, die über eine Dauer von 2 Minuten aufgenommen wurden. Speichern Sie das Bild nach der Aufnahme im Standardformat, auf das später mit der Standardsoftware oder ImageJ zugegriffen werden kann.

4. Beobachtung und Analyse

  1. Zeigen Sie eine Vorschau der Zeitraffererfassung in der Standardsoftware an oder öffnen Sie sie in Image J über das Bioformats-Plug-In.
    HINWEIS: Wir haben den Prozess der Bildanalyse in Bild J beschrieben.
  2. Installieren Sie das Bioformats-Plug-In in ImageJ.
    1. Alternativ können Sie die Standardformatdatei in .tif exportieren, um die Dateikompatibilität in ImageJ zu gewährleisten. Exportfunktion in ZEN2 führt zu einzelnen Frames des Bildes als diskrete .tif Dateien. Wir vermeiden diese Methode, um die Bildung einer großen Anzahl von Dateien zu verhindern.
  3. Öffnen Sie das Bild im Format '.czi' direkt in Image J über das Plugin 'Bioformats'. Das Bild wird als Multi-Image-Stack geöffnet. Wenn Sie die Exportfunktion der Standardsoftware verwenden, stellen Sie die Bilder mit dem folgenden Workflow in ImageJ als Multi-Image-Stack wieder dar: ImageJ-Programm > Image-Menü >-Stacks-Untermenü > Images To Stack.
  4. Zeigen Sie eine Vorschau des Bildes als Film an, indem Sie das Wiedergabesymbol in der linken unteren Ecke des Bildfensters verwenden. Die Kometen können als helle mobile Punkten im Zellkörper und in prozessen des PLM-Neurons gesehen werden. Wenn die Kometen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit Schritt 8 fort, andernfalls führen Sie die Schritte 5-7 dieses Abschnitts aus.
  5. Konvertieren Sie das Farbprofil des Bildes mit der Nachschlagetabelle (LUT) in ein Graustufenbild: Programm ImageJ > Menü Bild > Untermenü Nachschlagetabellen > Grautöne auswählen.
  6. LuT-Profil des Bildes zur einfachen Visualisierung umkehren: Programm ImageJ > Menü Bild > Untermenü Nachschlagetabellen > LUT umkehren.
  7. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an, um die Kometen zu sehen: ImageJ-Programm > Menü Bild > Untermenü anpassen > Helligkeit/Kontrast.
    1. Bewegen Sie die Schieberegler Minimum, Maximum, Helligkeit und Kontrast, um die gewünschte Skalierung der Intensitäten im gesamten Bild zu erhalten. Wir quantifizierten die Bilder mit deutlich sichtbaren Kometen.
  8. In der Basisversion von ImageJ werden Startwerkzeuge als Symbole dargestellt. Suchen Sie das Symbol mit einer Linie, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf, um ein Dropdown-Menü zu öffnen, und wählen Sie die Segmentierte Zeileaus. Zeichnen Sie die segmentierte Linie auf die Regionen von Interesse (ROI) mit ihrem Ursprung auf oder in der Nähe des Zellkörpers des Neurons.
    1. Für spätere Überlegungen speichern Sie den roi der segmentierten Linie über den ROI-Manager mit dem folgenden Workflow: ImageJ > Analyze > Tools > ROI Manager > Wählen Sie die gezeichnete Ablaufverfolgung im Bild aus und klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf Hinzufügen > Mehr im ROI-Manager-Fenster > Speichern.
  9. Entfernen Sie vor dem Generieren des Kymographen, da die räumlichen und zeitlichen Skalen unterschiedlich sind, die Skalierung, um die Messungen in Pixeln mit folgenden Mitteln zu erhalten:
    ImageJ > Analysieren > Skalieren > festlegen Klicken Sie hier, um die Skalierung zu entfernen, > OK.
  10. Generieren Sie mit der Funktion Reslice im Dropdown-Menü Image > Stacks einen Kymographen. Der Kymograph ist eine Darstellung des segmentierten ROI in der Zeit. Die horizontale Achse stellt den Abstand und die vertikale Achse die Zeit dar. Die diagonalen Spuren stellen die sich bewegenden Kometen dar. Im Allgemeinen nimmt der Kymograph das Farbprofil des Bildes und weist ansonsten ein Farbprofil zu, wie in den vorherigen Schritten 5-6 für die Visualisierung der diagonalen Spuren beschrieben.
  11. Zeichnen Sie mit der Funktion Gerade Linie im Dropdown-Menü des Linienwerkzeugs (siehe Schritt 9 dieses Abschnitts) gerade Linien über jede der diagonalen Leiterbahnen und hängen Sie sie im ROI-Manager an.
  12. Wechseln Sie auf der Registerkarte Analysieren zu Messungen festlegen und wählen Sie Die Parameter Mittlere Intensität und Grenzendes Rechteck zum Messen der Leiterbahnen aus.
  13. Klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf Messen, um ein Ergebnisfenster zu öffnen, das die mittlere Intensität des ROI, die X- und Y-Koordinaten der Linienspuren, Breite, Höhe, Winkel und Länge der Linienspuren liefert. Dieses Fenster kann als .csv Format gespeichert und später in ein Datenanalyseprogramm importiert werden.
  14. Im Tabellenkalkulationsprogramm öffnet sich das Ergebnisfenster mit den in Zeilen und Spalten verteilten Werten. Die relevanten Werte sind die Breite, Höhe und der Winkel der Leiterbahnen. Die Breite gibt die Verschiebung der Spur an, die Höhe die Dauer und der Winkel den Vektor. Da die Werte für Breite und Höhe in Pixeln vorliegen, multiplizieren Sie sie mit den räumlichen bzw. zeitlichen Skalen, um die messbaren Standardparameter zu erhalten.
  15. Da die linke Seite des Kymographen je nach Winkel proximal zum Zellkörper ist, klassifizieren Sie Kometen in Plus-End-Out oder Minus-End-Out (d.h. weg vom Zellkörper bzw. in Richtung Zellkörper). Klassifizieren Sie Winkel zwischen 1° bis -89° und -91° bis -179° als Plus-End-Out bzw. Minus-End-Out. Sammeln Sie Daten aus mehreren Kymographen in einer Tabelle für eine Studie und stellen Sie sie statistisch dar.

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Representative Results

Als repräsentatives Beispiel haben wir die in vivo Beobachtung der EBP-Kometen in den stationären und regenerierenden Axonen der PLM-Neuronen beschrieben. PLM-Neuronen befinden sich im Schwanzbereich des Wurms mit einem langen vorderen Prozess, der eine Synapse und einen kurzen hinteren Prozess bildet. PLM-Neuronen wachsen in vorderer und hinterer Richtung nahe der Epidermis und sind für das sanfte Berührungsgefühl bei den Würmern verantwortlich. Aufgrund ihrer vereinfachten Struktur und ihrer Zugänglichkeit für Bildgebung und Mikrochirurgie wurden PLM-Neuronen umfassend auf ihr Mikrotubuli-Zytoskelett29,den axonalen Transport30,31und die Regeneration19,32,neuronale Polarität24,33,34, Verhalten und Alterung35,36 untersucht.  und viele andere neuronale Prozesse. Wir verwendeten PLM-Neuronen, um die Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in vivo in einem transgen exprimierenden EBP-2::GFP unter dem mec-4-Promotor zu bewerten.

Um die stationäre Dynamik der Mikrotubuli zu überprüfen, wählten wir die Würmer aus, die den Pmec-4-EBP-2::GFP-Reporter exprimieren. Die Würmer wurden in 0,1 μm Polystyrolperlen auf 10% Agarose-Pads montiert. Der Coverlip wurde vorsichtig hinzugefügt und die Würmer wurden auf dem rotierenden Scheibenmikroskop abgebildet. Die PLM-Neuronen wurden zentriert und auf 63x fokussiert und mit einer Bildrate von 3,3 Bildern pro Sekunde abgebildet. Der vordere Prozess des PLM zeigte, dass sich ein Großteil der Kometen vom Zellkörper wegbewegte, während der hintere Prozess eine bidirektionale Bewegung der Kometen zeigte (Abbildung 1). Basierend auf der Richtung der Kometen enthält der vordere Prozess des PLM unipolare Plus-End-Out-Mikrotubuli, während der hintere Prozess eine gemischte Polarität (Plus- und Minus-End-Out) von Mikrotubuli aufwies(Abbildung 2)24.

Als Anwendung des Assays untersuchten wir die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den regenerierenden Axonen von PLM-Neuronen. Frühere Studien haben Methoden der Laser-Mediat-Axotomie mit verschiedenen Arten von Lasern etabliert, darunter UV-, Nanosekunden-, Pikosekunden- und Femtosekundenlaser31,37,38,39,40,41,42,43. Für diese Studie verwendeten wir einen Femtosekundenlaser, um den vorderen Prozess der PLM-Neuronen zu durchtrennen43. Nach der Verletzung wurden die Würmer auf ausgesäten NGM-Platten geborgen. Die Würmer wurden dann zu mehreren Zeitpunkten nach Verletzungen für die Beobachtung von EBP-2::GFP-Kometen abgebildet. Nach 2 h nach der Verletzung war ein abgetrenntes Axon sichtbar, jedoch waren die Kometen im Vergleich zu einem unverletzten Axon drastisch reduziert. 11 h nach der Verletzung haben die Axone eine Regenerationsreaktion in Form eines axonalen Nachwachsens ausgelöst, bei dem eine große Anzahl von EBP-2::GFP-Kometen beobachtet wurde (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Beobachtung und Analyse von EBP-Kometen. (A) Schematische Darstellung des PLM-Neurons, das seine Position in Bezug auf die Anatomie des Wurms zeigt. (B) Der Bezugspunkt wird nach dem Neuronentyp ausgewählt. In diesem Fall dient der Zellkörper des PLM-Neurons als Bezugspunkt für die Regionen, die für vordere oder hintere Prozesse von Interesse sind. Kometen (magentafarbene Kreise) sind als Punktion im Zellkörper, vordere und hintere Prozesse des PLM-Neurons sichtbar. Eine segmentierte Linie, die den interessierenden Neuriten (vorderer Prozess) verfolgt, wird gezeichnet, um einen Kymographen zu extrahieren. (C) Ein typischer ROI kann in einen Kymographen umgewandelt werden, bei dem es sich um ein Entfernungs-Zeit-Bild mit diagonalen Spuren handelt, die die sich bewegenden Kometen darstellen. In Bezug auf den Zellkörper werden die Plus-End-Out-Kometen in Cyan verfolgt, während Minus-End-Out-Kometen in Rosa verfolgt werden. Für den Raumbezug wird der segmentierte ROI über dem Rohkymographen dargestellt. (D) Zu den Messparametern gehören die Breite, Höhe, der Winkel und die Länge der Spur, die in Mikrotubuli-Parameter übersetzt werden können. (E) Analyseparameter werden aus den Messparametern Breite, Höhe und Winkel der Leiterbahnen extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 2
Abbildung 2: Stationäre Dynamik der Mikrotubuli im PLM-Axon. (A) Schnappschüsse einer repräsentativen Zeitreihe von EBP-2::GFP-Kometen in den PLM-Neuronen, die einige der EBP-2::GFP-Kometen (farbige Pfeile) in den vorderen und hinteren Prozessen des PLM-Neurons zeigen. (B) Zwei Regionen im vorderen Prozess (ROI-A und ROI-B) werden in Kymographen umgewandelt, in denen die Spuren, die den in 2(A) markierten Kometen entsprechen. Die Spuren wurden in Bezug auf die sich bewegenden Kometen in 2 (A) farb- und zahlencodiert. Die untere grafische Tafel stellt die beobachteten Spuren dar, die anhand ihrer Bewegungsrichtung unterschieden werden. Außerdem sind End-Out-Kometen in Cyan markiert, während Minus-End-Out-Kometen in Rosa markiert sind. Als Referenz wird die Position des Zellkörpers unten dargestellt. (C) Roi-C im hinteren Prozess wird in die Kymographen mit Spuren umgewandelt, die den sich bewegenden Kometen im hinteren Prozess in Abbildung 2(A) entsprechen. Das Bedienfeld ganz rechts stellt die Spuren am Plusende und Minusende in Bezug auf die Position des unten markierten Zellkörpers dar. Beachten Sie, dass sich die meisten Spuren in den axonalen Regionen (ROI-A und ROI-B) vom Zellkörper entfernen und Plus-End-Out-Mikrotubuli (Cyan-Spuren) darstellen. Im Gegenteil, im posteriierten Prozess (ROI-C) sind die Spuren bidirektional und repräsentieren die gemischte Polarität mit Plus- (Cyan-Spuren) und Minus-End-Out-Mikrotubuli (rosa Spuren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  

Figure 3
Abbildung 3: Mikrotubuli während der axonalen Regeneration in PLM-Neuronen.   (A) Schematische Darstellung des Axotomieverfahrens mit einem Femtosekundenlaser. Der Laser erzeugt eine Verletzung, gefolgt von der Einleitung des Nachwachsens. Wichtige Regenerationsreaktionen werden als Typ-1-Fusion, Typ-2-Fusion und nachwachsende Axone bewertet. (B) Repräsentative Bilder von PLM-Neuronen, die EBP-2::GFP in der unverletzten (0 h), axotomisierten (2 h nach axotomie) und Nachwachsensbedingungen (11 h nach axotomie) exprimieren. Der roi, der für die Kymographen verfolgt wurde, wurde auf den Bildern markiert. (C) Repräsentative Kymographen axonaler Regionen, die auf den unverletzten, verletzten, nachwachsenden und Typ 1 verschmolzenen Axonen zurückverfolgt wurden. Beachten Sie, dass die Anzahl der EBP-2::GFP-Kometen in den verletzten Axonen signifikant abnahm, gefolgt von ihrer robusten Bewegung (erhöhte Wachstumslänge und -dauer) im nachwachsenden Axon. Einzelne Spuren können quantifiziert und nach ihrer Richtung klassifiziert werden (cyanfarbene und rosa Spuren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik war im Laufe der Jahre ein Schwerpunkt auf dem Gebiet der Zytoskelettforschung. Mikrotubuli durchlaufen Keimbildung und Katastrophe zusammen mit einem kontinuierlichen Prozess dynamischer Instabilität44,45,46,47. Viele dieser Informationen wurden durch In-vitro-Assays wie Lichtstreuanzeigen von freiem vs. polymerisiertem Tubulin, Mikrotubuli-Wachstumstests aus fluoreszierendem Tubulin usw. gewonnen.48. Während die Live-Beobachtung von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Mikrotubuli in dünnen Zellen möglich ist, sind In-vivo-Messungen der Mikrotubuli-Dynamik eine Herausforderung.

Mit diesem transgenen Stamm können auch andere Berührungsneuronen wie PVM, ALM und AVM für die Mikrotubuli-Orientierung beurteilt werden. Die hier beschriebenen Bildgebungs- und Analyseverfahren können mit einem entsprechenden Reporter transgen an andere Neuronentypen bei C. elegans angepasst werden, jedoch wird die Variabilität der Kometendynamik über verschiedene Neuronen hinweg erwartet49,50,51,52. Diese Methode ist auch auf nicht-neuronale Zelltypen in C. elegans53,54,55,56anwendbar. In nicht-neuronalen Zelltypen wie Epidermis oder Embryo wird die Mikrotubulidynamik in zwei Dimensionen beobachtet53,54,55,56. Für solche Ereignisse werden Bilder der Zeitreihe mit Z-Projektion oder Stack-Differenzbildern in ein einzelnes Bild projiziert, um den ROI für die Kymographen zu extrahieren.

Wir beobachteten, dass die kommerziell erhältlichen Anästhetika wie Levamisolhydrochlorid, Tetramisol nicht für die Immobilisierung der Würmer geeignet sind, da sie die Kometendynamik drastisch abschwächen. Mikroperlen auf 10% Agarose-Pads sind eine geeignete Wahl für die Immobilisierung während der Bildgebung57,58. Eine längere Exposition gegenüber einem höheren Prozentsatz an Agarose und Mikroperlen kann jedoch zu körperlicher Belastung der Würmer führen. Es ist auch ratsam, die Mikroperlenlösung vor der Montage auf Raumtemperatur zu bringen, da ein Kälteschock zu einer Änderung der Mikrotubulidynamik59,60,61,62,63führen kann . Feuchtigkeit in den Agarose-Pads ist ein empfindlicher Faktor für die Immobilisierung, da Würmer in trockeneren Agarose-Pads ausgetrocknet werden können und feuchte Agarose-Pads die Mobilität von Würmern nicht einschränken können. Der Experimentator kann das Agarose-Pad vor der Montagevon 64visuell auf glatte und nivellierte Oberfläche untersuchen. Das Montageverfahren kann weiter verbessert werden, indem die mit den Würmern verbundenen Bakterien reduziert werden. Die oberflächenhaftenden Bakterien behindern die Immobilisierung des Wurms, während die Darmbakterien zu einer Autofluoreszenz führen, die das Signal von EBP-2::GFP-Kometen verschließen kann. So ist es vorzuziehen, die Würmer auf frisch ausgesäten OP50-Platten zu züchten und die Oberflächenbakterien zuentfernen,indem die Würmer auf ungesäte NGM-Platten gelegt oder mit M9-Puffer oder Schwimmen in Saccharoselösung65,66 gewaschenwerden.

Unter den Beobachtungsparametern sind die räumlichen und zeitlichen Skalen entscheidend, um die Kometen optimalabzutasten 28. EBP-2::GFP ist empfindlich gegenüber Photobleaching, daher sollte eine unnötige Lichteinwirkung verhindert werden. Live-Bildgebung mit fluoreszierenden Sonden verursacht auch phototoxische Schäden durch die Produktion von freien Radikalen. Dies könnte die Mikrotubuli-Dynamik behindern und für den Wurm tödlich sein. Ein Low-Exposure-Acquisition-Setup kann verwendet werden, um die Probleme des Photobleachings und der Phototoxizität zu umgehen. Die Analyseparameter gelten auch für mehrdimensionale Kometenbewegungen, allerdings muss man den Bezugspunkt richtig bestimmen.

Jedes der in dieser Studie beschriebenen Module kann an andere Reporter angepasst werden, die die Minusenden von Mikrotubuli, eine vesikuläre Organelle im Axon oder Dendriten usw. erkennen. Diese Technik kann auch auf andere Organismen oder Gewebe mit geeignetem Transgenese- und Bildgebungssystem angewendet werden. Die Informationen der Mikrotubulidynamik sind in anderen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Zellmigration, Aufrechterhaltung der Zellarchitektur und anderen mikrotubulibasierten Prozessen gültig. Verschiedene klinische Zustände wurden mit der Organisation und Dynamik von Mikrotubuli in Verbindung gebracht7, deren genaue Informationen pharmakologische Ansätze verstärken können.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Yishi Jin und Andrew Chisholm für die anfängliche Unterstützung und die in der Studie verwendete Sorte. Der Bakterienstamm OP50 wurde kommerziell vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) in Anspruch genommen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken auch Dharmendra Puri für die Standardisierung der experimentellen Verfahren. Die Studie wird durch den Kernzuschuss des National Brain Research Centre (unterstützt vom Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18 / 1 / 504331) an S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13 / 1 / 1 / 500874) an A.G.-R und einen Zuschuss des Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) an A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

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Neuroscience Ausgabe 177
<em>Im lebenden Organismus</em> Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in <em>Caenorhabditis elegans</em> Neuronen
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

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