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Neuroscience

वीवो में कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स और ओरिएंटेशन का आकलन

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

फ्लोरोसेंटली लेबल एंड बाइंडिंग प्रोटीन का उपयोग करके वीवो में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। हमने सी एलिगेंसके पीछे पार्श्व माइक्रोट्यूबल (पीएलएम) न्यूरॉन में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया।

Abstract

न्यूरॉन्स में, माइक्रोट्यूबुल ओरिएंटेशन उन एक्सॉन की पहचान करने के लिए एक प्रमुख निर्धारक रहा है जिनमें माइक्रोट्यूबुल्स और डेंड्राइट्स को प्लस-एंड किया जाता है जो आम तौर पर मिश्रित अभिविन्यास होते हैं। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। माइक्रोट्यूबुले टिप्स के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करके, हमने एक्सोनल माइक्रोट्यूबुल्स को इमेज किया। एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करने वाले माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तनों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यह परख विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अन्य न्यूरॉन्स और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलनीय है।

Introduction

न्यूरॉन्स में एक विस्तृत वास्तुकला होती है जिसमें विशेष डिब्बों जैसे डेंड्राइट्स, सेल बॉडीज, एक्सॉन और सिनेप्स होते हैं। न्यूरोनल साइटोस्केलेटन माइक्रोट्यूबुल्स, माइक्रोफिलामेंट्स और न्यूरोफिलामेंट्स का गठन किया जाता है और उनका अलग संगठन न्यूरोनल डिब्बों को संरचनात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 का समर्थन करता है . इन वर्षों में, माइक्रोट्यूबुल संगठन को न्यूरोनल ध्रुवता और कार्य के एक प्रमुख निर्धारक के रूप में पहचाना गया है। चूंकि न्यूरॉन्स विकास या पुनर्जनन के दौरान संरचनात्मक पुनर्मॉडलिंग से गुजरते हैं, माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास पहचान, ध्रुवीकृत परिवहन, विकास और विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों के विकास को निर्धारित करते हैं7। इसलिए, न्यूरोनल रिमॉडलिंग प्रक्रिया से सहसंबंधित करने के लिए वीवो में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास का आकलन करना अनिवार्य है।

माइक्रोट्यूबुल्स α और β तुबुलिन हेट्रोडिमर्स के प्रोटोफिलामेंट्स से मिलकर गतिशील प्लस सिरों और अपेक्षाकृत स्थिर माइनस11,12समाप्त होता है । प्लस टिप कॉम्प्लेक्स और संबंधित अंत बाध्यकारी प्रोटीन की खोज ने माइक्रोट्यूबुले संगठन13का आकलन करने के लिए एक मंच सक्षम किया है । माइक्रोट्यूबुल के बढ़ते प्लस सिरों के साथ अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन (ईबीपी) क्षणिक रूप से संबद्ध होते हैं और उनकी संघ गतिशीलता माइक्रोटुबुल प्रोटोफिलामेंट्स14, 15के विकास से सहसंबद्ध होती है। माइक्रोट्यूबुले के साथ प्लस टिप कॉम्प्लेक्स के लगातार सहयोग और वियोजन के कारण, जीएफपी-टैग किए गए ईबीपी का बिंदु प्रसार कार्य टाइमलैप्स मूवी15,16में "धूमकेतु" के रूप में दिखाई देता है। चूंकि स्तनधारी न्यूरॉन्स16में अग्रणी अवलोकन के बाद से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग विभिन्न मॉडल प्रणालियों और न्यूरॉन प्रकार 17 , 18 ,19, 20 ,22,22,23में माइक्रोटुबुल गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए किया गया है ।

अपने सरल तंत्रिका तंत्र और पारदर्शी शरीर के कारण, सी एलिगेंस वीवो मेंविकास और उत्थान के दौरान न्यूरोनल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली साबित हुई है। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ईबीपी-2:: जीएफपी का उपयोग करके, हमने पीएलएम न्यूरॉन में माइक्रोट्यूबुल्स को चित्रित किया, जिसने हमें इस न्यूरॉन24के दो अलग-अलग न्यूराइट्स में माइक्रोट्यूबुल्स की ध्रुवीयता निर्धारित करने की अनुमति दी। यह विधि विभिन्न सेलुलर संदर्भों में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता के उपाय के रूप में ईबीपी धूमकेतु के अवलोकन और मात्राकरण की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तन जो एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। इस परख को विविध सेल प्रकारों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. रिपोर्टर तनाव: संस्कृति और रखरखाव

नोट: पीएलएम न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास को मापने के लिए, हमने ईबीपी-2:: जीएफपी के तहत स्पर्श न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर mec-4 (juIs338 allele)18,25,26को व्यक्त करने वाले कीड़ा तनाव का उपयोग किया। हम इस तनाव के लिए मानक कृमि संस्कृति और रखरखाव विधियों का उपयोगकरें 27.

  1. नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (3.0 ग्राम/एल सोडियम क्लोराइड, 2.5 ग्राम/एल पेप्टोन, 20.0 ग्राम/एल एगर, 10 मिलीग्राम/एल कोलेस्ट्रॉल (10 मिलीग्राम/एमएल) के स्टॉक समाधान से पतला) पानी में तैयार करें और मिश्रण को ऑटोक्लेव करें।
  2. मिश्रण को 1 एमएम कैल्शियम क्लोराइड, 1 एमएम मैग्नीशियम सल्फेट और 25.0 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक पीएच 6.0 के साथ सप्लीमेंट करने से पहले 10-15 मिनट के लिए संक्षेप में ठंडा करें।
  3. एक बाँझ मशीन का उपयोग कर 60 मिमी पेट्री व्यंजनों में मिश्रण के लगभग 9 एमएल डालो और एक दिन के लिए बाँझ स्थितियों और 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद में भंडारण के बाद भंडारण के बाद।
  4. बी शोरबा (5.0 ग्राम/एल सोडियम क्लोराइड, 10.0 ग्राम/एल बैक्टो-ट्राइप्टोन) की 50 एमएल तैयार करें और एस्चेरिचिया कोलाई (OP50 स्ट्रेन) की एक कॉलोनी के साथ इनोक्यूलेशन करने से पहले इसे ठंडा करें।
  5. 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया संस्कृति। बीज बोने के लिए कमरे के तापमान के लिए रेफ्रिजरेटेड एनजीएम प्लेटें लाओ और एक निष्फल ग्लास स्प्रेडर का उपयोग करके एनजीएम प्लेट पर OP50 बैक्टीरिया का धब्बा बनाएं।
  6. टीका लगाए गए एनजीएम प्लेटों को 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जो सी एलिगेंसकी खेती के लिए बैक्टीरियल लॉन के गठन की अनुमति देगा। इन प्लेटों को उपयोग तक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहित किया जा सकता है।
  7. वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों पर ट्रांसजेनिक तनाव को पीछे करें।
  8. एक प्लेटिनम तार लौ पर लेने और एक हौसले से वरीयता प्राप्त थाली में स्थानांतरित करने के लिए 20-25 ग्रेविड वयस्क hermaphrodites उठाओ ।
  9. एक बार स्थानांतरित होने के बाद, प्लेट को 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में शिफ्ट करें। फिर, इन प्लेटों से वयस्कों को निकालें। इन प्लेटों में अब ऐसे अंडे होंगे जो उम्र से मेल खाते हैं।
  10. प्लेटों को पालने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में शिफ्ट करें जब तक कि वे ब्याज के विकास के चरण तक नहीं पहुंच जाते जो इस मामले में अंडे बिछाने के ४३.५ घंटे बाद एल4 चरण है । अधिक कीड़े के लिए, भीड़ से बचने के लिए कई प्लेटों को पीछे करें।
  11. वांछित विकास के स्तर पर, इन कीड़े ईबीपी-2 की इमेजिंग के लिए मुहिम शुरू की जा सकती है:: GFP धूमकेतु।

2. नमूना तैयारी: ईबीपी-2 धूमकेतु की इमेजिंग के लिए कीड़े का बढ़ना

नोट: पीएलएम न्यूरॉन्स में ईबीपी धूमकेतु के लाइव अवलोकन को सक्षम करने के लिए, हमने न्यूरॉन के शरीर विज्ञान से समझौता न करते हुए उनकी गतिशीलता को कम करने के लिए एगर उठे पैड पर कीड़े लगाए। विभिन्न स्थिरीकरण विधियों में, हमने व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध 0.1 माइक्रोन माइक्रोन पॉलीस्टीरिन मनका समाधान चुना है। हमने ईबीपी-2 के लिए विशेष रूप से उपयोग की जाने वाली बढ़ती प्रक्रिया को रेखांकित किया है: GFP अवलोकन।

  1. 1x M9 बफर (0.02 एम केएच 2 पीओ4,0.02 एमएनए2एचपीओ4,0.008 एम एनएसीएल, 0.02 एम एनएच4सीएल) के 2 एमसीएल में 0.2 ग्राम एग्रस पिघलने से 10% एगरे का समाधान तैयार करें। यह टेस्ट ट्यूब आसानी से एक हीटिंग ब्लॉक में फिट हो सकती है जो उपयोग तक पिघली हुई स्थिति में उत्पन्न रहती है।
  2. एक चौड़े मुंह वाले ड्रॉपर का उपयोग करके, 35 मिमी x 25 मिमी आयामों की एक साफ ग्लास स्लाइड पर इस पिघले हुए एगर की एक बूंद (लगभग 100 माइक्रोन) वितरित करें।
  3. जबकि यह पिघला हुआ राज्य में है, ग्लास स्लाइड के बीच एगर उठी की एक पतली फिल्म बनाने के लिए एक और ग्लास स्लाइड के साथ ड्रॉप दबाते हैं। लगभग 30 सेकंड में मोटाई में लगभग 0.5 - 1.0 मिमी की एक फिल्म के रूप में एगर उठी।
  4. एक बार जब एगरेज़ जम जाता है, तो गैर-प्रमुख हाथ में नीचे की स्लाइड और प्रमुख हाथ में शीर्ष स्लाइड पकड़ें। ऊपर की स्लाइड को पलटें, जबकि नीचे की स्लाइड स्थिर है जिसके परिणामस्वरूप एगर उठे पैड दो स्लाइडों में से एक से चिपक जाते हैं।
  5. यदि गठित एगरेज़ पैड कवरस्लिप आकार (18 मिमी x 18 मिमी) से बड़ा है, तो कवरस्लिप के उचित प्लेसमेंट को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक आयामों को प्राप्त करने के लिए पैड के किनारों को ट्रिम करें। ये एगरेज़ पैड तत्काल उपयोग के लिए हैं और संग्रहीत नहीं किए जाते हैं।
  6. नेत्रहीन एक चिकनी सतह के लिए एगर उठे पैड का निरीक्षण करें जो नम हैं और बढ़ते के लिए उपयुक्त हैं। यदि एगर उठे पैड हवा के संपर्क में आ जाता है और सूख जाता है, तो एगर उठे पैड की सतह झुर्रियों वाली दिखाई देती है। ऐसे परिदृश्य में, इस खंड के चरण 2-6 में उल्लिखित ताजा एग्राजिंग पैड तैयार करें।
  7. एगर उठे पैड पर, बढ़ते माध्यम के रूप में 0.1 माइक्रोन माइक्रोन पॉलीस्टीरिन मनका समाधान के 2 माइक्रोन डालें।
  8. प्लेटिनम तार लेने का उपयोग करके 3-4 कीड़े चुनें और उन्हें एक गैर वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट पर शिफ्ट करें। यह प्रक्रिया सतह बैक्टीरिया को हटाने को सुनिश्चित करती है जो बढ़ते के दौरान स्थिरीकरण में बाधा डालती है।
  9. एक बार जब कीड़े अपनी सतह बैक्टीरिया से बाहर निकल जाते हैं, तो उन्हें प्लेटिनम तार लेने का उपयोग करके बढ़ते हुए लेने के लिए उठाएं और उन्हें एग्राजिंग पैड पर पॉलीस्टीरिन मोतियों की बूंद में फिर से खर्च करें।
  10. ध्यान से, कीड़े पर 18 मिमी x 18 मिमी कवरलिप रखें। घुड़सवार कीड़े के evisceration को रोकने के लिए, प्लेसमेंट के बाद कवरस्लिप को स्थानांतरित न करें।
  11. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप पर तैयार स्लाइड माउंट।

3. इमेजिंग सेटअप और अधिग्रहण

नोट: ईबीपी धूमकेतु 0.22 माइक्रोन/एस के अनुमानित वेग के साथ यात्रा करते हैं जैसा कि सी एलिगेंस16,18के स्तनधारी और पीएलएम न्यूरॉन्स में मनाया गया है। Nyquist मापदंड के अनुसार एक समय चूक अधिग्रहण में घटनाओं का अधिकतम नमूना लेने के लिए28,क्रमशः 0.09 माइक्रोन और 0.43 एस के स्थानिक और लौकिक तराजू की आवश्यकता है। फोटोटॉक्सीसिटी या फोटोब्लैचिंग की रोकथाम के लिए, हमने कताई डिस्क अधिग्रहण का उपयोग किया। हमने नीचे अपने इमेजिंग सेटअप और अधिग्रहण सेटिंग्स का वर्णन किया है।

  1. एक कताई डिस्क इकाई और कैमरे से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को कैप्चर करें। निर्माता के निर्देश के अनुसार सेटअप चालू करें।
  2. सेटअप को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर को चालू करें।
  3. चूंकि यह एक उल्टे माइक्रोस्कोप है, इसलिए स्लाइड को कम आवर्धन उद्देश्य (5x या 10x) के साथ मंच पर घुड़सवार कीड़े के साथ रखें।
  4. आंख या दृश्य मोड के लिए प्रकाश पथ स्थापित करें जो परावर्तित प्रकाश के लिए संचारित प्रकाश और पारा चाप दीपक के लिए हैलोजन लैंप से रोशनी का उपयोग करता है।
  5. फोकस और ब्राइटफील्ड के तहत दृश्य क्षेत्र में एक कीड़ा केंद्र ।
  6. विसर्जन तेल रखो और 63x (1.4NA/तेल) के लिए आवर्धन बदल जाते हैं और पीएलएम न्यूरॉन्स के लिए ब्राइटफील्ड में कीड़ा पूंछ refocus ।
  7. पीएलएम न्यूरॉन्स के संक्षिप्त पुनर्केंद्रित के लिए पारा चाप दीपक के फ्लोरेसेंस को चालू करें। जीएफपी के दृश्य के लिए प्रकाश पथ में रिफ्लेक्टर (AF488) का सही सेट रखें।
  8. कैमरे के लिए प्रकाश पथ निर्देशन द्वारा कैमरा अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप की पतली फिल्म ट्रांजिस्टर (टीएफटी) स्क्रीन के माध्यम से उपरोक्त चरणों को 4-7 को नियंत्रित करना त्वरित है और रोशनी के अनावश्यक संपर्क को रोकता है। वैकल्पिक रूप से, सॉफ्टवेयर के माध्यम से रोशनी, रिफ्लेक्टर को नियंत्रित करें।
  9. व्यू फील्ड में पीएलएम न्यूरॉन के फोकस करने के बाद, सॉफ्टवेयर इंटरफेस में 30% पावर के साथ 488 एनएम लेजर की रोशनी और इलेक्ट्रॉन गुणा (ईएम) गेन वैल्यू 70 के साथ कैमरे के लिए 300 एमएस एक्सपोजर का चयन करें। रिपोर्टर अभिव्यक्ति के आधार पर, आवश्यकतानुसार इन मापदंडों को अलग करें। बाद इमेजिंग सत्रों के लिए एक विन्यास के रूप में सेटिंग्स स्टोर करें।
  10. चैनल टैब एक विशिष्ट रोशनी और कैमरा सेटिंग के साथ प्रत्येक पटरियों को स्टोर करता है। हाइलाइट किया गया ट्रैक लाइव विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जबकि एक छवि प्राप्त करने के लिए ट्रैक को टिक करने की आवश्यकता होती है। कार्यक्षेत्र में कीड़े की पूंछ के लाइव विज़ुअलाइज़ेशन के लिए ब्राइटफील्ड (डीआईसी) के साथ एक चैनल को हाइलाइट करें। नमूना केंद्रित है और कार्यक्षेत्र की लाइव इमेजिंग खिड़की में केंद्रित है।
  11. लाइव इमेजिंग विंडो में पीएलएम न्यूरॉन के त्वरित ध्यान केंद्रित करने के लिए 488 एनएम लेजर उत्तेजन के साथ चैनल को हाइलाइट करें। एक बार ध्यान केंद्रित करने के बाद, अगले चरण में उल्लिखित समय श्रृंखला मापदंडों को निर्धारित करके समय चूक अधिग्रहण शुरू करें।
  12. 488 एनएम लेजर रोशनी का उपयोग करना, 2 मिनट के लिए समय श्रृंखला के साथ एक प्रयोग सेट करें और फ्रेम के बीच कोई समय अंतराल न हो। छवि अधिग्रहण के लौकिक तराजू को बनाए रखने के लिए, हमने केवल जीएफपी फ्लोरेसेंस हासिल किया।
  13. स्टार्ट एक्सपेरिमेंट टैब का उपयोग करके, अधिग्रहण शुरू करें। 63x आवर्धन का उपयोग करने से स्थानिक रिज़ॉल्यूशन 0.21 माइक्रोन तक सीमित हो जाता है जिसे कैमरे द्वारा 0.09 माइक्रोन के पिक्सेल आकार पर नमूना दिया जाता है। घटना का बेहतर नमूना लेने के लिए 3.3 फ्रेम/एस पर एक समय चूक प्राप्त करें। समय चूक छवि 396 समय फ्रेम 2 मिनट की अवधि में अधिग्रहीत किया था. अधिग्रहण के बाद, डिफ़ॉल्ट प्रारूप में छवि को सहेजें, जिसे बाद में डिफ़ॉल्ट सॉफ्टवेयर या इमेजजे द्वारा एक्सेस किया जा सकता है।

4. अवलोकन और विश्लेषण

  1. डिफ़ॉल्ट सॉफ्टवेयर में टाइमलैप्स अधिग्रहण का पूर्वावलोकन करें या इसे अपने बायोफॉर्मेट प्लग-इन के माध्यम से इमेज जे में खोलें।
    नोट: हमने इमेज जे में छवि विश्लेषण की प्रक्रिया का वर्णन किया है।
  2. इमेजजे में बायोफॉर्मेट प्लग-इन स्थापित करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, इमेजजे में फाइल अनुकूलता के लिए डिफ़ॉल्ट प्रारूप फ़ाइल को .tif में निर्यात करें। ZEN2 में निर्यात कार्य के परिणामस्वरूप छवि के अलग-अलग फ्रेम असतत .tif फ़ाइलों के रूप में होते हैं। हम बड़ी संख्या में फ़ाइलों के गठन को रोकने के लिए इस विधि से बचते हैं।
  3. अपने 'बायोफॉर्मेट्स' प्लगइन के माध्यम से सीधे इमेज जे में '.czi' प्रारूप में छवि खोलें। छवि एक बहु-छवि ढेर के रूप में खुलती है। यदि डिफ़ॉल्ट सॉफ़्टवेयर के "निर्यात" फ़ंक्शन का उपयोग करते हैं, तो इमेजजे में निम्नलिखित कार्यप्रवाह का उपयोग करके छवियों को बहु-छवि स्टैक के रूप में पुनर्गठित करें: इमेजजे प्रोग्राम > इमेज मेनू > स्टैक सबमेन्यू > इमेजेज टू स्टैक।
  4. छवि खिड़की के बाएं नीचे कोने में प्ले आइकन का उपयोग कर एक फिल्म के रूप में छवि पूर्वावलोकन । धूमकेतु कोशिका शरीर और पीएलएम न्यूरॉन की प्रक्रियाओं में उज्ज्वल मोबाइल punctae के रूप में देखा जा सकता है। यदि धूमकेतु स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, तो 8 कदम आगे बढ़ें अन्यथा इस अनुभाग के चरण 5-7 का पालन करें।
  5. लुकअप टेबल (एलयूटी) का उपयोग करके छवि के रंग प्रोफ़ाइल को ग्रेस्केल छवि में परिवर्तित करें: इमेजजे प्रोग्राम > इमेज मेनू > लुकअप टेबल्स सबमेनू > सेलेक्ट ग्रेस।
  6. आसान दृश्य के लिए छवि की LUT प्रोफ़ाइल उलटा: ImageJ कार्यक्रम > छवि मेनू > लुकअप टेबल्स सबमेनू > उलटा LUT।
  7. धूमकेतु देखने के लिए छवि की चमक और विपरीत को समायोजित करें: इमेजजे प्रोग्राम > इमेज मेनू > सबमेनू > ब्राइटनेस/कंट्रास्ट को एडजस्ट करें।
    1. छवि में तीव्रता के वांछित स्केलिंग के लिए न्यूनतम, अधिकतम, चमक और कंट्रास्ट के स्लाइडर्स को ले जाएं। हमने धूमकेतु के साथ छवियों को स्पष्ट रूप से दिखाई दिया।
  8. इमेजजे के मूल संस्करण में स्टार्टअप टूल्स हैं जो आइकन के रूप में दर्शाए गए हैं। ड्रॉपडाउन मेनू खोलने और खंडित रेखा का चयन करने के लिए एक लाइन के साथ आइकन का पता लगाएं और सही क्लिक करें। न्यूरॉन के सेल शरीर पर या उसके पास अपनी उत्पत्ति के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों पर खंडित रेखा खींचें।
    1. बाद के विचारों के लिए, निम्नलिखित कार्यप्रवाह का उपयोग करके आरओआई प्रबंधक के माध्यम से खंडित लाइन आरओआई को बचाएं: इमेजजे > > टूल्स का विश्लेषण > आरओआई मैनेजर > छवि में तैयार ट्रेस का चयन करें और आरओआई मैनेजर विंडो में जोड़ें > आरओआई मैनेजर विंडो में जोड़ें > सेवकरें।
  9. कायनाग्राफ उत्पन्न करने से पहले, क्योंकि स्थानिक और लौकिक तराजू निम्नलिखित का उपयोग करके पिक्सेल में माप प्राप्त करने के लिए स्केलिंग को अलग-अलग निकालते हैं:
    इमेजजे > स्केल को हटाने > लिए क्लिक > ठीक > > सेट स्केल का विश्लेषण करें।
  10. इमेज > स्टैक ड्रॉपडाउन मेनू के तहत रिस्लिक फ़ंक्शन का उपयोग करके, एक कायनोग्राफ उत्पन्न करें। का्योग्राफ समय पर खंडित आरओआई का प्रतिनिधित्व है। क्षैतिज धुरी दूरी का प्रतिनिधित्व करता है और ऊर्ध्वाधर धुरी समय का प्रतिनिधित्व करता है। विकर्ण निशान चलती धूमकेतु का प्रतिनिधित्व करते हैं। आम तौर पर, कायोग्राफ छवि का रंग प्रोफ़ाइल लेता है अन्यथा विकर्ण निशान के दृश्य के लिए पूर्ववर्ती चरणों 5-6 में वर्णित एक रंग प्रोफ़ाइल आवंटित करता है।
  11. लाइन टूल के ड्रॉप-डाउन मेनू में सीधी रेखा फ़ंक्शन का उपयोग करना (इस खंड के चरण 9 को देखें) प्रत्येक विकर्ण निशान पर सीधी रेखाएं खींचें और उन्हें आरओआई प्रबंधक में संलग्न करें।
  12. विश्लेषण टैब के तहत, सेट माप पर जाएं और निशान को मापने के लिए औसत तीव्रता और बाउंडिंग आयत मापदंडों का चयन करें।
  13. आरओआई प्रबंधक विंडो में, क्लिक करें उपाय जो एक परिणाम खिड़की खोलेगा जो आरओआई की औसत तीव्रता, लाइन निशान, चौड़ाई, ऊंचाई, कोण और लाइन के निशान की लंबाई के एक्स और वाई निर्देशांक को प्राप्त करेगा। इस विंडो को .csv प्रारूप के रूप में सहेजा जा सकता है और बाद में डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में आयात किया जा सकता है।
  14. स्प्रेडशीट कार्यक्रम में, परिणाम खिड़की पंक्तियों और स्तंभों में वितरित मूल्यों के साथ खुलती है। प्रासंगिक मान निशान की चौड़ाई, ऊंचाई और कोण हैं। चौड़ाई ट्रेस के विस्थापन देता है, ऊंचाई अवधि देता है और कोण वेक्टर का प्रतिनिधित्व करता है। चूंकि चौड़ाई और ऊंचाई मान पिक्सल में हैं, इसलिए मानक मापने योग्य मापदंडों को प्राप्त करने के लिए क्रमशः स्थानिक और लौकिक तराजू के साथ उन्हें गुणा करें।
  15. चूंकि कामोग्राफ का बायां हिस्सा कोशिका शरीर के समीपस्थ होता है, कोण के आधार पर, धूमकेतु को प्लस-एंड-आउट या माइनस-एंड-आउट (यानी, कोशिका शरीर से दूर या कोशिका शरीर की ओर क्रमशः) में वर्गीकृत करें। क्रमशः प्लस-एंड-आउट और माइनस-एंड-आउट के रूप में 1 डिग्री से -89 डिग्री और -91 डिग्री से -179° के बीच कोणों को वर्गीकृत करें। अध्ययन के लिए स्प्रेडशीट में कई केमोग्राफ से डेटा का मिलान करें और सांख्यिकीय रूप से प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Representative Results

एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हमने स्थिर राज्य में ईबीपी धूमकेतु के वीवो अवलोकन और पीएलएम न्यूरॉन्स के एक्सॉन को पुनर्जीवित करने का वर्णन किया है। पीएलएम न्यूरॉन्स एक लंबी पूर्वकाल प्रक्रिया के साथ कीड़ा के पूंछ क्षेत्र में स्थित हैं जो एक सिनेप्स और एक छोटी पीछे की प्रक्रिया बनाती है। पीएलएम न्यूरॉन्स एपिडर्मिस के करीब पूर्वकाल-पीछे की दिशा में बढ़ते हैं और कीड़े में कोमल स्पर्श सनसनी के लिए जिम्मेदार होते हैं। उनकी सरलीकृत संरचना, और इमेजिंग और माइक्रोसर्जरी के लिए उत्तरदायी होने के कारण, पीएलएम न्यूरॉन्स को उनके माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन29,एक्सोनल परिवहन30, 31,और पुनर्जनन19,32,न्यूरोनल ध्रुवीयता24,33,34,व्यवहार और उम्र बढ़नेकेलिए बड़े पैमाने पर जांच की गई है  और कई अन्य न्यूरोनल प्रक्रियाएं। हमने एमईसी-4 प्रमोटर के तहत ईबीपी-2::जीएफपी को व्यक्त करते हुए ट्रांसजेनिक में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता और अभिविन्यास का आकलन करने के लिए पीएलएम न्यूरॉन्स का उपयोग किया।

माइक्रोट्यूबल्स की स्थिर-राज्य गतिशीलता की जांच करने के लिए, हमने पीएमईसी-4 -ईबीपी-2::GFPरिपोर्टर को व्यक्त करते हुए कीड़े को चुना। कीड़े 10% एगरेग्या पैड पर 0.1 माइक्रोन पॉलीस्टीरिन मोतियों में घुड़सवार थे। कवरलिप को धीरे-धीरे जोड़ा गया था, और कताई डिस्क माइक्रोस्कोप पर कीड़े को चित्रित किया गया था। पीएलएम न्यूरॉन्स केंद्रित थे और 63x पर केंद्रित थे और प्रति सेकंड 3.3 फ्रेम की फ्रेम दर के साथ चित्रित किए गए थे। पीएलएम की पूर्ववर्ती प्रक्रिया ने अधिकांश धूमकेतुओं को कोशिका निकाय से दूर जाते हुए दिखाया जबकि पीछे की प्रक्रिया में धूमकेतु(चित्र 1)का द्विदिशात्मक आंदोलन दिखाया गया । धूमकेतु की दिशा के आधार पर, पीएलएम की पूर्वकाल प्रक्रिया में एकध्रुवीय प्लस-एंड-आउट माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं जबकि पीछे की प्रक्रिया में माइक्रोट्यूबुल्स(चित्र 2)24के मिश्रित ध्रुवता (प्लस और माइनस-एंड-आउट) होते हैं।

परख के एक आवेदन के रूप में, हमने पीएलएम न्यूरॉन्स के पुनरुत्थान वाले एक्सॉन में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास का पता लगाया। पिछले अध्ययनों में विभिन्न प्रकार के लेजर, यूवी, नैनोसेकंड, पिकोसेकंड, और फेमटोसेकंड लेजर31, 37,38, 39,40,41,42,43सहित विभिन्न प्रकार के लेजर मध्यस्थता एक्सोटॉमी के तरीकों की स्थापना की गई है। इस अध्ययन के लिए, हमने पीएलएम न्यूरॉन्स43की पूर्वकाल प्रक्रिया को तोड़ने के लिए एक फेमटोसेकंड लेजर का उपयोग किया। चोट के बाद, कीड़े वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों पर बरामद किए गए । इसके बाद ईबीपी-2 के अवलोकन के लिए चोट के बाद कई समय बिंदुओं पर कीड़े की छवि थी:: GFP धूमकेतु । चोट के बाद 2 घंटे में, एक कटे हुए अक्षतंप दिखाई दे रहा था हालांकि, धूमकेतु एक अघायल अक्षतंवत की तुलना में संख्या में काफी कम हो गए थे । चोट के बाद 11 घंटे में, अक्षतंप ने अक्षीय पुनर्विकास के रूप में पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्राप्त की है जहां बड़ी संख्या में ईबीपी-2:: जीएफपी धूमकेतु(चित्रा 3)मनाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1:EBP धूमकेतु का अवलोकन और विश्लेषण। (क) पीएलएम न्यूरॉन की योजनाबद्ध कृमि शरीर रचना के संबंध में अपनी स्थिति दिखा रहा है । (ख) संदर्भ के बिंदु का चयन न्यूरॉन प्रकार के अनुसार किया जाता है। इस मामले में, पीएलएम न्यूरॉन का सेल शरीर पूर्वकाल या पीछे की प्रक्रियाओं में रुचि के क्षेत्रों के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में कार्य करता है। धूमकेतु (मजेंटा सर्कल) कोशिका शरीर, पूर्वकाल और पीएलएम न्यूरॉन के पीछे की प्रक्रियाओं में punctae के रूप में दिखाई दे रहे हैं। एक खंडित रेखा जो कि एक कामोग्राफ निकालने के लिए ब्याज (पूर्वकाल प्रक्रिया) के न्यूराइट का पता लगाने के लिए तैयार की जाती है। (ग) एक ठेठ आरओआई को एक कायोग्राफ में परिवर्तित किया जा सकता है जो चलती धूमकेतु का प्रतिनिधित्व करने वाले विकर्ण निशान के साथ एक दूरी के समय की छवि है । सेल बॉडी के संबंध में, प्लस-एंड-आउट धूमकेतु सियान में ट्रेस किए जाते हैं जबकि माइनस-एंड-आउट धूमकेतु गुलाबी रंग में ट्रेस किए जाते हैं। स्थानिक संदर्भ के लिए, खंडित आरओआई कच्चे किमोग्राफ के शीर्ष पर दर्शाया जाता है। (घ) माप मापदंडों में ट्रेस की चौड़ाई, ऊंचाई, कोण और लंबाई शामिल है जिसे माइक्रोट्यूबुल मापदंडों में अनुवादित किया जा सकता है । (ङ) विश्लेषण पैरामीटरों को निशानों की चौड़ाई, ऊंचाई और कोण के माप मापदंडों से निकाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2:पीएलएम एक्सॉन में माइक्रोट्यूबल्स की स्थिर-राज्य गतिशीलता। (क) ईबीपी-2 की एक प्रतिनिधि समय श्रृंखला के स्नैपशॉट्स:: पीएलएम न्यूरॉन्स में जीएफपी धूमकेतु ईबीपी-2 में से कुछ दिखा:: जीएफपी धूमकेतु (रंगीन तीर) पीएलएम न्यूरॉन के पूर्वकाल और पीछे की प्रक्रियाओं में । (ख) पूर्वकाल प्रक्रिया में दो क्षेत्रों (आरओआई-ए, और आरओआई-बी) को काइमग्राफ में परिवर्तित किया जाता है जिसमें 2 (ए) में चिह्नित धूमकेतुओं के अनुरूप निशान होते हैं । निशान रंग और संख्या 2 (ए) में चलती धूमकेतु के संबंध में कोडित किया गया है । लोअर ग्राफिक पैनल आंदोलन की उनकी दिशा के आधार पर प्रतिष्ठित देखे गए निशान का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा अंत बाहर धूमकेतु सियान में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि माइनस अंत बाहर धूमकेतु गुलाबी में चिह्नित कर रहे हैं । संदर्भ के लिए, कोशिका शरीर के स्थान को नीचे चित्रित किया गया है। (ग) पीछे की प्रक्रिया में आरओआई-सी को चित्रा 2(ए) में पीछे की प्रक्रिया में चलती धूमकेतु के अनुरूप निशान के साथ काइग्राफ में परिवर्तित कर दिया जाता है । दक्षिणपंथी पैनल नीचे चिह्नित कोशिका शरीर की स्थिति के संबंध में प्लस एंड और माइनस एंड आउट निशान का प्रतिनिधित्व करता है। ध्यान दें कि अक्षीय क्षेत्रों (आरओआई-ए, और आरओआई-बी) में अधिकांश निशान प्लस-एंड-आउट माइक्रोट्यूबल (सियान निशान) का प्रतिनिधित्व करने वाले सेल शरीर से दूर जा रहे हैं। इसके विपरीत, पीछे की प्रक्रिया (आरओआई-सी) में, निशान द्विदिशात्मक हैं जो मिश्रित ध्रुवता का प्रतिनिधित्व करते हैं प्लस (सियान निशान) और माइनस-एंड-आउट (गुलाबी निशान) माइक्रोट्यूबुल्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।  

Figure 3
चित्र 3:पीएलएम न्यूरॉन्स में अक्षुण्ण उत्थान के दौरान माइक्रोट्यूबुल्स।   (क) फेमटोसेकंड लेजर का उपयोग करके एक्सोटॉमी प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। लेजर एक चोट बनाता है जिसके बाद पुनर्विकास की शुरुआत होती है। प्रमुख पुनर्जनन प्रतिक्रियाओं को टाइप 1 फ्यूजन, टाइप 2 फ्यूजन और रेग्रोइंग एक्सॉन के रूप में अर्जित किया जाता है। (ख) पीएलएम न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवियां ईबीपी-2 को व्यक्त करते हुए:: अघायल (0 एच), एक्सोटॉमी (2 एच पोस्ट एक्सोटॉमी) में जीएफपी, और पुनर्विकास की स्थिति (11 एच पोस्ट एक्सोटॉमी)। क्याग्राफ के लिए ट्रेस किए गए आरओआई को छवियों पर चिह्नित किया गया है । (ग) अक्षीय क्षेत्रों के प्रतिनिधि ने अघायल, घायल, पुनर्विकास और टाइप 1 फ्यूज्ड अक्षों पर पता लगाया । ध्यान दें कि ईबीपी-2 की संख्या:: जीएफपी धूमकेतु घायल एक्सॉन में काफी कमी आई है जिसके बाद उनके मजबूत आंदोलन (वृद्धि की लंबाई और अवधि) regrowing अक्षतंपन में। व्यक्तिगत निशान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और उनकी दिशा (सियान और गुलाबी निशान) के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता को समझना पिछले कुछ वर्षों में साइटोस्केलेल अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित किया गया है। माइक्रोट्यूब्यूल्स को नाभिक और तबाही से गुजरना पड़ा और गतिशील अस्थिरता की सतत प्रक्रिया के साथ44,45 ,46,47. इस जानकारी के अधिकांश इन विट्रो परख के माध्यम से प्राप्त किया गया है जैसे प्रकाश बिखरने मुक्त बनाम बहुलक ट्यूबुलिन के readouts, माइक्रोट्यूबुल विकास परख फ्लोरोसेंट ट्यूबबुलिन, आदि से। जबकि फ्लोरोसेंट और गैर-फ्लोरोसेंट माइक्रोट्यूबुल्स का लाइव अवलोकन पतली कोशिकाओं में संभव है, माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के वीवो माप में चुनौतीपूर्ण हैं।

इस ट्रांसजेनिक स्ट्रेन का उपयोग करके, माइक्रोट्यूबुल ओरिएंटेशन के लिए पीवीएम, एएलएम और एवीएम जैसे अन्य स्पर्श न्यूरॉन्स का भी आकलन किया जा सकता है। यहां वर्णित इमेजिंग और विश्लेषण प्रक्रियाओं को सी एलिगेंस में अन्य न्यूरॉन प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें एक उपयुक्त रिपोर्टर ट्रांसजेनिक है, हालांकि, विभिन्न न्यूरॉन्स में धूमकेतु की गतिशीलता में परिवर्तनशीलता49,50,51,52की उम्मीद है। यह विधि सी एलिगेंस53 , 54 , 55,56में गैर - न्यूरोनल सेलप्रकारोंपर भी लागू होती है . एपिडर्मिस या भ्रूण जैसे गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों में, माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता दो आयामों53,54, 55,56में देखी जाती है। ऐसी घटनाओं के लिए, समय श्रृंखला की छवियों को कायनोग्राफ के लिए आरओआई निकालने के लिए जेड-प्रोजेक्शन या स्टैक अंतर छवियों का उपयोग करके एक ही छवि में प्रक्षेपित किया जाता है।

हमने देखा कि लेविमिसोल हाइड्रोक्लोराइड, टेट्रामिसोल जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनेस्थेटिक्स कीड़े के स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त नहीं हैं क्योंकि वे धूमकेतु की गतिशीलता को काफी क्षीण करते हैं। इमेजिंग 57 ,58के दौरान 10% एगरेड पैड पर माइक्रोमोतियां स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त विकल्प हैं। हालांकि, एगर उठे और माइक्रोमोतियों के उच्च प्रतिशत के लिए लंबे समय तक जोखिम कीड़े के लिए शारीरिक तनाव का कारण बन सकता है । इसके अलावा, माइक्रोमोतियों के समाधान को कमरे के तापमान में लाने की सलाह दी जाती है क्योंकि ठंडे झटके से माइक्रोटुबुले डायनेमिक्स59,60 , 61,62,63में बदलाव आ सकता है। एगरल्ड पैड में नमी स्थिरीकरण के लिए एक संवेदनशील कारक है, क्योंकि कीड़े ड्रायर एगर उठे पैड में डिसिकेटेड हो सकते हैं और नम एगरेग्रेशन पैड कीड़े की गतिशीलता को प्रतिबंधित नहीं कर सकते हैं। प्रयोगकर्ता64के बढ़ते होने से पहले चिकनी और समतल सतह के लिए एगरेग्मेंट पैड का नेत्रहीन निरीक्षण कर सकता है । कीड़े से जुड़े बैक्टीरिया को कम करके बढ़ते प्रक्रिया में और सुधार किया जा सकता है। सतह अनुयायी बैक्टीरिया कीड़ा के स्थिरीकरण में बाधा डालते हैं जबकि आंत बैक्टीरिया के परिणामस्वरूप ऑटोफ्लोरेसेंस होता है जो ईबीपी-2 के संकेत को कम कर सकता है:: GFP धूमकेतु। इसलिए हौसले से वरीयता प्राप्त ओपी50 प्लेटों पर कीड़े उगाना और गैर वरीय एनजीएम प्लेटों पर कीड़े डालकर सतह के बैक्टीरिया को हटाना या उन्हें एम9 बफर या सुक्रोज समाधान65,66में फ्लोटिंग से धोना बेहतर है ।

अवलोकन मापदंडों में, स्थानिक और लौकिक तराजू धूमकेतु28का अधिकतम नमूना लेने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ईबीपी-2:: जीएफपी फोटोब्लैचिंग के प्रति संवेदनशील है इस प्रकार प्रकाश के अनावश्यक जोखिम को रोका जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट जांच के साथ लाइव इमेजिंग भी मुक्त कणों के उत्पादन के कारण फोटोटॉक्सिक क्षति का कारण बनता है। यह माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता में बाधा डाल सकता है और कीड़ा के लिए घातक हो सकता है। फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सीसिटी की समस्याओं को दरकिनार करने के लिए कम एक्सपोजर एक्विजिशन सेटअप का इस्तेमाल किया जा सकता है। विश्लेषण पैरामीटर बहुआयामी धूमकेतु आंदोलनों के लिए भी मान्य होंगे, हालांकि, किसी को संदर्भ के बिंदु को सही ढंग से निर्धारित करने की आवश्यकता है।

इस अध्ययन में वर्णित प्रत्येक मॉड्यूल को अन्य संवाददाताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो माइक्रोट्यूबुल्स के माइनस सिरों, एक्सॉन या डेंड्राइट्स आदि के भीतर एक वेसिकुलर ऑर्गेनेल का पता लगाते हैं। इस तकनीक को उपयुक्त ट्रांसजेनेसिस और इमेजिंग सिस्टम के साथ अन्य जीवों या ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है। माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स की जानकारी अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे सेल डिवीजन, सेल माइग्रेशन, सेलुलर आर्किटेक्चर के रखरखाव और अन्य माइक्रोट्यूबुल आधारित प्रक्रियाओं में मान्य है। विभिन्न नैदानिक स्थितियों को माइक्रोट्यूबुले संगठन और गतिशीलता7के साथ जोड़ा गया है, जिसकी सटीक जानकारी औषधीय दृष्टिकोण को मजबूत कर सकती है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम प्रारंभिक समर्थन और अध्ययन में इस्तेमाल तनाव के लिए Yishi जिन और एंड्रयू Chisholm शुक्रिया अदा करते हैं । बैक्टीरियल स्ट्रेन OP50 को अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रमों (P40 OD010440) के एनआईएच कार्यालय द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से व्यावसायिक रूप से लाभ उठाया गया था। हम प्रायोगिक प्रक्रियाओं के मानकीकरण के लिए धर्मेंद्र पुरी को भी धन्यवाद देते हैं। अध्ययन राष्ट्रीय मस्तिष्क अनुसंधान केंद्र के कोर अनुदान द्वारा वित्त पोषित है (जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित, भारत सरकार), डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट इंडिया एलायंस अर्ली करियर ग्रांट (ग्रांट# आईए/ई/18/1/504331) एसडी को, वेलकम ट्रस्ट-डीबीटी इंडिया एलायंस इंटरमीडिएट ग्रांट (ग्रांट# आईए/आई/आई/13/1/500874) को ए.जी.आर और साइंस एंड इंजीनियरिंग रिसर्च बोर्ड (एसईआरबी) से ग्रांट: सीआरजी/2019/002194) से एग-आर

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 177
<em>वीवो में</em> <em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स और ओरिएंटेशन का आकलन
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

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