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Neuroscience

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

Abstract

뉴런에서, microtubule 방향은 일반적으로 혼합 된 방향을 가지고 플러스 엔드 마이크로 투부와 원점축이 축축을 식별하는 주요 평가자되었습니다. 여기서는 C. elegans의 터치 뉴런의 개발 및 재생 중에 마이크로튜블러 역학 및 성장에 라벨, 이미지 및 분석을 하는 방법을 설명합니다. 마이크로 투덜르 팁의 유전적으로 인코딩 된 형광 기자를 사용하여 축축한 마이크로 투벌을 이미지했습니다. 축 절 에 따라 축 축 재생을 시작 하는 microtubule 동작에 로컬 변경 이 프로토콜을 사용 하 여 정량화될 수 있습니다. 이 분석은 다른 뉴런과 유전 적 배경에 적응하여 다양한 세포 프로세스에서 미세 tubule 역학의 조절을 조사할 수 있습니다.

Introduction

뉴런은 수상월리, 세포 몸, 축축및 시냅스와 같은 특수 구획을 갖춘 정교한 아키텍처를 가지고 있습니다. 신경 세포골격은 마이크로투블러, 마이크로필라멘트 및 신경필라멘트 및 그들의 뚜렷한 조직이 구조적이고 기능적으로 신경 구획을 지원하며,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 수년에 걸쳐, microtubule 조직은 신경 극성 및 기능의 중요한 결정요인으로 확인되었습니다. 뉴런이 개발 또는 재생 중에 구조적 리모델링을 거치면서, 마이크로튜블러 역학 및 방향은 다양한 뉴런 구획의 정체성, 편광 된 수송, 성장 및 개발을 결정한다7. 따라서 생체 내에서 마이크로튜블러 역학 및 방향을 평가하여 신경 리모델링 과정과 상관관계를 맺는 것이 필수적입니다.

마이크로투볼은 α 프로토필라멘트로 구성되며, β 튜부린 이종수와 다이내믹 플러스 엔드, 비교적 안정적인 마이너스 종료11,12로구성된다. 플러스 팁 복잡하고 관련 엔드 결합 단백질의 발견은 마이크로 튜블러 조직을 평가하는 플랫폼을가능하게했다(13). 최종 결합 단백질(EBP)은 마이크로튜블러및 이들의 결합 역학의 성장 플러스 엔드와 과도하게 연관되어14,15의마이크로튜블 프로토필라멘트의 성장과 상관된다. 마이크로튜비를 가진 플러스 팁 컴플렉스의 빈번한 연관성 및 해리로 인해, GFP 태그EBP의 포인트 확산 기능은 타임랩스 영화15,16에서"혜성"으로 나타난다. 포유류뉴런(16)에서의 선구적인 관찰 이후, 형광 단백질로 태그된 엔드 결합 단백질은 상이한 모델 시스템 및 뉴런유형(17,18,19,20,21,22, 23)에걸쳐 미세투포역학을 결정하는 데 사용되어 왔다.

단순 신경계와 투명한 신체로 인해 C. elegans는 생체 내에서 개발 및 재생 중에 신경 리모델링을 연구하는 우수한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 여기서는 C. elegans의 터치 뉴런의 개발 및 재생 중에 마이크로튜블러 역학 및 성장에 라벨, 이미지 및 분석을 하는 방법을 설명합니다. 유전적으로 인코딩된 EBP-2:GFP를 사용하여 PLM 뉴런의 마이크로튜블을 이미지화하여 이 뉴런24의두 가지 다른 중성염에서 마이크로투블러의 극성을 확인할 수 있었습니다. 이 방법은 다양한 세포 컨텍스트에서 미세 tubule 역학의 척도로서 EBP 혜성의 관찰 및 정량화를 허용하며, 예를 들어 축절 다음 축축전을 시작하는 미세 투벌 동작의 국소 변화는 우리의 프로토콜을 사용하여 평가될 수 있습니다. 이 분석은 다양한 세포 유형 및 유전 배경에서 다양한 세포 과정에서 미세 tubule 역학의 조절을 조사하기 위해 적응 될 수있다.

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Protocol

1. 리포터 변형: 문화 및 유지 보수

참고: PLM 뉴런에서 마이크로튜블 역학 및 방향을 측정하기 위해, 우리는 EBP-2::GFP를 발현하는 웜 스트레인을 사용하여 터치 뉴런 특이성 프로모터 mec-4(juIs338 allele)18,25,26을사용했다. 우리는이 균주(27)에대한 표준 웜 배양 및 유지 보수 방법을 사용합니다.

  1. 선충 성장 매체(염화 나트륨 3.0g/L, 염화 2.5g/L 펩톤, 20.0 g/L 한천, 10 mg/L 콜레스테롤(10 mg/mL의 스톡 용액에서 희석)를 물과 오토클레이브로 준비한다.
  2. 1m알 칼슘 염화, 1mM 마그네슘 황산염 및 25.0 mM 칼륨 인산염 단일 베이직 pH 6.0으로 보충하기 전에 10-15 분 동안 혼합물을 간략하게 식힙니다.
  3. 멸균 디스펜서를 사용하여 혼합물의 약 9mL를 60mm 페트리 접시에 붓고 실온및 멸균 조건에서 보관하고 4°C에서 후속 보관합니다.
  4. B 브로스 50mL(염화나트륨 5.0g/L, 10.0g/L Bacto-Tryptone), 오토클레이브를 준비한 후 에슈리치아 대장균(OP50 균주)의 단일 콜로니콜로 시동을 식힙니다.
  5. 12 시간 동안 37 °C에서 박테리아를 배양. 냉장 된 NGM 플레이트를 실온으로 가져와 서 식용 유리 스프레더를 사용하여 OP50 박테리아를 NGM 플레이트에 얼룩지게합니다.
  6. 접종된 NGM 플레이트를 12시간 동안 37°C로 유지하여 C. 예레건의배양에 세균잔디가 형성될 수 있다. 이 플레이트는 사용량이 있을 때까지 20°C 인큐베이터에 저장할 수 있습니다.
  7. 시드 NGM 플레이트의 형질 전환 균주를 후방으로 합니다.
  8. 화염에 플래티넘 와이어 픽을 살균하고 새로 시드 플레이트에 전송20-25 중력 성인 hermaphrodites을 선택합니다.
  9. 일단 전송되면 플레이트를 20°C 인큐베이터로 1시간 동안 이동합니다. 그런 다음, 이 접시에서 성인을 추출합니다. 이 접시에는 이제 나이와 일치하는 계란이 들어 있습니다.
  10. 이 경우 계란 누워 후 43.5 시간에서 L4 단계인 개발 단계에 도달 할 때까지 사육을위해 20 °C 인큐베이터로 플레이트를 이동하십시오. 더 많은 웜의 경우 혼잡을 피하기 위해 여러 플레이트를 후면합니다.
  11. 원하는 발달 단계에서, 이 벌레는 EBP-2::GFP 혜성의 화상 진찰을 위해 장착될 수 있습니다.

2. 샘플 준비 : EBP-2 혜성의 이미징을위한 벌레 장착

참고: PLM 뉴런에서 EBP 혜성의 실시간 관찰을 가능하게 하기 위해, 우리는 아가로즈 패드에 벌레를 장착하여 뉴런의 생리학을 손상시키지 않으면서 이동성을 최소화했습니다. 다양한 고정 방법 중, 우리는 쉽게 시판 할 수있는 0.1 μm 폴리스티렌 비드 솔루션을 선택했다. EBP-2::GFP 관찰에 특별히 사용되는 장착 절차를 설명했습니다.

  1. 1x M9 완충제(0.02 M KH2PO4,0.02 M Na2HPO4,0.008 M NaCl, 0.02 M NH4Cl)의2mL에서 아가로즈 0.2g을 연동하여 10% 아가로즈의 용액을 화염 위에 5mL 유리 테스트 튜브로 준비한다. 이 테스트 튜브는 사용전까지 용융 상태에서 아가로즈를 유지하는 가열 블록에 쉽게 들어갈 수 있습니다.
  2. 입이 넓은 드롭퍼를 사용하여 35mm x 25mm 치수의 깨끗한 유리 슬라이드 위에 이 용융 아가로즈의 드롭(약 100 μL)을 분배합니다.
  3. 용융 상태에 있는 동안 다른 유리 슬라이드로 드롭을 눌러 유리 슬라이드 사이에 아가로즈의 얇은 필름을 만듭니다. 아가로즈는 약 30초 만에 두께가 약 0.5~1.0mm인 필름으로 고화됩니다.
  4. 아가로즈가 고화되면, 지배적이지 않은 손에 바닥 슬라이드와 상단 슬라이드를 지배적 인 손에 잡습니다. 아가로즈 패드가 두 슬라이드 중 하나에 달라 붙은 결과로 하단 슬라이드를 안정적으로 유지하면서 상단 슬라이드를 뒤집습니다.
  5. 형성된 아가로즈 패드가 커버슬립 크기(18mm x 18mm)보다 크면 패드 가장자리를 트리밍하여 필요한 치수를 확보하여 커버슬립을 적절히 배치합니다. 이 아가로즈 패드는 즉시 사용할 수 있으며 저장되지 않습니다.
  6. 아가로즈 패드를 육안으로 검사하여 촉촉하고 장착에 적합한 매끄러운 표면을 검사합니다. 아가로즈 패드가 공기에 노출되어 건조되면 아가로즈 패드의 표면이 구겨진 것처럼 보입니다. 이러한 시나리오에서 이 섹션의 2-6 단계에서 언급한 대로 신선한 아가로즈 패드를 준비합니다.
  7. 아가로즈 패드에 0.1 μm 폴리스티렌 비드 용액의 2 μL을 장착 매체로 넣습니다.
  8. 플래티넘 와이어 픽을 사용하여 3-4 웜을 선택하고 시드되지 않은 NGM 플레이트로 이동합니다. 이 프로세스는 장착 하는 동안 고정을 방해 하는 표면 박테리아의 제거를 보장 합니다.
  9. 벌레가 표면 박테리아에서 기어 나오면 백금 와이어 픽을 사용하여 장착을 위해 집어 들고 아가로즈 패드의 폴리스티렌 구슬 한 방울에서 다시 놓습니다.
  10. 조심스럽게, 웜에 18mm x 18mm 커버슬립을 놓습니다. 장착 된 웜의 evisceration을 방지하기 위해 배치 후 커버 슬립을 이동하지 마십시오.
  11. 이미징을 위해 현미경에 준비된 슬라이드를 마운트합니다.

3. 이미징 설정 및 인수

참고: EBP 혜성은 C. elegans16,18의포유류 및 PLM 뉴런에서 관찰된 것과 같이 0.22 μm/s의 대략적인 속도와 함께 여행한다. 나이퀴스트기준(28)에따라 시간 경과 획득으로 이벤트를 최적으로 샘플링하려면 각각 0.09 μm 및 0.43s의 공간 및 측두형 스케일이 요구된다. 광독성 이나 광표백의 예방을 위해, 우리는 스피닝 디스크 인수를 사용. 우리는 아래의 이미징 설정 및 획득 설정을 설명했습니다.

  1. 회전 디스크 장치와 카메라가 장착된 반전된 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 제조업체의 지시에 따라 설정을 켭니다.
  2. 설정을 제어하는 소프트웨어를 켭니다.
  3. 이것은 반전 된 현미경이기 때문에 커버 슬립이 아래로 향하는 낮은 배율 목표 (5 배 또는 10 배)로 무대에 장착 된 웜이있는 슬라이드를 놓습니다.
  4. 반사된 빛을 위해 송신된 빛과 수은 아크 램프를 위해 할로겐 램프의 조명을 사용하는 눈 또는 눈에 보이는 모드로 가는 광 경로를 설정합니다.
  5. 밝은 필드 아래의 뷰 필드에 웜을 집중하고 중심을 이시합니다.
  6. 침지 오일을 넣고 배율을 63배(1.4NA/오일)로 변경하고 PLM 뉴런의 밝은 필드에 웜 테일에 다시 초점을 맞춥니다.
  7. PLM 뉴런의 짧은 재초점을 위해 수은 아크 램프의 형광을 켭니다. GFP의 시각화를 위해 올바른 반사판(AF488) 세트를 라이트 패스에 배치합니다.
  8. 카메라에 광 경로를 지시하여 카메라 획득에 현미경을 설정합니다.
    참고: 현미경의 박막 트랜지스터(TFT) 화면을 통해 상기 단계 4-7을 제어하는 것은 빠르며 조명에 불필요한 노출을 방지합니다. 또는 소프트웨어를 통해 조명, 반사경을 제어합니다.
  9. 뷰 필드에서 PLM 뉴런의 초점 후, 소프트웨어 인터페이스에서 전자 곱글링(EM)을 가진 카메라에 대한 30% 출력과 300ms 노출로 488nm 레이저의 조명을 선택한다(EM) 게인 값 70. 리포터 식에 따라 필요에 따라 이러한 매개 변수가 다릅니다. 설정을 후속 이미징 세션의 구성으로 저장합니다.
  10. 채널 탭은 트랙마다 특정 조명 및 카메라 설정으로 저장합니다. 강조 표시된 트랙은 라이브 시각화를 허용하는 반면 이미지를 획득하려면 트랙을 선택해야합니다. 작업 공간에서 웜의 꼬리를 실시간으로 시각화할 수 있는 밝은 필드(DIC)가 있는 채널을 강조 표시합니다. 샘플은 작업 공간의 라이브 이미징 창에 초점을 맞추고 중심을 두고 있습니다.
  11. 라이브 이미징 창에서 PLM 뉴런을 빠르게 집중하기 위해 488 nm 레이저 여기로 채널을 강조하십시오. 일단 초점을 맞춘 다음 단계에서 언급한 대로 타임시리즈 매개 변수를 설정하여 시간 경과 획득을 시작합니다.
  12. 488nm 레이저 조명을 사용하여 2분 동안 타임시리즈로 실험을 설정하고 프레임 간 시간 간격을 설정합니다. 이미지 수집의 시간적 규모를 유지하기 위해 GFP 형광만 획득했습니다.
  13. 실험 시작 탭을 사용하여 인수를 시작합니다. 63x 배율을 사용하면 공간 해상도를 0.21 μm로 제한하며, 이는 카메라의 픽셀 크기인 0.09 μm이다. 이벤트를 최적으로 샘플링하기 위해 3.3 프레임/s에서 시간 경과를 획득합니다. 타임랩스 이미지는 2분 동안 396개의 시간 프레임을 획득했습니다. 수집 후 이미지를 기본 형식으로 저장하며 나중에 기본 소프트웨어 또는 ImageJ에서 액세스할 수 있습니다.

4. 관찰 및 분석

  1. 기본 소프트웨어에서 타임랩스 획득을 미리 보거나 Bioformats 플러그인을 통해 이미지 J에서 엽니다.
    참고: 이미지 J에서 이미지 분석 프로세스를 설명했습니다.
  2. Bioformats 플러그인 ImageJ를 설치합니다.
    1. 또는 ImageJ의 파일 호환성을 위해 기본 형식 파일을 .tif 내보냅니다. ZEN2에서 내보내기 함수는 이미지의 개별 프레임을 분리된 .tif 파일로 생성합니다. 우리는 많은 수의 파일의 형성을 방지하기 위해이 방법을 피합니다.
  3. '바이오포맷' 플러그인을 통해 이미지 J에서 직접 '.czi' 형식으로 이미지를 엽니다. 이미지가 다중 이미지 스택으로 열립니다. 기본 소프트웨어의 '내보내기' 기능을 사용하는 경우 ImageJ: ImageJ 프로그램 > 이미지 메뉴 > 스택 이미지 > 스택에 이미지를 사용하여 이미지를 다중 이미지 스택으로 재구성합니다.
  4. 이미지 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 재생 아이콘을 사용하여 이미지를 동영상으로 미리 봅타입니다. 혜성은 세포 체및 PLM 뉴런의 프로세스에서 밝은 모바일 펑크로 볼 수 있습니다. 혜성이 선명하게 보이는 경우 8단계로 진행하여 이 섹션의 5-7단계를 수행합니다.
  5. 조회 테이블(LUT)을 사용하여 이미지의 색상 프로파일을 회색 크기 이미지로 변환합니다: ImageJ 프로그램 > 이미지 메뉴 > 조회 테이블 하위 메뉴 > 선택 회색을 선택합니다.
  6. 쉬운 시각화를 위해 이미지의 LUT 프로파일을 반전 : 이미지 J 프로그램 > 이미지 메뉴 > 조회 테이블 하위 메뉴 > 반전 LUT.
  7. 혜성을 볼 수 있는 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다: ImageJ 프로그램 > 이미지 메뉴 > 밝기/대비 를 > 조정합니다.
    1. 이미지 전체의 강도의 원하는 배율에 대해 최소, 최대, 밝기 및 대비 슬라이더를 이동합니다. 우리는 혜성이 뚜렷하게 보이는 이미지를 정량화했습니다.
  8. ImageJ의 기본 버전에는 아이콘으로 표현되는 시작 도구가 있습니다. 드롭다운 메뉴를 열고 세그먼트된 선을 선택하려면 선을 사용하여 아이콘을 찾아 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 뉴런의 세포 본문에 또는 그 기원을 가진 관심 영역(ROI)에 분할된 선을 그립니다.
    1. 이후 고려 사항은 다음과 같은 워크플로를 사용하여 ROI 관리자를 통해 분할 된 라인 ROI를 저장합니다: ImageJ > 이미지에서 그려진 추적을 선택하고 ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하기 > > 도구 분석 > ROI 관리자 를 클릭하고 ROI 관리자 창 >에서 더 많이 저장>.
  9. kymograph를 생성하기 전에, 공간 및 측두형 비늘이 다르므로 다음을 사용하여 픽셀로 측정을 얻기 위해 스케일링을 제거합니다.
    ImageJ > > 설정 배율 > 클릭하여 눈금 > 확인을 제거합니다.
  10. 이미지 > 스택 드롭다운 메뉴 아래에 있는 리슬라이스 함수를 사용하여 kymograph를 생성합니다. 키모그래프는 세분화된 ROI를 제 시간에 표현합니다. 가로 축은 거리를 나타내고 세로 축은 시간을 나타냅니다. 대각선 흔적은 움직이는 혜성을 나타냅니다. 일반적으로, 키모그래프는 대각선 추적의 시각화를 위해 앞단계 5-6에 설명된 바와 같이 이미지의 색상 프로파일을 달리 할당한다.
  11. 선 도구의 드롭다운 메뉴에서 직선 함수를 사용하여(이 섹션의 9단계를 참조)은 각 대각선 추적에 직선을 그려 ROI 관리자에 추가합니다.
  12. 분석 탭에서 측정 값 설정으로 이동하여 추적을 측정하기 위한 평균 강도 및 경계 사각형 매개변수를 선택합니다.
  13. ROI 관리자 창에서 ROI의 평균 강도, 선 추적의 X 및 Y 좌표, 너비, 높이, 각도 및 선 추적의 길이의 평균 강도를 산출하는 결과 창을 여는 측정값을 클릭합니다. 이 창은 .csv 형식으로 저장하고 나중에 데이터 분석 프로그램으로 가져올 수 있습니다.
  14. 스프레드시트 프로그램에서 는 행과 열에 분포된 값으로 결과 창이 열립니다. 관련 값은 추적의 너비, 높이 및 각도입니다. 너비는 추적의 변위를 제공하고 높이는 지속 시간을 제공하고 각도는 벡터를 나타냅니다. 너비와 높이 값이 픽셀에 있기 때문에 표준 측정 가능한 매개 변수를 얻기 위해 각각 공간 및 측두형 비늘을 곱합니다.
  15. 키모그래프의 좌측은 세포체에 근위가 있기 때문에, 각도에 따라 혜성을 플러스 엔드아웃 또는 마이너스-엔드아웃(즉, 세포 체에서 또는 세포 체쪽으로 각각)으로 분류한다. 각도를 각각 1°~-89°와 -91°에서 -179°로 분류합니다. 연구를 위해 스프레드시트에 여러 kymographs의 데이터를 대조하고 통계적으로 나타냅니다.

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Representative Results

대표적인 예로, 우리는 PLM 뉴런의 정상 상태 및 재생 축록에서 EBP 혜성의 생체 관측에 설명했다. PLM 뉴런은 시냅스와 짧은 후방 과정을 형성하는 긴 전방 과정을 가진 웜의 꼬리 영역에 위치하고 있습니다. PLM 뉴런은 표피에 가까운 전방 후방 방향으로 성장하고 벌레의 부드러운 터치 감각에 대한 책임이 있습니다. 그들의 단순화된 구조, 및 화상 진찰 및 미세 수술에 대한 편의성으로 인해 PLM 뉴런은 마이크로튜블러 세포골격29,축축운송30,31,재생19,32,뉴런 극성24,33,34,행동 및 노화35,36에 대해 광범위하게조사되었습니다.  그리고 많은 다른 신경 과정. 우리는 MEC-4 프로모터의 밑에 EBP-2::GFP를 표현하는 형질전환에서 생체내 마이크로tubule 역학 및 방향을 평가하기 위하여 PLM 뉴런을 이용했습니다.

마이크로투블러의 정상 상태 역학을 확인하기 위해 Pmec-4-EBP-2::GFP 리포터를 표현하는 웜을 골랐습니다. 벌레는 10% 아가로즈 패드에 0.1 μm 폴리스티렌 구슬에 장착되었다. 커버슬립이 부드럽게 추가되었고, 벌레는 회전디스크 현미경으로 이미지되었다. PLM 뉴런은 63x에 중점을 두고 초당 3.3프레임의 프레임 속도로 이미지화되었습니다. PLM의 전방 과정은 후면 과정이 혜성의 양방향 움직임을 보인 반면, 세포체로부터 멀리 이동하는 혜성의 대다수를보였다(도 1). 혜성의 방향에 따라 PLM의 전방 공정에는 단극성 플러스 엔드 아웃 마이크로투알이 포함되어 있으며 후방 공정은 마이크로투블러(그림2)24의극성(플러스 및 마이너스-엔드아웃)을 혼합한 다름(플러스 및 마이너스-엔드아웃)을 가지고 있다.

분석법의 적용으로, 우리는 PLM 뉴런의 재생 축축에서 마이크로 튜블러 역학 및 방향을 탐구했다. 이전 연구는 UV, 나노 초, 피코초, 및 펨토초레이저31,37,39,40,41,42, 43을포함한 다양한 유형의 레이저를 사용하여 레이저 중재 축 절제술방법을확립했다. 이 연구를 위해, 우리는 PLM뉴런43의전방 과정을 끊기 위해 펨토초 레이저를 사용했다. 부상 후, 벌레는 시드 NGM 플레이트에 복구되었다. 웜은 EBP-2::GFP 혜성의 관찰을 위해 부상 후 여러 시간 지점에서 이미지되었다. 부상 후 2 시간에서, 절단 된 축축이 보였지만, 혜성은 부상하지 않은 축록소에 비해 크게 감소했다. 부상 후 11h에서 축축은 많은 수의 EBP-2::GFP 혜성이 관찰된 축산 재성장의 형태로 재생 반응을 유도하였다(그림3).

Figure 1
그림 1: EBP 혜성의 관찰 및 분석. (A) PLM 뉴런의 회로도는 벌레 해부학에 대하여 그것의 위치를 보여주는. (b) 기준점은 뉴런 유형에 따라 선택된다. 이 경우 PLM 뉴런의 세포 본체는 전방 또는 후방 프로세스에 대한 관심 영역에 대한 기준점역할을 한다. 혜성 (마젠타 원)은 PLM 뉴런의 세포 몸, 전방 및 후방 과정에서 펑크로 볼 수 있습니다. 관심의 중성염을 추적하는 분할 된 라인 (전방 과정)은 kymograph를 추출하기 위해 그려집니다. (C) 일반적인 ROI는 움직이는 혜성을 나타내는 대각선 흔적을 가진 거리 시간 이미지인 kymograph로 변환될 수 있다. 세포 본체에 관하여, 플러스 엔드 아웃 혜성은 시안에서 추적되는 반면 마이너스 엔드 아웃 혜성은 분홍색으로 추적됩니다. 공간 참조의 경우, 분할된 ROI는 원시 키모그래프 위에 표시됩니다. (D) 측정 매개 변수에는 미세 투덜한 매개 변수로 변환할 수 있는 추적의 너비, 높이, 각도 및 길이가 포함됩니다. (E) 해석 매개변수는 추적의 폭, 높이 및 각도의 측정 매개 변수에서 추출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

Figure 2
그림 2: PLM 축축에서 마이크로튜블의 정상 상태 역학. (A) PlM 뉴런의 전방 및 후방 프로세스에서 EBP-2::GFP 혜성의 일부를 보여주는 PLM 뉴런의 대표적인 타임 시리즈의 스냅샷. (B) 전방 공정(ROI-A 및 ROI-B)의 두 영역은 혜성에 해당하는 흔적이 2(A)로 표시된 키모그래프로 변환된다. 흔적은 2(A)의 움직이는 혜성과 관련하여 색상과 번호가 코딩되었습니다. 낮은 그래픽 패널은 이동 방향에 따라 구별되는 관찰된 흔적을 나타냅니다. 게다가 끝 혜성은 시안으로 표시되어 있지만 마이너스 끝 혜성은 분홍색으로 표시됩니다. 참고로 셀 본문의 위치는 하단에 표시됩니다. (C) 후방 과정에서 ROI-C는 도 2(A)에서 후방 과정에서 이동 혜성에 해당하는 흔적을 가진 키모그래프로 변환된다. 가장 오른쪽 패널은 하단에 표시된 셀 바디의 위치와 관련하여 플러스 엔드 및 마이너스 종료 흔적을 나타냅니다. 축 전지(ROI-A 및 ROI-B)의 대부분의 흔적이 세포 체에서 벗어나 플러스 엔드아웃 마이크로투블러(시안 흔적)를 나타내는 것으로 나타났다. 반대로, 후방 공정(ROI-C)에서, 추적은 플러스(시안 흔적) 및 마이너스 엔드아웃(분홍색 흔적) 마이크로튜비와 혼합된 극성을 나타내는 양방향이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  

Figure 3
그림 3: PLM 뉴런에서 축축재생 중 마이크로투부.   (A) 펨토초 레이저를 이용한 축절 절차의 회로도 표현. 레이저는 재성장의 개시 뒤에 상해를 만듭니다. 주요 재생 반응은 타입-1 융합, 타입-2 융합 및 재성장 축축으로 점수가 매겨지습니다. (B) EBP-2:GFP를 발현하는 PLM 뉴런의 대표적인 이미지(0h), 축축화(2h 포스트 축축약), 재성장 조건(11h 포스트 축절). kymographs에 대 한 추적 된 ROI 는 이미지에 표시 되었습니다. (C) 축삭 부위의 대표 키모그래프는 부상, 부상, 재성장 및 유형 1이 융합된 축삭을 추적했습니다. EBP-2::GFP 혜성의 수는 부상당한 축절에서 크게 감소했으며, 그 다음으로 재성장축에서 강력한 움직임(성장 길이 및 지속 시간 증가)이 뒤따랐다. 개별 추적은 정량화되고 방향(시안 및 분홍색 흔적)에 따라 분류될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

미세 tubule 역학을 이해하는 것은 수년에 걸쳐 사이토스켈레탈 연구 분야에서 중요한 초점이었습니다. 마이크로튜블러는44,45,46,47의연속적인 과정과 함께 핵형성 및재앙을겪는다. 이러한 정보의 대부분은 무료 대 중합관, 형광 튜룰린 등의 마이크로투룰 성장 아스약과 같은 체외 내 삽을 통해얻어졌다. 형광 및 비 형광 마이크로 투벌의 라이브 관찰은 얇은 세포에서 가능하지만, 마이크로 튜블러 역학의 생체 측정은 도전적이다.

이 형질전환 균주를 사용하여 PVM, ALM 및 AVM과 같은 다른 터치 뉴런도 마이크로튜블러 방향을 평가할 수 있습니다. 여기서 설명된 이미징 및 분석 절차는 적절한 리포터 트랜스제닉을 가진 C. elegans의 다른 뉴런 유형에 적응될 수 있지만, 다른 뉴런을 가로지르는 혜성 역학의 가변성은49,50,51,52로예상된다. 이 방법은 또한 C. elegans53,54,55,56에서비 신경 세포 유형에 적용된다. 표피 또는 배아와 같은 비신경 세포 유형에서, 마이크로튜블러 역학은 2차원53,54,55,56로관찰된다. 이러한 이벤트의 경우, 타임 시리즈의 이미지는 z 프로젝션 또는 스택 차이 이미지를 사용하여 단일 이미지로 투사되어 kymographs의 ROI를 추출합니다.

우리는 레바미솔 염산염과 같은 상업적으로 이용 가능한 마취제, 테트라미솔이 혜성 역학을 과감시키는 웜의 고정에 적합하지 않다는 것을 관찰했습니다. 10% 아가로즈 패드에 마이크로비드는 이미징57,58동안 고정에 적합한 선택이다. 그러나, 아가로즈와 마이크로비드의 더 높은 비율에 더 이상 노출은 벌레에 물리적 인 스트레스로 이어질 수 있습니다. 또한, 차가운 충격이 마이크로튜블러역학(59,60,61,62, 62,63)의변화로 이어질 수 있으므로 장착하기 전에 미생물용액을 실온으로 가져오는 것이 바람직하다. 아가로즈 패드의 수분은 웜이 건조기 아가로즈 패드와 습한 아가로즈 패드에서 건조될 수 있으므로 웜의 이동성을 제한하지 않을 수 있으므로 고정을 위한 민감한 요소입니다. 실험자는64를장착하기 전에 아가로즈 패드를 시각적으로 검사하여 매끄럽고 수평된 표면을 검사할 수 있습니다. 장착 절차는 웜과 관련된 박테리아를 감소시킴으로써 더욱 개선 될 수있다. 표면 부착 박테리아는 벌레의 고정을 방해하는 반면 장내 박테리아는 EBP-2::GFP 혜성의 신호를 가리게 할 수 있는 자동 불발성귀로 귀어집니다. 따라서 갓 시드된 OP50 플레이트에서 벌레를 성장시키고 벌레를 시드없는 NGM 플레이트에 넣거나 자당 용액65,66에서M9 버퍼 또는 부유물로 세척하여 표면 박테리아를 제거하는 것이 바람직하다.

관측 파라미터 중, 공간 및 측두형 스케일은혜성(28)을최적으로 샘플링하는 데 매우 중요하다. EBP-2::GFP는 광표백에 민감하므로 빛에 불필요한 노출을 방지해야 합니다. 형광 프로브와 라이브 이미징또한 자유 래 디 칼의 생산으로 인해 광독성 손상을 일으킬. 이것은 microtubule 역학을 방해할 수 있고 벌레에 치명적일 지도 모릅니다. 낮은 노출 획득 설정은 광표백 및 광독성문제를 회피하는 데 사용될 수 있습니다. 분석 매개 변수는 다차원 혜성 이동에도 유효하지만 참조 점을 올바르게 결정해야 합니다.

이 연구에 설명된 각 모듈은 마이크로투블러의 마이너스 끝, 축축또는 수선제 내의 소포 세포기관을 감지하는 다른 리포터에게 적응할 수 있다. 이 기술은 또한 적당한 전과 및 화상 진찰 시스템을 가진 그밖 유기체 또는 조직에 적용될 수 있습니다. 마이크로튜피 역학의 정보는 세포 분열, 세포 이동, 세포 아키텍처 유지 관리 및 기타 마이크로투룰 기반 프로세스와 같은 다른 세포 프로세스에서 유효합니다. 다양한 임상 조건은 마이크로튜블러 조직 및 역학7과관련이 있으며, 정확한 정보는 약리학적 접근을 강화할 수 있다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이시진과 앤드류 치스홀름에게 초기 지원과 연구에 사용된 균주에 감사드립니다. 세균균 균주 OP50은 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)에 의해 투자 된 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 상업적으로 이용되었습니다. 우리는 또한 실험 절차의 표준화에 대한 Dharmendra Puri감사합니다. 이 연구는 국립 뇌 연구 센터 (생명 공학부, 인도 정부의 지원), DBT / 웰컴 트러스트 인디아 얼라이언스 초기 경력 보조금 (그랜트 # IA / E / 18/1/504331)에서 S.D., Wellcome Trust-DBT 인도 얼라이언스 중간 보조금 (그랜트 # IA / I/13/1/500874)의 핵심 보조금에 의해 지원됩니다. CRG/2019/002194)에서 A.G.-R까지

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

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신경과학 문제 177
<em>생체 내</em> <em>Caenorhabditis elegans</em> 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

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