Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

Abstract

Dans les neurones, l’orientation des microtubules a été un évaluateur clé pour identifier les axones qui ont des microtubules à extrémité plus et des dendrites qui ont généralement une orientation mixte. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. À l’aide de rapporteurs fluorescents génétiquement codés des pointes de microtubules, nous avons imagé les microtubules axonaux. Les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole. Ce test est adaptable à d’autres neurones et arrière-plans génétiques pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires.

Introduction

Les neurones ont une architecture élaborée avec des compartiments spécialisés comme les dendrites, les corps cellulaires, les axones et les synapses. Le cytosquelette neuronal est constitué des microtubules, microfilaments et neurofilaments et leur organisation distincte soutient structurellement et fonctionnellement les compartiments neuronaux1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Au fil des ans, l’organisation des microtubules a été identifiée comme un déterminant clé de la polarité et de la fonction neuronales. Au fur et à mesure que les neurones subissent un remodelage structurel au cours du développement ou de la régénération, la dynamique et l’orientation des microtubules déterminent l’identité, le transport polarisé, la croissance et le développement de divers compartiments neuronaux7. Il est donc impératif d’évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules in vivo pour établir une corrélation avec le processus de remodelage neuronal.

Les microtubules sont composés de protofilaments de α et d’hétérodimères de β de tubuline avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités moins relativement stables11,12. La découverte du complexe plus tip et des protéines de liaison aux extrémités associées a permis à une plateforme d’évaluer l’organisation des microtubules13. Les protéines de liaison finale (EBP) s’associent transitoirement aux extrémités plus en croissance du microtubule et leur dynamique d’association sont corrélées à la croissance des protofilaments du microtubule14,15. En raison de l’association et de la dissociation fréquentes du complexe de pointe plus avec le microtubule, la fonction d’étalement ponctuel de l’EBP marqué GFP apparaît comme une « comète » dans un film timelapse15,16. Depuis l’observation pionnière dans les neurones des mammifères16,les protéines de liaison d’extrémité marquées avec des protéines fluorescentes ont été utilisées pour déterminer la dynamique des microtubules à travers différents systèmes modèles et types de neurones17,18 , 19,20,21,22,23.

En raison de son système nerveux simple et de son corps transparent, C. elegans s’est avéré être un excellent système modèle pour étudier le remodelage neuronal pendant le développement et la régénération in vivo. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. En utilisant EBP-2::GFP génétiquement codé, nous avons imagé les microtubules dans le neurone PLM, ce qui nous a permis de déterminer la polarité des microtubules dans deux neurites différents de ce neurone24. Cette méthode permet l’observation et la quantification des comètes EBP comme mesure de la dynamique des microtubules dans différents contextes cellulaires, par exemple, les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être évalués à l’aide de notre protocole. Ce test peut être adapté pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires dans divers types de cellules et de milieux génétiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Souche du rapporteur : Culture et entretien

REMARQUE: Pour mesurer la dynamique et l’orientation des microtubules dans les neurones PLM, nous avons utilisé la souche de ver exprimant EBP-2::GFP sous le promoteur spécifique du neurone tactile mec-4 (allèlejuIs338) 18,25,26. Nous utilisons des méthodes standard de culture et d’entretien des vers pour cette souche27.

  1. Préparer le milieu de croissance des nématodes (3,0 g/L de chlorure de sodium, 2,5 g/L de peptone, 20,0 g/L de gélose, 10 mg/L de cholestérol (dilué à partir d’une solution stock de 10 mg/mL)) dans de l’eau et autoclaver le mélange.
  2. Refroidir brièvement le mélange pendant 10-15 min avant de le compléter avec 1 mM de chlorure de calcium, 1 mM de sulfate de magnésium et 25,0 mM de phosphate de potassium pH monobasique 6,0.
  3. Verser environ 9 mL du mélange dans des boîtes de Petri de 60 mm à l’aide d’un distributeur stérile, puis entreposage à température ambiante et dans des conditions stériles pendant une journée et stockage ultérieur à 4 °C.
  4. Préparer 50 mL de bouillon B (5,0 g/L de chlorure de sodium, 10,0 g/L de bacto-tryptone), l’autoclave et le refroidir avant d’inoculer avec une seule colonie d’Escherichia coli (souche OP50).
  5. Culturez la bactérie à 37 °C pendant 12 heures. Amenez les plaques de NGM réfrigérées à température ambiante pour l’ensemencement et à l’aide d’un épandeur de verre stérilisé, faites un frottis de bactéries OP50 sur la plaque de NGM.
  6. Conserver les plaques de NGM inoculées à 37 °C pendant 12 heures, ce qui permettra la formation d’une pelouse bactérienne pour la culture de C. elegans. Ces plaques peuvent être stockées dans un incubateur à 20 °C jusqu’à utilisation.
  7. Élever la souche transgénique sur les plaques de NGM ensemencées.
  8. Stérilisez un pic en fil de platine sur flamme et cueillez 20 à 25 hermaphrodites adultes gravides à transférer dans une assiette fraîchement ensemencée.
  9. Une fois transférée, déplacez la plaque dans un incubateur à 20 °C pendant 1 h. Ensuite, extrayez les adultes de ces plaques. Ces plaques contiendront maintenant des œufs qui correspondent à l’âge.
  10. Déplacez les plaques vers l’incubateur à 20 °C pour l’élevage jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de développement d’intérêt qui, dans ce cas, est le stade L4 à 43,5 heures après la ponte. Pour plus de vers, reculez plusieurs plaques pour éviter l’encombrement.
  11. Au stade de développement souhaité, ces vers peuvent être montés pour l’imagerie des comètes EBP-2::GFP.

2. Préparation de l’échantillon : Montage de vers pour l’imagerie des comètes EBP-2

REMARQUE: Pour permettre l’observation en direct des comètes EBP dans les neurones PLM, nous avons monté les vers sur des coussinets d’agarose pour minimiser leur mobilité sans compromettre la physiologie du neurone. Parmi les différentes méthodes d’immobilisation, nous avons choisi une solution de billes de polystyrène de 0,1 μm facilement disponible dans le commerce. Nous avons décrit la procédure de montage utilisée spécifiquement pour l’observation EBP-2::GFP.

  1. Préparer une solution d’agarose à 10 % en faisant fondre 0,2 g d’agarose dans 2 mL de tampon 1x M9 (0,02 M KH2PO4,0,02 M Na2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) dans un tube à essai en verre de 5 mL sur une flamme. Ce tube à essai peut facilement s’insérer dans un bloc chauffant qui maintient l’agarose à l’état fondu jusqu’à son utilisation.
  2. À l’aide d’un compte-gouttes à large bouche, distribuer une goutte (environ 100 μL) de cette agarose fondue sur une lame de verre propre de dimensions de 35 mm x 25 mm.
  3. Pendant qu’il est à l’état fondu, appuyez sur la goutte avec une autre lame de verre pour créer un mince film de l’agarose entre les lames de verre. L’agarose se solidifie sous la forme d’un film d’environ 0,5 à 1,0 mm d’épaisseur en environ 30 secondes.
  4. Une fois que l’agarose se solidifie, tenez la glissière inférieure dans la main non dominante et la glissière supérieure dans la main dominante. Retournez la glissière supérieure tout en maintenant la glissière inférieure stable, ce qui fait que le coussinet d’agarose adhère à l’une des deux glissières.
  5. Si le tampon d’agarose formé est plus grand que la taille du couvercle (18 mm x 18 mm), coupez les bords du tampon pour obtenir les dimensions requises afin d’assurer un placement correct du couvercle. Ces tampons d’agarose sont destinés à une utilisation immédiate et ne doivent pas être stockés.
  6. Inspectez visuellement le tampon d’agarose pour obtenir une surface lisse, humide et adaptée au montage. Si le tampon d’agarose est exposé à l’air et se dessèche, la surface du tampon d’agarose semble ridée. Dans un tel scénario, préparez un tampon d’agarose frais comme mentionné aux étapes 2 à 6 de cette section.
  7. Sur le tampon d’agarose, mettre 2 μL de solution de billes de polystyrène de 0,1 μm comme support de montage.
  8. Choisissez 3-4 vers à l’aide d’un pic à fil de platine et déplacez-les sur une plaque NGM non enseinée. Ce processus assure l’élimination des bactéries de surface qui entravent l’immobilisation pendant le montage.
  9. Une fois que les vers sortent de leurs bactéries de surface, ramassez-les pour les monter à l’aide d’un pic à fil de platine et ressuspendez-les dans la goutte de perles de polystyrène sur le tampon d’agarose.
  10. Placez soigneusement un couvercle de 18 mm x 18 mm sur les vers. Pour éviter l’éviscération des vers montés, ne déplacez pas le couvercle après le placement.
  11. Montez la lame préparée sur le microscope pour l’imagerie.

3. Configuration et acquisition d’imagerie

REMARQUE: Les comètes EBP voyagent avec une vitesse approximative de 0,22 μm / s observée dans les neurones mammifères et PLM de C. elegans16,18. Pour échantillonner de manière optimale les événements dans une acquisition en accéléré selon les critères de Nyquist28,des échelles spatiales et temporelles de 0,09 μm et 0,43 s, respectivement, sont nécessaires. Pour la prévention de la phototoxicité ou du photobleaching, nous avons utilisé l’acquisition Spinning Disk. Nous avons décrit nos paramètres de configuration et d’acquisition d’imagerie ci-dessous.

  1. Capturez les images à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une unité de disque rotatif et d’une caméra. Activez la configuration conformément aux instructions du fabricant.
  2. Activez le logiciel qui contrôle la configuration.
  3. Comme il s’agit d’un microscope inversé, placez la lame avec les vers montés sur la scène avec un objectif de faible grossissement (5x ou 10x) avec le couvercle tourné vers le bas.
  4. Configurez le chemin de la lumière vers le mode œil ou visible qui utilise l’éclairage de la lampe halogène pour la lumière transmise et de la lampe à arc au mercure pour la lumière réfléchie.
  5. Focalisation et centrer un ver dans le champ de vue sous le champ lumineux.
  6. Mettez l’huile d’immersion et changez le grossissement à 63x (1,4NA / huile) et recentrez la queue du ver dans le champ lumineux pour les neurones PLM.
  7. Allumez la fluorescence de la lampe à arc au mercure pour un bref recentrage des neurones PLM. Placez le bon jeu de réflecteurs (AF488) dans le chemin de la lumière pour la visualisation de GFP.
  8. Réglez le microscope sur l’acquisition de la caméra en dirigeant le chemin de la lumière vers la caméra.
    REMARQUE: Le contrôle des étapes 4 à 7 mentionnées ci-dessus via l’écran À transistor à couche mince (TFT) du microscope est rapide et empêche une exposition inutile à l’éclairage. Alternativement, contrôlez l’éclairage, le réflecteur via le logiciel.
  9. Après la mise au point du neurone PLM dans le champ de vision, sélectionnez dans l’interface logicielle l’éclairage du laser 488 nm avec une puissance de 30% et une exposition de 300 ms pour la caméra avec la valeur de gain de multiplication d’électrons (EM) 70. Selon l’expression du rapporteur, variez ces paramètres selon vos besoins. Stockez les paramètres en tant que configuration pour les sessions d’imagerie suivantes.
  10. L’onglet Canaux stocke les pistes avec chacune un éclairage et un réglage de caméra spécifiques. La piste en surbrillance permet une visualisation en direct alors que pour acquérir une image, la piste doit être cochée. Mettez en surbrillance un canal avec un champ lumineux (DIC) pour une visualisation en direct de la queue du ver dans l’espace de travail. L’échantillon est focalé et centré dans la fenêtre d’imagerie en direct de l’espace de travail.
  11. Mettez en surbrillance le canal avec une excitation laser de 488 nm pour une mise au point rapide du neurone PLM dans la fenêtre d’imagerie en direct. Une fois la mise au point, commencez l’acquisition en accéléré en définissant les paramètres de la série chronologique comme mentionné à l’étape suivante.
  12. En utilisant l’éclairage laser 488 nm, configurez une expérience avec des séries chronologiques de 2 minutes et aucun intervalle de temps entre les images. Pour maintenir les échelles temporelles de l’acquisition d’images, nous n’avons acquis que la fluorescence GFP uniquement.
  13. À l’aide de l’onglet Démarrer l’expérience, commencez l’acquisition. L’utilisation d’un grossissement de 63x limite la résolution spatiale à 0,21 μm qui est échantillonnée par la caméra à la taille de pixel de 0,09 μm. Acquérez un laps de temps à 3,3 images/s pour échantillonner l’événement de manière optimale. L’image en accéléré avait 396 périodes acquises sur une durée de 2 min. Après l’acquisition, enregistrez l’image dans le format par défaut, auquel le logiciel par défaut ou ImageJ peut accéder ultérieurement.

4. Observation et analyse

  1. Prévisualisez l’acquisition timelapse dans le logiciel par défaut ou ouvrez-la dans Image J via son plug-in Bioformats.
    REMARQUE: Nous avons décrit le processus d’analyse d’image dans l’image J.
  2. Installez le plug-in Bioformats dans ImageJ.
    1. Vous pouvez également exporter le fichier de format par défaut dans .tif pour la compatibilité des fichiers dans ImageJ. La fonction d’exportation dans ZEN2 permet d’afficher des images individuelles de l’image sous forme de fichiers .tif discrets. Nous évitons cette méthode pour éviter la formation d’un grand nombre de fichiers.
  3. Ouvrez l’image au format '.czi' directement dans Image J via son plugin 'Bioformats'. L’image s’ouvre sous la forme d’une pile multi-images. Si vous utilisez la fonction « export » du logiciel par défaut, reconstituez les images en tant que pile multi-images à l’aide du flux de travail suivant dans ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
  4. Prévisualisez l’image en tant que film à l’aide de l’icône Lecture dans le coin inférieur gauche de la fenêtre d’image. Les comètes peuvent être considérées comme des ponctuations mobiles brillantes dans le corps cellulaire et les processus du neurone PLM. Si les comètes sont clairement visibles, passez à l’étape 8 sinon suivez les étapes 5 à 7 de cette section.
  5. Convertissez le profil colorimétrique de l’image à l’aide de la table de choix (LUT) en une image en niveaux de gris : programme ImageJ > menu Image > sous-menu Tables de choix > Sélectionner les gris.
  6. Inverser le profil LUT de l’image pour une visualisation facile : le programme ImageJ > menu Image > sous-menu Tables de choix > Inverser LUT.
  7. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour voir les comètes : programme ImageJ > menu Image > Ajuster le sous-menu > Luminosité/Contraste.
    1. Déplacez les curseurs Minimum, Maximum, Luminosité et Contraste pour la mise à l’échelle souhaitée des intensités sur l’image. Nous avons quantifié les images avec des comètes visibles distinctement.
  8. La version de base d’ImageJ comporte des outils de démarrage représentés sous forme d’icônes. Recherchez et cliquez avec le bouton droit sur l’icône avec une ligne pour ouvrir un menu déroulant et sélectionnez la ligne segmentée. Tracez la ligne segmentée sur les régions d’intérêt (ROI) avec son origine sur ou près du corps cellulaire du neurone.
    1. Pour des considérations ultérieures, enregistrez le retour sur investissement de la ligne segmentée via le gestionnaire de retour sur investissement à l’aide du flux de travail suivant : ImageJ > Analyser les outils > > gestionnaire de retour sur investissement > Sélectionnez la trace dessinée dans l’image et cliquez sur Ajouter dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement > Plus dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement > Enregistrer.
  9. Avant de générer le kymographe, comme les échelles spatiale et temporelle sont différentes, retirez la mise à l’échelle pour obtenir les mesures en pixels en utilisant les éléments suivants :
    ImageJ > Analyser > Définir l’échelle > Cliquez pour supprimer l’échelle > Ok.
  10. À l’aide de la fonction Reslice (Reslice) du menu déroulant Image > Stacks (Piles d’images), générez un kymographe. Le kymographe est une représentation du ROI segmenté dans le temps. L’axe horizontal représente la distance et l’axe vertical représente le temps. Les traces diagonales représentent les comètes en mouvement. Généralement, le kymographe prend le profil de couleur de l’image sinon attribuer un profil de couleur comme décrit dans les étapes précédentes 5-6 pour la visualisation des traces diagonales.
  11. À l’aide de la fonction Ligne droite du menu déroulant de l’outil Ligne (reportez-vous à l’étape 9 de cette section), tracez des lignes droites sur chacune des traces diagonales et ajoutez-les dans le gestionnaire de retour sur investissement.
  12. Sous l’onglet Analyser, accédez à Définir les mesures et sélectionnez Intensité moyenne et Paramètres rectangle englobant pour mesurer les traces.
  13. Dans la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Mesure qui ouvrira une fenêtre de résultats qui donnera l’intensité moyenne du retour sur investissement, les coordonnées X et Y des traces de ligne, la largeur, la hauteur, l’angle et la longueur des traces de ligne. Cette fenêtre peut être enregistrée au format .csv et importée ultérieurement dans un programme d’analyse de données.
  14. Dans le tableur, la fenêtre de résultats s’ouvre avec les valeurs distribuées en lignes et en colonnes. Les valeurs pertinentes sont la largeur, la hauteur et l’angle des traces. La largeur donne le déplacement de la trace, la hauteur donne la durée et l’angle représente le vecteur. Comme les valeurs de largeur et de hauteur sont en pixels, multipliez-les avec les échelles spatiale et temporelle, respectivement, pour obtenir les paramètres mesurables standard.
  15. Comme le côté gauche du kymographe est proximal au corps cellulaire, selon l’angle, classez les comètes en extrémité plus ou moins (c’est-à-dire loin du corps cellulaire ou vers le corps cellulaire, respectivement). Classez les angles entre 1° à -89° et -91° à -179° comme plus-end-out et minus-end-out, respectivement. Rassemblez les données de plusieurs kymographes dans une feuille de calcul pour une étude et représentez statistiquement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

À titre d’exemple représentatif, nous avons décrit l’observation in vivo des comètes EBP à l’état d’équilibre et des axones régénérants des neurones PLM. Les neurones PLM sont situés dans la région de la queue du ver avec un long processus antérieur qui forme une synapse et un court processus postérieur. Les neurones PLM se développent dans la direction antérieure-postérieure près de l’épiderme et sont responsables de la sensation de toucher doux chez les vers. En raison de leur structure simplifiée et de leur aptitude à l’imagerie et à la microchirurgie, les neurones PLM ont été largement étudiés pour leur cytosquelette de microtubules29,leur transport axonal30,31et leur régénération19,32,leur polarité neuronale24,33,34,leur comportement et leur vieillissement35,36  et de nombreux autres processus neuronaux. Nous avons utilisé des neurones PLM pour évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules in vivo dans un EBP-2::GFP exprimant transgéniquement sous le promoteur mec-4.

Pour vérifier la dynamique à l’état d’équilibre des microtubules, nous avons choisi les vers exprimant le rapporteur Pmec-4-EBP-2::GFP. Les vers ont été montés dans des billes de polystyrène de 0,1 μm sur des tampons d’agarose à 10%. Le couvercle a été ajouté doucement et les vers ont été imagés sur le microscope à disque en rotation. Les neurones PLM ont été centrés et focalis sur 63x et imagés avec une fréquence d’images de 3,3 images par seconde. Le processus antérieur du PLM a montré une majorité des comètes s’éloignant du corps cellulaire tandis que le processus postérieur a montré un mouvement bidirectionnel des comètes(Figure 1). Sur la base de la direction des comètes, le processus antérieur du PLM contient des microtubules unipolaires à extrémité plus, tandis que le processus postérieur a une polarité mixte (plus et moins) de microtubules(Figure 2)24.

En tant qu’application du test, nous avons exploré la dynamique et l’orientation des microtubules dans les axones régénérants des neurones PLM. Des études antérieures ont établi des méthodes d’axotomie à médiation laser en utilisant divers types de lasers, notamment les lasers UV, nanoseconde, picoseconde et femtoseconde31,37, 38,39,40,41,42,43. Pour cette étude, nous avons utilisé un laser femtoseconde pour couper le processus antérieur des neurones PLM43. Après la blessure, les vers ont été récupérés sur des plaques NGM ensemencées. Les vers ont ensuite été imagés à plusieurs moments après la blessure pour l’observation des comètes EBP-2::GFP. 2 h après la blessure, un axone sectionné était visible, mais le nombre de comètes a été considérablement réduit par rapport à un axone non blessé. 11 h après la blessure, les axones ont provoqué une réponse de régénération sous forme de repousse axonale où un grand nombre de comètes EBP-2::GFP ont été observées (Figure 3).

Figure 1
Figure 1: Observation et analyse des comètes EBP. (A) Schéma du neurone PLM montrant sa position par rapport à l’anatomie du ver. (B) Le point de référence est sélectionné en fonction du type de neurone. Dans ce cas, le corps cellulaire du neurone PLM sert de point de référence pour les régions d’intérêt dans les processus antérieurs ou postérieurs. Les comètes (cercles magenta) sont visibles sous forme de ponctuations dans le corps cellulaire, les processus antérieurs et postérieurs du neurone PLM. Une ligne segmentée traçant le neurite d’intérêt (processus antérieur) est tracée pour extraire un kymographe. (C) Un retour sur investissement typique peut être converti en kymographe qui est une image distance-temps avec des traces diagonales représentant les comètes en mouvement. En ce qui concerne le corps cellulaire, les comètes à extrémité plus sont tracées en cyan tandis que les comètes à extrémité moins sont tracées en rose. Pour référence spatiale, le retour sur investissement segmenté est représenté au-dessus du kymographe brut. (D) Les paramètres de mesure comprennent la largeur, la hauteur, l’angle et la longueur de la trace qui peuvent être traduits en paramètres de microtubules. (E) Les paramètres d’analyse sont extraits des paramètres de mesure de la largeur, de la hauteur et de l’angle des traces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2: Dynamique à l’état d’équilibre des microtubules dans l’axone PLM. (A) Instantanés d’une série chronologique représentative de comètes EBP-2::GFP dans les neurones PLM montrant certaines des comètes EBP-2::GFP (flèches colorées) dans les processus antérieur et postérieur du neurone PLM. (B) Deux régions du processus antérieur (ROI-A et ROI-B) sont converties en kymographes dans lesquels les traces correspondant aux comètes marquées en 2(A). Les traces ont été codées en couleur et en nombre par rapport aux comètes en mouvement dans 2(A). Le panneau graphique inférieur représente les traces observées distinguées en fonction de leur direction du mouvement. Les comètes d’extrémité plus sont marquées en cyan tandis que les comètes à extrémité moins sont marquées en rose. Pour référence, l’emplacement du corps de la cellule est représenté en bas. (C) Le ROI-C dans le processus postérieur est converti en kymographes avec des traces correspondant aux comètes en mouvement dans le processus postérieur dans la figure 2(A). Le panneau le plus à droite représente les traces d’extrémité plus et moins par rapport à la position du corps de cellule marqué en bas. Notez que la plupart des traces dans les régions axonales (ROI-A et ROI-B) s’éloignent du corps cellulaire représentant des microtubules à extrémité plus (traces cyan). Au contraire, dans le processus postérieur (ROI-C), les traces sont bidirectionnelles représentant la polarité mixte avec des microtubules plus (traces cyan) et moins-end-out (traces roses). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.  

Figure 3
Figure 3: Microtubules lors de la régénération axonale dans les neurones PLM.   (A) Représentation schématique de la procédure d’axotomie à l’aide d’un laser femtoseconde. Le laser crée une blessure suivie de l’initiation de la repousse. Les principales réponses de régénération sont notées comme fusion de type 1, fusion de type 2 et axones de repousse. (B) Images représentatives de neurones PLM exprimant EBP-2::GFP dans les conditions non blessées (0 h), axotomisées (2 h après axotomie) et de repousse (11 h après axotomie). Le roi tracé pour les kymographes a été marqué sur les images. (C) Kymographes représentatifs des régions axonales tracés sur les axones non blessés, blessés, en repousse et fusionnés de type 1. Notez que le nombre de comètes EBP-2::GFP a considérablement diminué dans les axones blessés, suivi de leur mouvement robuste (augmentation de la longueur et de la durée de croissance) dans l’axone en repousse. Les traces individuelles peuvent être quantifiées et classées selon leur direction (traces cyan et rose). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La compréhension de la dynamique des microtubules a été un objectif clé dans le domaine de la recherche sur le cytosquelette au fil des ans. Les microtubules subissent une nucléation et une catastrophe ainsi qu’un processus continu d’instabilité dynamique44,45,46,47. Une grande partie de cette information a été obtenue par des essais in vitro tels que des lectures de diffusion de la lumière de la tubuline libre vs polymérisée, des tests de croissance de microtubules à partir de tubuline fluorescente, etc.48. Bien que l’observation en direct de microtubules fluorescents et non fluorescents soit possible dans des cellules minces, les mesures in vivo de la dynamique des microtubules sont difficiles.

En utilisant cette souche transgénique, d’autres neurones tactiles comme PVM, ALM et AVM peuvent également être évalués pour l’orientation des microtubules. Les procédures d’imagerie et d’analyse décrites ici peuvent être adaptées à d’autres types de neurones chez C. elegans avec un rapporteur transgénique approprié, cependant, la variabilité de la dynamique de la comète entre différents neurones est attendue49,50,51,52. Cette méthode est également applicable aux types de cellules non neuronales chez C. elegans53,54,55,56. Dans les types de cellules non neuronales comme l’épiderme ou l’embryon, la dynamique des microtubules est observée en deux dimensions53,54,55,56. Pour de tels événements, les images de la série chronologique sont projetées en une seule image à l’aide d’images de projection Z ou de différence stack pour extraire le retour sur investissement des kymographes.

Nous avons observé que les anesthésiques disponibles dans le commerce comme le chlorhydrate de lévamisole, le tétramisole ne conviennent pas à l’immobilisation des vers car ils atténuent considérablement la dynamique des comètes. Les microbilles sur les coussinets d’agarose à 10% sont un choix approprié pour l’immobilisation pendant l’imagerie57,58. Cependant, une exposition plus longue à un pourcentage plus élevé d’agarose et de microbilles peut entraîner un stress physique pour les vers. En outre, il est conseillé d’amener la solution de microbilles à température ambiante avant le montage car un choc froid peut entraîner un changement dans la dynamique des microtubules59,60,61,62,63. L’humidité dans les coussinets d’agarose est un facteur sensible à l’immobilisation, car les vers peuvent être desséchés dans les coussinets d’agarose plus secs et les coussinets d’agarose humides peuvent ne pas restreindre la mobilité des vers. L’expérimentateur peut inspecter visuellement le tampon d’agarose pour une surface lisse et nivelée avant de monter64. La procédure de montage peut encore être améliorée en réduisant les bactéries associées aux vers. Les bactéries adhérentes de surface entravent l’immobilisation du ver tandis que les bactéries intestinales entraînent une autofluorescence qui peut obstruer le signal des comètes EBP-2::GFP. Il est donc préférable de faire pousser les vers sur des plaques OP50 fraîchement ensemencées et d’éliminer les bactéries de surface en plaçant les vers sur des plaques NGM non ensemencées ou en les lavant avec un tampon M9 ou une flottaison dans une solution de saccharose65,66.

Parmi les paramètres d’observation, les échelles spatiales et temporelles sont essentielles pour échantillonner de manière optimale les comètes28. EBP-2::GFP est sensible au photobleaching, il convient donc d’éviter une exposition inutile à la lumière. L’imagerie en direct avec des sondes fluorescentes provoque également des dommages phototoxiques dus à la production de radicaux libres. Cela pourrait entraver la dynamique des microtubules et être fatal au ver. Une configuration d’acquisition à faible exposition peut être utilisée pour contourner les problèmes de photobleaching et de phototoxicité. Les paramètres d’analyse seront également valables pour les mouvements multidimensionnels des comètes, mais il faut déterminer correctement le point de référence.

Chacun des modules décrits dans cette étude peut être adapté à d’autres rapporteurs qui détectent les extrémités négatives des microtubules, un organite vésiculeux dans l’axone ou les dendrites, etc. Cette technique peut également être appliquée à d’autres organismes ou tissus avec un système de transgenèse et d’imagerie approprié. L’information sur la dynamique des microtubules est valide dans d’autres processus cellulaires tels que la division cellulaire, la migration cellulaire, le maintien de l’architecture cellulaire et d’autres processus à base de microtubules. Diverses conditions cliniques ont été associées à l’organisation et à la dynamique des microtubules7,dont des informations précises peuvent renforcer les approches pharmacologiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions Yishi Jin et Andrew Chisholm pour le soutien initial et la souche utilisée dans l’étude. La souche bactérienne OP50 a été utilisée commercialement par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous remercions également Dharmendra Puri pour la standardisation des procédures expérimentales. L’étude est financée par la subvention de base du National Brain Research Centre (soutenu par le Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Subvention # IA / E / 18/1/504331) à S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Subvention # IA / I / 13/1/500874) à A.G.-R et une subvention du Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) à A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Neurosciences numéro 177
<em>In vivo</em> Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans <em>les neurones de Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter