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Neuroscience

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。

Abstract

ニューロンでは、微小管配向は、一般的に配向が混在するプラスエンドアウト微小管と樹状突起を有する軸索を同定するための重要な査定者であった。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。微小管先端の遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いて、軸索微小管を画像化した。このプロトコルを使用して、奇数に続いて軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化を定量化することができる。このアッセイは、様々な細胞プロセスにおける微小管ダイナミクスの調節を調査するために、他のニューロンおよび遺伝的背景に適応可能である。

Introduction

ニューロンは、樹状突起、細胞体、軸索、シナプスなどの特殊なコンパートメントを備えた精巧なアーキテクチャを持っています。ニューロン細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、および神経フィラメントと、その明確な組織が、神経区画を構造的および機能的に支持する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .長年にわたり、微小管組織は、神経極性および機能の重要な決定要因として同定されてきた。ニューロンが開発中または再生中に構造リモデリングを受けるにつれて、微小管のダイナミクスと配向は、様々なニューロンコンパートメントのアイデンティティ、偏光輸送、成長、および発達を決定する。したがって、ニューロンリモデリングプロセスと相関させるために、生体内での微小管ダイナミクスおよび向きを評価することが不可欠である。

微小管は、αおよびβのtubulinヘテロ二量体の原始フィラメントで構成され、動的なプラスエンドと比較的安定したマイナス末端11,12を有する。プラス先端複合体および関連するエンド結合タンパク質の発見により、プラットフォームは微小管組織13を評価することができました。エンド結合タンパク質(EBP)は、微小管の成長プラス末端と一過性に関連付け、それらの関連ダイナミクスは、微小管原線維14、15の成長と相関している。微小管とのプラス先端複合体の頻繁な関連付けと解離のために、GFPタグ付きEBPの点広がり関数は、タイムラプスムービー15,16において「彗星」として現れる。哺乳類ニューロン16における先駆的な観察以来、蛍光タンパク質でタグ付けされた末端結合タンパク質は、異なるモデル系およびニューロンタイプ17、18、19、20、21、22、23の間で微小管ダイナミクスを決定するために使用されてきた。

その単純な神経系と透明な体のために 、C.エレガンス は 、開発中および生体内の再生中にニューロンのリモデリングを研究するための優れたモデルシステムであることが証明されています。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。遺伝的にコード化されたEBP-2:::GFPを用いて、PLMニューロン内の微小管を画像化し、このニューロン24の2つの異なる神経突起中の微小管の極性を決定することができた。この方法は、異なる細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスの尺度としてEBP彗星の観察および定量化を可能にする、例えば、奇方解術後に軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化は、我々のプロトコルを用いて評価することができる。このアッセイは、多様な細胞タイプおよび遺伝的背景における様々な細胞プロセスにおける微小管動力学の調節を調べることができる。

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Protocol

1. レポーター株:文化とメンテナンス

注:PLMニューロンの微小管のダイナミクスと向きを測定するために、我々はEBP-2を発現するワーム株を使用しました::GFPはタッチニューロン特異的プロモーター mec-4(juIs338アレーレ)18、25、26の下で。私たちは、この株27のための標準的なワームの培養とメンテナンス方法を使用しています。

  1. ネマトード成長培地(3.0 g/L塩化ナトリウム、2.5 g/Lペプトン、20.0 g/L寒天、10mg/Lコレステロール(10mg/mLのストック溶液から希釈)を水に調製し、混合物をオートクレーブします。
  2. 1 mM塩化カルシウム、1 mM硫酸マグネシウム、25.0 mMリン酸カリウム単塩基pH 6.0で補う前に、混合物を10〜15分間短時間冷却します。
  3. 滅菌ディスペンサーを使用して60mmペトリ皿に約9 mLの混合物を注ぎ、その後室温で保存し、1日の無菌条件で保存し、その後4°Cで貯蔵します。
  4. 50 mLのBブロス(5.0 g/L塩化ナトリウム、10.0 g/L Bacto-トリプトン)を準備し、オートクレーブと冷却してから 、大腸菌 の単一コロニー(OP50株)で接種します。
  5. 37°Cで12時間培養する。冷蔵されたNGMプレートを室温にして播種し、殺菌ガラススプレッダーを使用してOP50バクテリアのスミアをNGMプレートにします。
  6. 接種したNGMプレートを37°Cで12時間保ち 、C.エレガンスの培養のための細菌の芝生を形成することができます。これらのプレートは、使用されるまで20°Cインキュベーターに保存することができます。
  7. 播種されたNGMプレート上のトランスジェニック歪みを後に付けます。
  8. 炎にプラチナワイヤーピックを殺菌し、新しく播種されたプレートに転送するための20-25グラビッド大人の雌雄同体を選びます。
  9. 一度移した後、プレートを20°Cインキュベーターに1時間シフトします。次いで、これらのプレートから成人を抽出する。これらのプレートには、年齢に一致する卵が含まれるようになりました。
  10. プレートを20°Cインキュベーターに移して、飼育する際に、産卵後43.5時間でL4ステージが目的の発達段階に達するまで飼育します。より多くのワームのために、混雑を避けるために複数のプレートを後部。
  11. 望ましい発達段階では、これらのワームはEBP-2::GFP彗星のイメージングのためにマウントすることができる。

2. サンプル調製:EBP-2彗星のイメージング用ワームの取り付け

注:PLMニューロンのEBP彗星のライブ観察を可能にするために、我々はニューロンの生理学を損なうことなく、その移動性を最小限に抑えるためにアガロースパッドにワームを取り付けた。様々な固定化方法の中で、市販のポリスチレンビーズ溶液を0.1μm選択しました。EBP-2::GFP観測に用いられる取り付け手順について概説しました。

  1. 1x M9バッファー(0.02 M KH2PO 4、0.02 M Na2HPO4、0.008M NaCl、0.02 M NH4Cl)を炎上で5mLのガラス試験管で2mLで0.2gのアガロースを溶融して、10%アガロースの溶液を調製します。この試験管は使用まで溶融状態でアガロースを保つ加熱ブロックに容易に合うことができる。
  2. 広口ドロッパーを使用して、35 mm x 25 mmの寸法のきれいなガラススライドの上にこの溶融アガロースの滴(約100 μL)を分配する。
  3. 溶融状態の間、別のガラススライドでドロップを押して、ガラススライドの間にアガロースの薄膜を作成します。アガロースは、約30秒で厚さ約0.5〜1.0mmの膜として固化する。
  4. アガロースが固まったら、下のスライドを非支配的な手で、上のスライドを支配的な手で保持します。アガロースパッドが2つのスライドのいずれかにくっつい結果として、下のスライドを安定したまま上のスライドを反転させます。
  5. 形成されたアガロースパッドがカバースリップサイズ(18 mm x 18 mm)よりも大きい場合は、パッドの端をトリムして、カバースリップの適切な配置を確実にする必要な寸法を得ます。これらのアガロースパッドは、即時使用のためであり、保存されません。
  6. 湿った、取り付けに適した滑らかな表面のためにアガロースパッドを視覚的に検査します。アガロースパッドが空気にさらされて乾燥すると、アガロースパッドの表面がしわに見えます。このようなシナリオでは、このセクションの手順 2 ~ 6 で説明したように、新鮮なアガロース パッドを準備します。
  7. アガロースパッドに、0.1 μmポリスチレンビーズ溶液を取り付け媒体として2μLにします。
  8. プラチナワイヤーピックを使用して3〜4ワームを選び、シードされていないNGMプレートに移します。このプロセスは、取り付け時に固定化を妨げる表面細菌の除去を保証します。
  9. ワームが表面細菌から這い出したら、白金ワイヤーピックを使用して取り付けるためにそれらを拾い、アガロースパッド上のポリスチレンビーズのドロップでそれらを再中断します。
  10. 慎重に、ワームの上に18ミリメートル×18ミリメートルのカバースリップを置きます。マウントされたワームの回避を防ぐために、配置後にカバースリップを移動しないでください。
  11. 準備したスライドを顕微鏡に取り付けてイメージングします。

3. イメージングの設定と取得

注:EBP彗星は、C.エレガンス16、18の哺乳類およびPLMニューロンで観察された0.22 μm/sの概速度で移動します。ナイキスト基準28に従ってタイムラプス取得でイベントを最適にサンプリングするには、それぞれ0.09 μmと0.43sの空間的スケールと時間スケールが必要です。光毒性や光の消光を防止するために、スピニングディスクの取得を使用しました。イメージングの設定と取得の設定については、以下で説明します。

  1. 回転するディスクユニットとカメラを搭載した反転顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。製造元の指示に従ってセットアップをオンにします。
  2. セットアップを制御するソフトウェアをオンにします。
  3. これは逆の顕微鏡であるため、カバースリップを下に向けて低倍率の目的(5xまたは10倍)でステージ上に取り付けられたワームとスライドを置きます。
  4. 透過光用のハロゲンランプからの照明と、反射光用の水銀アーク灯を用いた目や可視モードへの光路を設定します。
  5. 明視野の下のビューフィールドにワームを集中して中央に配置します。
  6. 浸漬油を入れて、63倍(1.4NA/オイル)に倍率を変更し、PLMニューロンの明視野でワームテールを再び焦点を合わせます。
  7. PLMニューロンの短時間の再焦点を合わせるための水銀アークランプの蛍光をオンにします。GFP の可視化のためにライト パスに正しい反射器(AF488)のセットを置きます。
  8. カメラに光路を向けて、カメラの取得に顕微鏡を設定します。
    注:顕微鏡の薄膜トランジスタ(TFT)スクリーンを介して上記のステップ4-7を制御することは速く、照明への不必要な露出を防ぐ。あるいは、ソフトウェアを介して照明、反射器を制御する。
  9. ビューフィールドでPLMニューロンの焦点を合わせた後、ソフトウェアインターフェースで、電子乗算(EM)ゲイン値70でカメラの30%のパワーと300 ms露光を有する488 nmレーザーの照明を選択します。レポーターの式に応じて、必要に応じてこれらのパラメータを変更します。設定を後続のイメージング セッションの構成として保存します。
  10. [ チャンネル ]タブには、特定の照明とカメラ設定を含むトラックがそれぞれ保存されます。ハイライト表示されたトラックではライブビジュアライゼーションが可能ですが、画像を取得するにはトラックをチェックする必要があります。ワークスペース内のワームの尾部をライブで視覚化するために、明視野(DIC)でチャネルをハイライト表示します。サンプルは、ワークスペースのライブイメージングウィンドウに焦点を合わせ、中央に配置します。
  11. 488 nmレーザー励起でチャンネルをハイライトし、ライブイメージングウィンドウでPLMニューロンを素早く焦点を合わせます。フォーカスが設定されたら、次のステップで説明したように時系列パラメータを設定して、タイムラプス取得を開始します。
  12. 488 nmレーザー照明を使用して、2分間の時系列で、フレーム間の時間間隔を設けずに実験を行います。画像取得の時間スケールを維持するために、我々は唯一のGFP蛍光を獲得しました。
  13. [実験の開始] タブを使用して、取得を開始します。63倍の倍率を使用すると、空間解像度が0.09 μmのピクセルサイズでカメラでサンプリングされる0.21 μmに制限されます。3.3 フレーム/s でタイムラプスを取得し、イベントを最適にサンプリングします。タイムラプス画像は、2分の期間にわたって取得された396の時間枠を持っていました。取得後、デフォルトのフォーマットでイメージを保存し、後でデフォルトのソフトウェアまたは ImageJ でアクセスできます。

4. 観察・分析

  1. デフォルトのソフトウェアでタイムラプス取得をプレビューするか、Bioformats プラグインを使用してイメージ J で開きます。
    注: 画像解析のプロセスについては、イメージ J で説明しました。
  2. ImageJ にバイオフォーマット プラグインをインストールします。
    1. または、ImageJ でのファイル互換性のために、デフォルトのフォーマット ファイルを .tif にエクスポートします。ZEN2でエクスポート機能を使用すると、イメージの個々のフレームが個別の.tifファイルとして出力されます。大量のファイルの生成を防ぐため、この方法は避けます。
  3. '.czi' 形式の画像を'Bioformats' プラグインを使用してイメージ J で直接開きます。イメージがマルチイメージ スタックとして開きます。デフォルトソフトウェアの「エクスポート」機能を使用する場合は、ImageJで次のワークフローを使用してイメージをマルチイメージスタックとして再構成します: ImageJプログラム>イメージメニュー>スタックサブメニュー>スタックにイメージをスタックします。
  4. イメージ ウィンドウの左下隅にある 再生 アイコンを使用して、イメージをムービーとしてプレビューします。彗星は、細胞体およびPLMニューロンのプロセスにおける明るい移動性パンクテエと見なすことができる。彗星がはっきりと見える場合は、手順 8 に進み、このセクションの手順 5 ~ 7 に進みます。
  5. ルックアップ テーブル (LUT) を使用してイメージのカラー プロファイルをグレースケール イメージに変換します: ImageJ プログラム > イメージ メニュー>参照テーブルサブメニュー> [グレーを選択]を選択します。
  6. イメージの LUT プロファイルを反転して簡単に視覚化する: ImageJ プログラム > イメージ メニュー>参照テーブル サブメニュー> LUT を反転します。
  7. 彗星を見るための画像の明るさとコントラストを調整する :ImageJプログラム>画像メニュー>[明るさ/コントラスト>調整]サブメニューを調整します。
    1. イメージ全体で希望する強度のスケーリングのために 、[最小]、[最大値]、[明るさ]、 および [コントラスト] のスライダを移動します。彗星がはっきりと見える画像を定量化しました。
  8. ImageJ の基本バージョンには、スタートアップ ツールがアイコンで表されています。線のあるアイコンを見つけて右クリックし、ドロップダウンメニューを開き、 セグメント線を選択します。ニューロンの細胞体上またはその近くに原点を持つ対象領域(ROI)上にセグメント化線を描画します。
    1. 後で考慮する場合は、次のワークフローを使用して、ROI マネージャを介してセグメント線の ROI を保存します > > > > > >。
  9. キモグラフを生成する前に、空間的スケールと時間スケールが異なるようにスケーリングを削除し、次の値を使用してピクセル単位で測定値を取得します。
    ImageJ >分析>スケールを設定> クリックしてスケールを削除>OK。
  10. [イメージ>スタック] ドロップダウンメニューの下にある再スライス機能を使用して、カイモグラフを生成します。キモグラフは、セグメント化されたROIを時間で表したものです。横軸は距離を表し、縦軸は時間を表します。斜めのトレースは、移動する彗星を表します。一般的に、キモグラフは、対角線トレースの視覚化のために前の手順 5 から 6 で説明したように、画像のカラープロファイルを使用します。
  11. 線ツールのドロップダウンメニューの 直線 関数(このセクションのステップ9を参照)を使用して、対角線の各トレースの上に直線を描き、ROIマネージャに追加します。
  12. [ 解析 ]タブで、[ 測定の設定] に移動し、トレースを測定するための 平均強度 と 外接矩形 パラメータを選択します。
  13. ROI マネージャ ウィンドウで[ メジャー] をクリックすると、[結果]ウィンドウが開き、ROI の平均強度、ライン トレースの X 座標と Y 座標、線のトレースの幅、高さ、角度、長さが表示されます。このウィンドウは、.csv形式で保存し、後でデータ分析プログラムにインポートすることができます。
  14. スプレッドシート プログラムでは、結果ウィンドウが開き、値が行と列に分散されます。関連する値は、トレースの幅、高さ、角度です。幅はトレースの変位を与え、高さは持続時間を与え、角度はベクトルを表します。幅と高さの値はピクセル単位で表され、空間的スケールと時間スケールをそれぞれ乗算して、標準の測定可能なパラメーターを取得します。
  15. キモグラフの左側は細胞体に近いため、角度に応じて彗星をプラスエンドアウトまたはマイナスエンドアウト(すなわち、細胞体から離れた、または細胞体に向かって)に分類する。1°~-89°~-91°~-179°の角度をプラスエンドアウトとマイナスエンドアウトとしてそれぞれ分類します。複数のカイモグラフのデータを、1 つのスプレッドシートで照合して、調査用に統計的に表現します。

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Representative Results

代表的な例として、PLMニューロンの定常状態および再生軸索におけるEBP彗星のインビボ観察について説明した。PLMニューロンは、シナプスと短い後工程を形成する長い前工程を有するワームの尾領域に位置する。PLMニューロンは表皮に近い前部後方向に成長し、ワームの穏やかな接触感覚を担う。PLMニューロンは、その構造が単純化され、イメージングとマイクロサージャリーに対する無分別性のために、微小管細胞骨格29、軸索輸送30、31、および再生19、32、神経極性24、33、34、挙動および老化35、36について広範囲に調査されてきた。 そして他の多くの神経プロセス。PLMニューロンを用いて、mec-4プロモーター下でのトランスジェニック発現EBP-2::GFPにおける生体内微小管ダイナミクスおよびオリエンテーションを評価しました。

微小管の定常ダイナミクスを確認するために、Pmec-4-EBP-2::GFPレポーターを表現するワームを選びました。ワームは、10%アガロースパッドに0.1 μmポリスチレンビーズを取り付けた。カバースリップを穏やかに加え、スピニングディスク顕微鏡でワームを画像化した。PLMニューロンは中心に置き、63xに焦点を当て、毎秒3.3フレームのフレームレートで画像化された。PLMの前工程では、彗星の大部分が細胞体から離れて移動し、後工程は彗星の双方向運動を示した(図1)。彗星の方向に基づいて、PLMの前工程には、後部プロセスが微小管の極性(プラスおよびマイナス終了)を有する一方で、PLMの前工程には、単極プラスエンドアウト微小管が含まれる(図2)24。

アッセイの応用として、PLMニューロンの再生軸索における微小管ダイナミクスと向きを調べる。これまでの研究では、UV、ナノ秒、ピコ秒、フェムト秒レーザー31、37、38、39、40、41、42、43を含む様々なタイプのレーザーを用いたレーザーメディカトームの方法を確立している。この研究では、フェムト秒レーザーを用い、PLMニューロン43の前工程を切断した。負傷後、ワームは播種されたNGMプレートに回収された。その後、EBP-2::GFP彗星の観察のために、損傷後の複数の時点でワームを画像化した。負傷後2時間で、切断された軸索が見えたが、彗星は負傷していない軸索と比較して数が大幅に減少した。損傷後11時間で、軸索は多数のEBP-2::GFP彗星が観察された軸索再成長の形で再生応答を引き出した(図3)。

Figure 1
図1: EBP彗星の観測と分析 (A) ワーム解剖学に対するその位置を示すPLMニューロンの模式図。(B) 参照点はニューロンの種類に従って選択される。この場合、PLMニューロンの細胞体は、前または後工程における関心領域の基準点として機能する。彗星(マゼンタ円)は、PLMニューロンの細胞体、前および後工程のパンクテエとして見える。対象の神経突起をトレースするセグメント線(前工程)を描き、キモグラフを抽出します。(C) 典型的なROIは移動彗星を表す斜めの跡を持つ距離のイメージであるキモグラフに変換することができる。細胞体に関しては、プラスエンドアウト彗星はシアンでトレースされ、マイナスエンドアウト彗星はピンクでトレースされます。空間参照では、セグメント化された ROI は、生のキモグラフの上に表されます。(D) 計測パラメータには、微小管パラメータに変換できるトレースの幅、高さ、角度、長さなどがあります。(E) 解析パラメータは、トレースの幅、高さ、角度の測定パラメータから抽出されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2PLM軸索中の微小管の定常ダイナミクス  (A) EBP-2の代表的な時系列のスナップショット::PlMニューロンの前および後のプロセスにおけるEBP-2:::GFP彗星(色付き矢印)の一部を示すPLMニューロンのGFP彗星。(B) 前工程の2つの領域(ROI-A、ROI-B)は、2(A)でマークされた彗星に対応するトレースを持つキモグラフに変換されます。トレースは、2(A)の移動彗星に関して色と番号が符号化されています。下側のグラフィックパネルは、その移動方向に基づいて区別される観測されたトレースを表します。プラスエンドアウト彗星はシアンでマークされ、マイナスエンドアウト彗星はピンクでマークされています。参照のために、セル本体の位置は下部に描かれています。(C) 後工程におけるROI-Cは、 図2(A)の後工程における移動彗星に対応する微量を有するカイモグラフに変換される。右端のパネルは、下部にマークされたセル本体の位置に対するプラス終了とマイナスの終了のトレースを表します。軸索領域(ROI-A、ROI-B)の痕跡のほとんどは、プラスエンドアウト微小管(シアントレース)を表す細胞体から離れていることに注意してください。逆に、後工程(ROI-C)では、プラス(シアントレース)とマイナスエンドアウト(ピンクの痕跡)微小管を持つ混合極性を表す双方向のトレースです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:PLMニューロンにおける軸索再生中の微小管  (A)フェムト秒レーザーを用いたアキソトミー手順の概略表現。レーザーは、再成長の開始に続いて傷害を作成します。主要な再生応答は、タイプ1融合、タイプ2融合、および軸索の再成長として採点される。 (B)EBP-2::GFPを発現するPLMニューロンの代表的な画像(0時間)、奇数化(2時間後腺切除術)、再成長状態(11時間後腺切除術)。キモグラフのためにトレースされたROIは、画像上にマークされています。(C)負傷していない、負傷した、再成長する、およびタイプ1の軸索に追跡された軸索領域の代表的なキモグラフ。EBP-2::GFP彗星の数は、負傷した軸索で有意に減少し、その後、再成長軸索の堅牢な動き(成長の長さと持続時間の増加)に続いて注意してください。個々のトレースは、その方向(シアンとピンクのトレース)に従って定量化され、分類することができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

微小管ダイナミクスを理解することは、長年にわたって細胞骨格研究の分野で重要な焦点となっています。微小管は、動的不安定性44、45、46、47の連続的なプロセスと共に核形成および大惨事を起こす。この情報の多くは、遊離対重合チューブリンの光散乱読み出し、蛍光チューブリンからの微小管成長アッセイ等のインビトロアッセイを通じて得られた。薄い細胞では蛍光性および非蛍光性微小管の実生観察が可能であるが、生体内での微小管ダイナミクスの測定は困難である。

このトランスジェニック株を用いて、PVM、ALM、およびAVMのような他のタッチニューロンも微小管の配向について評価することができる。ここで説明するイメージング、および分析手順は、C.エレガンスの他のニューロンタイプに適した適切なレポータートランスジェニックと合わせることができるが、異なるニューロン間の彗星ダイナミクスの変動は49、50、51、52と予想される。この方法は、C. elegans53,54,55, 56の非神経細胞タイプにも適用可能です。表皮または胚のような非神経細胞型では、微小管ダイナミクスは、2次元53、54、55、56で観察される。このようなイベントでは、時系列の画像を Z 投影またはスタック差分画像を使用して 1 つの画像に投影し、キモグラフの ROI を抽出します。

我々は、レバミソール塩酸塩、四トラミソールのような市販の麻酔薬は、彗星のダイナミクスを大幅に減衰させるので、ワームの固定化には適していないことを観察した。10%アガロースパッド上のマイクロビーズは、イメージング57、58の間に固定化するのに適した選択である。しかし、アガロースやマイクロビーズの割合が高くなるほど、ワームに対する物理的ストレスにつながる可能性があります。また、マイクロビーズ溶液を低温ショックとして取り付ける前に室温に持ち込むことが推奨され、微小管ダイナミクス59、60、61、62、63の変化を招く可能性がある。アガロースパッドの水分は、乾燥機アガロースパッドで乾燥し、湿ったアガロースパッドがワームの移動性を制限しない可能性があるため、固定化の敏感な要因です。実験者は64を取り付ける前に、アガロースパッドの平滑で平らな表面を視覚的に検査することができます。この取り付け手順は、ワームに関連する細菌を減らすことによってさらに改善することができる。表面付着細菌はワームの固定化を妨げるが、腸内細菌は自生蛍光をもたらし、EBP-2::GFP彗星のシグナルを妨げる可能性がある。そこで、新たに播種したOP50プレート上でワームを増殖させ、種なしNGMプレートにワームを置くか、またはSucrose溶液65、66でM9バッファーまたは浮遊物でそれらを洗浄することによって表面細菌を除去することが好ましい。

観測パラメータの中でも、彗星28を最適にサンプリングするには、空間的および時間的なスケールが重要です。EBP-2:::GFPは光の漂白に敏感であるため、光への不必要な暴露を防ぐべきである。蛍光プローブによるライブイメージングは、フリーラジカルの産生による光毒性損傷を引き起こします。これは微小管のダイナミクスを妨げる可能性があり、ワームにとって致命的である可能性があります。低露出獲得のセットアップは、光漂白と光毒性の問題を回避するために使用することができます。解析パラメータは多次元彗星の動きにも有効ですが、参照点を正しく決定する必要があります。

本研究で説明した各モジュールは、微小管のマイナス端、軸索または樹状突起内の小胞小器官などを検出する他のレポーターに適応することができる。この技術は、適切なトランスジェネシスおよびイメージングシステムを有する他の生物または組織にも適用することができる。微小管ダイナミクスの情報は、細胞分裂、細胞移動、細胞アーキテクチャの維持、その他の微小管ベースのプロセスなどの他の細胞プロセスで有効です。様々な臨床状態は、微小管組織およびダイナミクス7に関連付けられており、その正確な情報は薬理学的アプローチを強化し得る。

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Disclosures

著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

私たちは、初期のサポートと研究で使用される緊張のためにイーシ・ジンとアンドリュー・チザムに感謝します。細菌株OP50は、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供するカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から商業的に利用されました。また、実験手順の標準化に対するダルメンドラ・プリに感謝します。この研究は、国立脳研究センター(インドのバイオテクノロジー省、インド政府の支援)、DBT/ウェルカム・トラスト・インディア・アライアンス早期キャリア・グラント(グラント#IA/E/18/1/504331)のS.D.、ウェルカム・トラストDBTインド同盟中間助成金(グラント#IA/I/13/1/500874)のコアグラントによって資金提供されています。 CRG/2019/002194) から A.G.-R へ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

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