Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Vurdering af Microtubule Dynamics og Orientering i Caenorhabditis elegans Neuroner

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

En protokol til billeddannelse af de dynamiske mikrotubuler in vivo ved hjælp af fluorescerende mærket End bindende protein er blevet præsenteret. Vi beskrev metoderne til at mærke, billede, og analysere de dynamiske mikrotubuler i Posterior lateral microtubule (PLM) neuron af C. elegans.

Abstract

I neuroner, mikrotubule orientering har været en vigtig assessor til at identificere axoner, der har plus-end ud mikrotubuler og dendritter, der generelt har blandet orientering. Her beskriver vi metoder til at mærke, billede, og analysere microtubule dynamik og vækst under udvikling og regenerering af touch neuroner i C. elegans. Ved hjælp af genetisk kodede fluorescerende journalister af microtubule tips, vi afbildet axonal mikrotubuler. De lokale ændringer i microtubule adfærd, der indleder axon regenerering efter axotomi kan kvantificeres ved hjælp af denne protokol. Denne analyse er tilpasningsdygtig til andre neuroner og genetiske baggrunde til at undersøge reguleringen af microtubule dynamik i forskellige cellulære processer.

Introduction

Neuroner har en udførlig arkitektur med specialiserede rum som dendritter, cellelegemer, axoner og synapser. Den neuronale cytoskeleton består af mikrotubuler, mikrofilamenter og neurofilamenter, og deres særskilte organisation understøtter neuronale rum strukturelt og funktionelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . I årenes løb er mikrotubule organisation blevet identificeret som en nøgledeterminant for neuronal polaritet og funktion. Som neuroner gennemgå strukturelle remodeling under udvikling eller regenerering, microtubule dynamik og orientering bestemme identiteten, polariseret transport, vækst og udvikling af forskellige neuronale rum7. Det er derfor bydende nødvendigt at vurdere mikrotubule dynamik og orientering in vivo at korrelere med neuronal remodeling proces.

Mikrotubuler består af protofilaments af α og β Tubulin heterodimers med dynamiske plus ender og relativt stabile minus ender11,12. Opdagelsen af plus tip komplekse og tilhørende ende bindende proteiner har gjort det muligt for en platform til at vurdere microtubule organisation13. End bindende proteiner (EBP) forbigående forbundet med de voksende plus ender af microtubule og deres forening dynamik er korreleret med væksten af microtubule protofilaments14,15. På grund af hyppig tilknytning og dissociation af plus tip kompleks med microtubule, punkt spredning funktion af GFP-tagged EBP vises som en "komet" i en timelapse film15,16. Siden den banebrydende observation i pattedyr neuroner16, ende bindende proteiner mærket med fluorescerende proteiner er blevet brugt til at bestemme microtubule dynamik på tværs af forskellige modelsystemer og neuron typer17,18,19,20,21,22,23.

På grund af sit enkle nervesystem og gennemsigtige krop har C. elegans vist sig at være et fremragende modelsystem til at studere neuronal remodeling under udvikling og regenerering in vivo. Her beskriver vi metoder til at mærke, billede, og analysere microtubule dynamik og vækst under udvikling og regenerering af touch neuroner i C. elegans. Ved hjælp af genetisk kodet EBP-2::GFP, vi afbildet mikrotubuler i PLM neuron, som tillod os at bestemme polariteten af mikrotubuler i to forskellige neurites af denne neuron24. Denne metode gør det muligt at observere og kvantificere EBP-kometer som et mål for mikrotubuledynamik i forskellige cellulære sammenhænge, for eksempel kan de lokale ændringer i mikrotubuleadfærd, der indleder axonregenerering efter axotomi, vurderes ved hjælp af vores protokol. Denne analyse kan tilpasses til at undersøge reguleringen af microtubule dynamik i forskellige cellulære processer i forskellige celletyper og genetiske baggrunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reporter stamme: Kultur og vedligeholdelse

BEMÆRK: For at måle mikrotubule dynamik og orientering i PLM neuroner, vi brugte ormen stamme udtrykker EBP-2::GFP under touch neuron specifikke promotor mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. Vi bruger standard orm kultur og vedligeholdelse metoder til denne stamme27.

  1. Nematode Growth Medium (3,0 g/L natriumchlorid, 2,5 g/L peptone, 20,0 g/L agar, 10 mg/L-kolesterol (fortyndet fra en lageropløsning på 10 mg/mL)) i vand og autoklave blandingen.
  2. Blandingen afkøles kortvarigt i 10-15 min, før den suppleres med 1 mM calciumchlorid, 1 mM magnesiumsulfat og 25,0 mM kaliumphosphat monobasisk pH 6.0.
  3. Hæld ca. 9 mL af blandingen i 60 mm Petriskåle ved hjælp af en steril dispenser efterfulgt af opbevaring ved stuetemperatur og sterile forhold i en dag og efterfølgende opbevaring ved 4 °C.
  4. 50 mL B Bouillon (5,0 g/L natriumchlorid, 10,0 g/L Bacto-Tryptone), autoklave og afkøles, før den podes med en enkelt koloni af Escherichia coli (OP50-stamme).
  5. Kultur bakterierne ved 37 °C i 12 timer. Bring de kølede NGM-plader til stuetemperatur til såning og brug en steriliseret glasspreder lav en udtværing af OP50-bakterier på NGM-pladen.
  6. Hold de podede NGM plader ved 37 °C i 12 timer, hvilket vil gøre det muligt at danne en bakteriel græsplæne til dyrkning af C. elegans. Disse plader kan opbevares i en inkubator på 20 °C, indtil de anvendes.
  7. Bag den transgene stamme på de såede NGM-plader.
  8. Steriliser en platin wire pick på flamme og pick 20-25 gravid voksne hermafroditer til overførsel til en frisk sået plade.
  9. Når pladen er overført, skal den flyttes til en inkubator på 20 °C i 1 time. Derefter udtrække de voksne fra disse plader. Disse plader vil nu indeholde æg, der er aldersmatchet.
  10. Pladerne flyttes til 20 °C-inkubatoren til opdræt, indtil de når udviklingsstadiet af interesse, som i dette tilfælde er L4-stadiet 43,5 timer efter æglægning. For flere orme, bageste flere plader for at undgå fortrængning.
  11. På det ønskede udviklingsstadium kan disse orme monteres til billeddannelse af EBP-2::GFP kometer.

2. Prøveforberedelse: Montering af orme til billeddannelse af EBP-2 kometer

BEMÆRK: For at muliggøre live observation af EBP kometer i PLM neuroner, vi monteret ormene på agarose puder for at minimere deres mobilitet uden at gå på kompromis med fysiologi af neuronen. Blandt de forskellige immobiliseringsmetoder har vi valgt 0,1 μm polystyren perle løsning let tilgængelige kommercielt. Vi har skitseret monteringsproceduren, der anvendes specielt til EBP-2::GFP-observation.

  1. Forbered en opløsning på 10% agarose ved at smelte 0,2 g agarose i 2 mL 1x M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) i et 5 mL glas reagensglas over en flamme. Dette reagensglas kan nemt passe ind i en varmeblok, der holder agarose i smeltet tilstand, indtil brug.
  2. Ved hjælp af en bredmundet dropper dispenseres en dråbe (ca. 100 μL) af denne smeltede agarose over en ren glasrutschebane på 35 mm x 25 mm dimensioner.
  3. Mens det er i smeltet tilstand, skal du trykke på dråben med en anden glasrutschebane for at skabe en tynd film af agarose mellem glasrutschebanerne. Agarose størkner som en film på omkring 0,5 - 1,0 mm i tykkelse på omkring 30 sekunder.
  4. Når agarose størkner, hold den nederste dias i den ikke-dominerende hånd og den øverste dias i den dominerende hånd. Spejlvend det øverste dias, mens du holder det nederste dias stabilt, hvilket resulterer i, at agarosepuden klæber til et af de to dias.
  5. Hvis den dannede agarosepude er større end dækslerstørrelsen (18 mm x 18 mm), skal du trimme kanterne af puden for at opnå de nødvendige dimensioner for at sikre korrekt placering af dækslaget. Disse agarose puder er til øjeblikkelig brug og ikke skal opbevares.
  6. Undersøg visuelt agarosepuden for en glat overflade, der er fugtig og egnet til montering. Hvis agarosepuden udsættes for luft og bliver tørret, ser overfladen af agarosepuden rynket ud. I et sådant scenario skal du forberede frisk agarose pad som nævnt i trin 2-6 i dette afsnit.
  7. På agarosepuden sættes 2 μL 0,1 μm polystyren perleopløsning som monteringsmedium.
  8. Vælg 3-4 orme ved hjælp af en platin wire pick og flytte dem på en useedet NGM plade. Denne proces sikrer fjernelse af overfladebakterier, der forhindrer immobilisering under montering.
  9. Når ormene kryber ud af deres overflade bakterier, samle dem op til montering ved hjælp af en platin wire pick og genbruge dem i dråbe af polystyren perler på agarose pad.
  10. Placer forsigtigt en 18 mm x 18 mm coverslip på ormene. For at forhindre udtagning af de monterede orme må dækslerne ikke flyttes efter placering.
  11. Monter det forberedte dias på mikroskopet til billeddannelse.

3. Opsætning og anskaffelse af billedbehandling

BEMÆRK: EBP kometer bevæger sig med en omtrentlig hastighed på 0,22 μm/s som observeret i pattedyrs- og PLM-neuroner af C. elegans16,18. For optimalt at prøve hændelserne i en tidsforsenet erhvervelse i henhold til Nyquist kriterier28, rumlige og tidsmæssige skalaer på henholdsvis 0,09 μm og 0,43 s, er påkrævet. Til forebyggelse af fototoksicitet eller fotobleaching brugte vi Spinning Disk-erhvervelse. Vi har beskrevet vores opsætning og anskaffelsesindstillinger nedenfor.

  1. Tag billederne ved hjælp af et omvendt mikroskop, der er udstyret med en roterende diskenhed og kamera. Tænd opsætningen i henhold til producentens instruktion.
  2. Slå den software til, der styrer installationen.
  3. Da dette er et omvendt mikroskop, skal du placere diaset med de monterede orme på scenen med et lavt forstørrelsesmål (5x eller 10x) med coverliptet nedad.
  4. Konfigurer lysvejen til øje eller synlig tilstand, der bruger belysning fra halogenlampe til transmitteret lys og kviksølvbuelampe til reflekteret lys.
  5. Fokuser og centrer en orm i visningsfeltet under brightfield.
  6. Sæt nedsænkning olie og ændre forstørrelse til 63x (1.4NA/Oil) og refokusere ormen hale i brightfield for PLM neuroner.
  7. Tænd fluorescens af kviksølv bue lampe for en kort refokusering af PLM neuroner. Placer det korrekte sæt reflektor (AF488) i lysstien til visualisering af GFP.
  8. Indstil mikroskopet til kameraets anskaffelse ved at dirigere lysstien til kameraet.
    BEMÆRK: Kontrol af ovennævnte trin 4-7 gennem microskopets thin filmtransistor (TFT) skærm er hurtig og forhindrer unødvendig eksponering for belysningen. Alternativt kan du styre belysningen, reflektoren gennem softwaren.
  9. Efter fokusering af PLM neuron i visningsfeltet, i software interface vælge belysning af 488 nm laser med 30% magt og 300 ms eksponering for kameraet med Electron Multiplicere (EM) vinde værdi 70. Afhængigt af reporterudtrykket skal du variere disse parametre efter behov. Gem indstillingerne som en konfiguration til efterfølgende billedsessioner.
  10. Fanen Kanaler gemmer sporene hver med en bestemt belysnings- og kameraindstilling. Det fremhævede spor giver mulighed for en live visualisering, mens sporet for at erhverve et billede skal krydses på. Fremhæv en kanal med DIC (Brightfield) for at få en direkte visualisering af ormens hale i arbejdsområdet. Eksemplet er fokuseret og centreret i arbejdsområdets aktive billedvindue.
  11. Fremhæv kanalen med 488 nm laser excitation for en hurtig fokusering af PLM neuron i live imaging vinduet. Når det er fokuseret, skal du begynde tidsforsenelsen ved at angive tidsserieparametrene som nævnt i næste trin.
  12. Ved hjælp af 488 nm laserbelysning skal du oprette et eksperiment med tidsserier i 2 minutter og intet tidsinterval mellem rammer. For at opretholde de tidsmæssige skalaer af billedopsamling erhvervede vi kun GFP fluorescens.
  13. Start anskaffelsen under fanen Start eksperiment. Ved hjælp af en 63x forstørrelse begrænses den rumlige opløsning til 0,21 μm, som er stikprøven af kameraet på pixel størrelse på 0,09 μm. Få en tidsforsenelse ved 3,3 billeder/s for at få et optimalt udsnit af hændelsen. Tidsforseedet havde 396 tidsrammer erhvervet over en varighed på 2 min. Når du har foretaget købet, skal du gemme billedet i standardformatet, som du senere kan få adgang til af standardsoftwaren eller ImageJ.

4. Observation og analyse

  1. Få vist timelapse-anskaffelsen i standardsoftwaren, eller åbn den i Image J via plug-in'en Bioformats.
    BEMÆRK: Vi har beskrevet processen med billedanalyse i Billede J.
  2. Installer plug-in'en Bioformats i ImageJ.
    1. Du kan også eksportere standardformatfilen til .tif for filkompatibilitet i ImageJ. Eksportfunktionen i ZEN2 resulterer i individuelle rammer i billedet som diskrete .tif filer. Vi undgår denne metode for at forhindre dannelsen af et stort antal filer.
  3. Åbn billedet i '.czi' format direkte i Billede J gennem sin 'Bioformats' plugin. Billedet åbnes som en stak med flere billeder. Hvis du bruger standardsoftwarens "eksport"-funktion, skal du rekonstruere billederne som en stak med flere billeder ved hjælp af følgende arbejdsproces i ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks - undermenuen > Billeder, der skal stables.
  4. Få vist billedet som en film ved hjælp af ikonet Afspil i venstre nederste hjørne af billedvinduet. Kometerene kan ses som lyse mobile punktering i cellekroppen og processer af PLM neuron. Hvis kometerene er synlige tydeligt, skal du gå videre til trin 8 ellers følge trin 5-7 i dette afsnit.
  5. Konverter billedets farveprofil ved hjælp af layouttabellen (LUT) til et gråtonebillede: ImageJ-program > menuen Billede > undermenuen Opslagstabeller > Vælg gråtone.
  6. Inverter billedets LUT-profil for nem visualisering: ImageJ-program > menuen Billede > undermenuen Opslagstabeller > Inverter LUT.
  7. Juster lysstyrken og kontrasten i billedet, så kometerne vises: ImageJ-programmet > menuen Billede > Juster undermenuen > Lysstyrke/Kontrast.
    1. Flyt skyderne minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast for den ønskede skalering af intensiteterne på tværs af billedet. Vi kvantificerede billederne med kometer synligt.
  8. Den grundlæggende version af ImageJ har startværktøjer repræsenteret som ikoner. Find og højreklik på ikonet med en linje for at åbne en rullemenu og vælge den segmenterede linje. Tegn den segmenterede linje på de områder af interesse (ROI) med sin oprindelse på eller i nærheden af cellelegemet af neuronen.
    1. Du kan senere overveje at gemme det segmenterede linje-investeringsafkast via ROI-lederen ved hjælp af følgende arbejdsproces: ImageJ > Analyze > Tools > ROI Manager > Vælg den tegnede sporing i billedet og klik på Tilføj i vinduet RoI Manager > Mere i vinduet RoI Manager > Gem.
  9. Før du genererer kymografen, da de rumlige og tidsmæssige skalaer er forskellige, skaler du skaleringen for at opnå målingerne i pixels ved hjælp af følgende:
    ImageJ > Analyser > Indstil skala > Klik her for at fjerne skalaen > Ok.
  10. Brug reslice-funktionen under rullemenuen Billede > stakke, og generer en kymograf. Kymografen er en repræsentation af det segmenterede investeringsafkast i tide. Den vandrette akse repræsenterer afstanden, og den lodrette akse repræsenterer tiden. De diagonale spor repræsenterer de bevægelige kometer. Generelt tager kymografen billedets farveprofil ellers tildele en farveprofil som beskrevet i de foregående trin 5-6 til visualisering af de diagonale spor.
  11. Brug funktionen Lige linje i rullemenuen i værktøjet Streg (se trin 9 i dette afsnit) tegne lige linjer over hver af de diagonale spor og tilføje dem i ROI manager.
  12. Gå til Angiv målinger under fanen Analyser, og vælg Parametre for middelintensitet og afgrænsning af rektangel til måling af sporene.
  13. Klik på Mål, som åbner et resultatvindue, som giver den gennemsnitlige intensitet af investeringsafkast, X- og Y-koordinaterne for linjesporene, Bredde, Højde, Vinkel og Længde af linjesporene i vinduet Roi, X- og Y-koordinaterne. Dette vindue kan gemmes som et .csv format og senere importeres til et dataanalyseprogram.
  14. I regnearksprogrammet åbnes resultatvinduet med de værdier, der er fordelt i rækker og kolonner. De relevante værdier er bredden, højden og vinklen på sporene. Bredden giver sporforskydningen, højden giver varigheden, og vinklen repræsenterer vektoren. Da bredde- og højdeværdierne er i pixel, skal du gange dem med henholdsvis de rumlige og tidsmæssige skalaer for at opnå de målbare standardparametre.
  15. Da venstre side af kymografen er proksimale for cellekroppen, klassificeres kometer i plus-end-out eller minus-end-out (dvs. væk fra cellekroppen eller mod cellekroppen). Klassificere vinkler mellem 1° til -89° og -91° til -179° som plus-end-out og minus-end-out. Indsamle data fra flere kymografer i et regneark til en undersøgelse og statistisk repræsentere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et repræsentativt eksempel har vi beskrevet in vivo observation af EBP kometer i steady-state og regenererende axoner af PLM neuroner. PLM neuroner er placeret i ormens haleregion med en lang forreste proces, der danner en synapse og en kort posteriorproces. PLM neuroner vokser i den forreste-posterior retning tæt på epidermis og er ansvarlige for den blide touch fornemmelse i ormene. På grund af deres forenklede struktur, og amenability til billeddannelse og mikrokirurgi, PLM neuroner er blevet grundigt undersøgt for deres microtubule cytoskeleton29, axonal transport30,31, og regenerering19,32, neuronal polaritet24,33,34, adfærd og aldring35,36  og mange andre neuronale processer. Vi brugte PLM neuroner til at vurdere microtubule dynamik og orientering in vivo i en transgen udtrykke EBP-2::GFP under mec-4 promotor.

For at kontrollere steady-state dynamikken i mikrotubuler, valgte vi orme udtrykke Pmec-4-EBP-2::GFP reporter. Ormene blev monteret i 0,1 μm polystyren perler på 10% agarose puder. Coverlip blev tilføjet forsigtigt, og ormene blev afbildet på spinding disk mikroskop. PLM neuroner var centreret og fokuseret på 63x og afbildet med en billedhastighed på 3,3 billeder i sekundet. Den forreste proces af PLM viste et flertal af kometer bevæger sig væk fra cellelegemet, mens den bageste proces viste en tovejs bevægelse af kometer(Figur 1). Baseret på kometerenes retning indeholder plm'ens forreste proces unipolar plus-end-out mikrotubuler, mens den bageste proces har blandet polaritet (plus og minus-end-out) af mikrotubuler (Figur 2)24.

Som en anvendelse af analysen udforskede vi mikrotubuledynamikken og orienteringen i de regenererende axoner af PLM-neuroner. Tidligere undersøgelser har fastslået metoder til laser mægle axotomi ved hjælp af forskellige typer af lasere, herunder UV, nanosekund, picosecond, og femtosecond lasere31,37,38,39,40,41,42,43. Til denne undersøgelse brugte vi en femtosecond laser til at afskære den forreste proces af PLM neuroner43. Efter skaden blev ormene genvundet på seedede NGM-plader. Ormene blev derefter afbildet på flere tidspunkter efter skade til observation af EBP-2::GFP kometer. På 2 timer efter skade, en afskåret axon var synlig dog kometer blev drastisk reduceret i antal i forhold til en uskadt axon. Ved 11 timer efter skaden har axonerne fremkaldt en regenereringsrespons i form af axonal genvækst, hvor et stort antal EBP-2::GFP-kometer blev observeret (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Observation og analyse af EBP kometer. (A) Skematisk af PLM neuron viser sin position med hensyn til ormen anatomi. (B) Referencepunktet vælges i henhold til neurontypen. I dette tilfælde fungerer PLM-neuronens cellekrop som referencepunkt for de regioner, der er interesserede i forreste eller bageste processer. Kometer (magenta cirkler) er synlige som punktlige i cellekroppen, forreste og bageste processer i PLM neuron. En segmenteret linje, der sporer interesse neurit (forreste proces), trækkes for at udtrække en kymograf. (C) Et typisk ROI kan omdannes til en kymograf, som er et afstandsbillede med diagonale spor, der repræsenterer de bevægelige kometer. Med hensyn til cellekroppen spores plus-end-out kometerene i cyan, mens minus-end-out kometer spores i pink. For rumlig reference er det segmenterede INVESTERINGSAFKAST repræsenteret oven på den rå kymograf. (D) Måleparametre omfatter bredden, højden, vinklen og længden af det spor, der kan oversættes til mikrotubuleparametre. (E) Analyseparametre udtrækkes fra måleparametrene for sporenes bredde, højde og vinkel. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2: Mikrotubulernes steady-state dynamik i PLM-axonen. (A) Snapshots af en repræsentativ tidsserie af EBP-2::GFP kometer i PLM neuroner viser nogle af de EBP-2::GFP kometer (farvede pile) i den forreste og bageste processer PLM neuron. B) To regioner i den forreste proces (ROI-A og ROI-B) omdannes til kymografer, hvor sporene svarer til kometerne markeret i punkt 2,a. Sporene er blevet farve og nummer kodet med hensyn til de bevægelige kometer i 2(A). Lavere grafisk panel repræsenterer de observerede spor skelnes baseret på deres retning af bevægelsen. Plus end out kometer er markeret i cyan mens minus ende ud kometer er markeret i pink. Til reference er placeringen af cellekroppen afbildet nederst. (C) ROI-C i den bageste proces omdannes til kymografer med spor svarende til de bevægelige kometer i den bageste proces i figur 2(A). Højre panel repræsenterer plus ende og minus ende ud spor med hensyn til placeringen af cellelegemet markeret i bunden. Bemærk, at de fleste af sporene i de axonale områder (ROI-A og ROI-B) bevæger sig væk fra cellekroppen, der repræsenterer plus-end-out mikrotubuler (cyanspor). Tværtimod er sporene i den bageste proces (ROI-C) tovejs, der repræsenterer den blandede polaritet med plus (cyanspor) og minus-end-out (lyserøde spor) mikrotubuler. Klik her for at se en større version af dette tal.  

Figure 3
Figur 3: Mikrotubuler under axonal regenerering i PLM-neuroner.   (A) Skematisk gengivelse af axotomiproceduren ved hjælp af en femtosecond laser. Laseren skaber en skade efterfulgt af indledningen af genvæksten. Større regenerering svar er scoret som type 1 fusion, type 2 fusion, og Regrowing axons. (B) Repræsentative billeder af PLM-neuroner, der udtrykker EBP-2::GFP i det uskadte (0 h), axotomiserede (2 timer efter axotomi) og genvækstbetingelser (11 timer efter axotomi). Roi spores til kymografer er blevet markeret på billederne. C) Repræsentative kymografer i axonale regioner, der spores på de uskadte, tilskadekomne, genvækst og type 1-smeltede axoner. Bemærk, at antallet af EBP-2::GFP kometer faldt betydeligt i de skadede axoner efterfulgt af deres robuste bevægelse (øget vækstlængde og varighed) i den regrowing axon. Individuelle spor kan kvantificeres og klassificeres som pr. deres retning (cyan og lyserøde spor). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelse af microtubule dynamik har været et centralt fokus inden for cytoskeletal forskning gennem årene. Mikrotubuler gennemgår nucleation og katastrofe sammen med en kontinuerlig proces med dynamisk ustabilitet44,45,46,47. Mange af disse oplysninger er opnået gennem in vitro-analyser som lysspredningsudlæsninger af gratis vs. polymeriseret tubulin, mikrotubulevækstanalyser fra fluorescerende tubulinosv. Mens levende observation af fluorescerende og ikke-fluorescerende mikrotubuler er mulig i tynde celler, in vivo målinger af microtubule dynamik er udfordrende.

Ved hjælp af denne transgene stamme, andre touch neuroner som PVM, ALM, og AVM kan også vurderes for microtubule orientering. Billeddannelse, og analyseprocedurer beskrevet her kan tilpasses til andre neuron typer i C. elegans med en passende reporter transgen dog variabilitet i komet dynamik på tværs af forskellige neuroner forventes49,50,51,52. Denne metode gælder også for ikke-neuronale celletyper i C. elegans53,54,55,56. I ikke-neuronale celletyper som epidermis eller embryo observeres mikrotubuledynamikken i to dimensioner53,54,55,56. For sådanne begivenheder projicere billeder af tidsserien til et enkelt billede ved hjælp af Z-projektion eller Stack forskel billeder for at udtrække ROI for kymografer.

Vi observerede, at de kommercielt tilgængelige bedøvelsesmidler som Levamisole hydrochlorid, Tetramisole, ikke er egnede til immobilisering af ormene, da de svækker kometdynamikken drastisk. Mikroperler på 10% agarose pads er et passende valg til immobilisering under billeddannelse57,58. Men længere eksponering for en højere procentdel af agarose og mikroperler kan føre til fysisk stress på ormene. Det er også tilrådeligt at bringe mikroperleopløsningen til stuetemperatur før montering, da koldt stød kan føre til en ændring i mikrotubuledynamikken59,60,61,62,63. Fugt i agarose puder er en følsom faktor for immobilisering, som orme kan få udtørret i tørretumbler agarose puder og fugtige agarose puder kan ikke begrænse ormenes mobilitet. Eksperimentatoren kan visuelt inspicere agarosepuden for glat og nivelleret overflade før montering64. Monteringsproceduren kan yderligere forbedres ved at reducere de bakterier, der er forbundet med ormene. Overfladen klæbende bakterier hindre immobilisering af ormen mens tarmen bakterier resulterer i autofluorescence, der kan okkludere signalet fra EBP-2::GFP kometer. Så det er at foretrække at dyrke ormene på frisksåede OP50 plader og fjerne overfladen bakterier ved at sætte orme på useedede NGM plader eller vaske dem med M9 buffer eller floatation i saccharose opløsning65,66.

Blandt observationsparametrene er de rumlige og tidsmæssige skalaer afgørende for optimalt at prøve kometerene28. EBP-2::GFP er følsom over for fotobleaching, og unødvendig udsættelse for lys bør derfor forhindres. Live imaging med fluorescerende sonder forårsager også fototoksisk skade på grund af produktionen af frie radikaler. Dette kan hæmme mikrotubule dynamikken og kan være dødelig for ormen. En lav eksponering erhvervelse setup kan bruges til at omgå problemerne med photobleaching og fototoksicitet. Analyseparametrene vil også gælde for flerdimensionelle kometbevægelser, men man skal bestemme referencepunktet korrekt.

Hvert af de moduler, der er beskrevet i denne undersøgelse, kan tilpasses andre journalister, der registrerer minus enderne af mikrotubuler, en vesikulær organelle i axon eller dendritter osv. Denne teknik kan også anvendes på andre organismer eller væv med passende transgenese og billeddannelsessystem. Oplysningerne om microtubule dynamik er gyldige i andre cellulære processer som celledeling, cellemigrering, vedligeholdelse af cellulær arkitektur og andre microtubule-baserede processer. Forskellige kliniske tilstande har været forbundet med mikrotubule organisation og dynamik7, nøjagtige oplysninger, som kan styrke farmakologiske tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Yishi Jin og Andrew Chisholm for den indledende støtte og den belastning, der anvendes i undersøgelsen. Den bakteriestamme OP50 blev kommercielt benyttet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi takker også Dharmendra Puri for standardiseringen af de eksperimentelle procedurer. Undersøgelsen er finansieret af kernebevillingen fra National Brain Research Centre (støttet af Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT /Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) til S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) til A.G.-R og et tilskud fra Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) til A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Neurovidenskab udgave 177
<em>In vivo</em> Vurdering af Microtubule Dynamics og Orientering i <em>Caenorhabditis elegans</em> Neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter