Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.

Abstract

В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.

Introduction

Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжении многих лет организация микротрубочек была идентифицирована как ключевой детерминант полярности и функции нейронов. Поскольку нейроны подвергаются структурному ремоделированию во время развития или регенерации, динамика и ориентация микротрубочек определяют идентичность, поляризованный транспорт, рост и развитие различных нейронных компартментов7. Поэтому крайне важно оценить динамику и ориентацию микротрубочек in vivo, чтобы коррелировать с процессом ремоделирования нейронов.

Микротрубочки состоят из протофиламентов гетеродимеров α и β тубулина с динамическими плюс-концами и относительно стабильными минус-концами11,12. Открытие комплекса плюс-наконечника и связанных с ним конечных связывающих белков позволило платформе оценить организацию микротрубочек13. Конечные связывающие белки (EBP) временно связываются с растущими плюс концем микротрубочек и их ассоциативная динамика коррелирует с ростом протофиламентов микротрубочек14,15. Из-за частой ассоциации и диссоциации комплекса плюс наконечника с микротрубочкой функция точечного распространения GFP-помеченного EBP появляется как «комета» в таймлапс-ролике15,16. Начиная с новаторского наблюдения за нейронами млекопитающих16,конечные связывающие белки, помеченные флуоресцентными белками, использовались для определения динамики микротрубочек в различных модельных системах и типах нейронов17,18,19,20,21,22,23.

Благодаря своей простой нервной системе и прозрачному телу, C. elegans зарекомендовал себя как отличная модельная система для изучения ремоделирования нейронов во время развития и регенерации in vivo. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированный EBP-2::GFP, мы визуализировали микротрубочки в нейроне PLM, что позволило нам определить полярность микротрубочек в двух разных нейритах этого нейрона24. Этот метод позволяет наблюдать и количественно оценивать кометы EBP как меру динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, например, локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть оценены с использованием нашего протокола. Этот анализ может быть адаптирован для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах в различных типах клеток и генетическом фоне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Репортерное напряжение: культура и поддержание

ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения динамики микротрубочек и ориентации в нейронах PLM мы использовали штамм червя, экспрессирующий EBP-2::GFP под сенсорным нейроном специфическим промотором mec-4 (аллель juIs338) 18,25,26. Мы используем стандартные методы культивирования и поддержания червей для этого штамма27.

  1. Подготовьте питательную среду нематоды (3,0 г/л хлорида натрия, 2,5 г/л пептона, 20,0 г/л агара, 10 мг/л холестерина (разбавленного из запасного раствора 10 мг/мл)) в воде и автоклаве смеси.
  2. Охладите смесь кратковременно в течение 10-15 мин, прежде чем дополнить ее 1 мМ хлорида кальция, 1 мМ сульфата магния и 25,0 мМ фосфата калия моноосновным рН 6,0.
  3. Вылейте около 9 мл смеси в 60 мм чашки Петри с помощью стерильного дозатора с последующим хранением при комнатной температуре и стерильных условиях в течение суток и последующим хранением при 4 °C.
  4. Приготовьте 50 мл бульона B (5,0 г /л хлорида натрия, 10,0 г / л бакто-триптона), автоклав и охладите его перед инокуляцией одной колонией кишечной палочки (штамм OP50).
  5. Культивировщик бактерий при 37 °C в течение 12 часов. Доведите охлажденные пластины NGM до комнатной температуры для посева и с помощью стерилизованного стеклянного распределителя сделайте мазок бактерий OP50 на пластине NGM.
  6. Держите привитые плиты NGM при 37 °C в течение 12 часов, что позволит сформировать бактериальный газон для культивирования C. elegans. Эти пластины можно хранить в инкубаторе при 20 °C до использования.
  7. Задней части трансгенный штамм на засеянных пластинах NGM.
  8. Стерилизуйте платиновый проволочный отмычек на огне и соберите 20-25 гравидных взрослых гермафродитов для переноса на свежепосеянную тарелку.
  9. После переноса переложить пластину в инкубатор при 20 °C в течение 1 ч. Затем извлеките взрослых из этих пластин. Эти пластины теперь будут содержать яйца, которые соответствуют возрасту.
  10. Переместите пластины в инкубатор 20 °C для выращивания до тех пор, пока они не достигнут интересующей стадии развития, которая в данном случае является стадией L4 через 43,5 часа после откладывания яиц. Для большего количества червей, задние несколько пластин, чтобы избежать скученности.
  11. На желаемой стадии развития эти черви могут быть установлены для визуализации комет EBP-2::GFP.

2. Пробоподготовка: Установка червей для визуализации комет EBP-2

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить живое наблюдение комет EBP в нейронах PLM, мы установили червей на агарозных подушечках, чтобы минимизировать их подвижность, не ставя под угрозу физиологию нейрона. Среди различных методов иммобилизации мы выбрали 0,1 мкм раствор полистирольных шариков, легко доступный в продаже. Мы изложили процедуру монтажа, используемую специально для наблюдения EBP-2::GFP.

  1. Готовят раствор 10% агарозы путем плавления 0,2 г агарозы в 2 мл 1x M9 буфера (0,02 M KH2PO4,0,02 M Na2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) в стеклянной пробирке 5 мл над пламенем. Эта пробирка может легко поместиться в нагревательный блок, который удерживает агарозу в расплавленном состоянии до использования.
  2. Используя пипетку с широким горлом, дозируют каплю (около 100 мкл) этой расплавленной агарозы на чистом стеклянном слайде размером 35 мм х 25 мм.
  3. Пока он находится в расплавленном состоянии, нажмите на каплю другим стеклянным слайдом, чтобы создать тонкую пленку агарозы между стеклянными слайдами. Агароза затвердевает в виде пленки толщиной около 0,5 - 1,0 мм примерно за 30 секунд.
  4. Как только агароза затвердеет, держите нижний слайд в недоминирующей руке, а верхний слайд в доминирующей руке. Переверните верхний слайд, удерживая нижний слайд устойчивым, в результате чего агарозная подушка прилипает к одному из двух слайдов.
  5. Если сформированная агарозная прокладка больше размера крышки (18 мм х 18 мм), то обрежьте края прокладки для получения необходимых размеров для обеспечения правильного размещения крышки. Эти агарозные прокладки предназначены для немедленного использования и не должны храниться.
  6. Визуально осмотрите агарозную прокладку на наличие гладкой поверхности, которая является влажной и пригодной для монтажа. Если агарозная прокладка подвергается воздействию воздуха и высыхает, поверхность агарозной прокладки кажется морщинистой. В таком случае приготовьте свежую агарозную подушку, как указано в шагах 2-6 этого раздела.
  7. На агарозную прокладку поместите 2 мкл раствора полистирольного шарика 0,1 мкм в качестве монтажного носителя.
  8. Выберите 3-4 червя с помощью платиновой проволоки и переложите их на несеяную пластину NGM. Этот процесс обеспечивает удаление поверхностных бактерий, препятствующих иммобилизации во время монтажа.
  9. Как только черви выползут из своих поверхностных бактерий, подберите их для монтажа с помощью платиновой проволоки и повторно суспендьте их в капле полистирольных шариков на агарозовой подушке.
  10. Осторожно поместите на червей крышку 18 мм x 18 мм. Чтобы предотвратить потрошение навесных червей, не перемещайте крышку после размещения.
  11. Установите подготовленный слайд на микроскоп для визуализации.

3. Настройка и получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Кометы EBP движутся с приблизительной скоростью 0,22 мкм/с, как это наблюдалось в нейронах млекопитающих и PLM C. elegans16,18. Для оптимальной выборки событий в замедленной съемке в соответствии с критериями Найквиста28требуются пространственные и временные масштабы 0,09 мкм и 0,43 с соответственно. Для предотвращения фототоксичности или фотоотбеливания мы использовали сбор Spinning Disk. Ниже мы описали настройку и сбор изображений.

  1. Делайте снимки с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного вращающимся дисковым блоком и камерой. Включите настройку в соответствии с инструкцией производителя.
  2. Включите программное обеспечение, управляя установкой.
  3. Поскольку это перевернутый микроскоп, поместите затвор с установленными червями на сцену с низким увеличением объектива (5x или 10x) с крышкой вниз.
  4. Настройте световой путь к глазу или видимый режим, который использует освещение от галогенной лампы для пропускаемого света и ртутной дуговой лампы для отраженного света.
  5. Фокусировка и центр червя в поле зрения под ярким полем.
  6. Поместите погружное масло и измените увеличение на 63x (1,4NA / масло) и перефокусировать хвост червя в ярком поле для нейронов PLM.
  7. Включите флуоресценцию ртутной дуговой лампы для кратковременной перефокусировки PLM-нейронов. Поместите правильный набор рефлектора (AF488) в световой контур для визуализации GFP.
  8. Установите микроскоп на получение камеры, направляя световой путь к камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Управление вышеупомянутыми шагами 4-7 через тонкопленочный транзисторный (TFT) экран микроскопа происходит быстро и предотвращает ненужное воздействие освещения. В качестве альтернативы можно управлять освещением, отражателем через программное обеспечение.
  9. После фокусировки PLM-нейрона в поле зрения, в программном интерфейсе выбирают подсветку лазера 488 нм мощностью 30% и экспозицией 300 мс для камеры со значением коэффициента усиления 70 electron Multiplying (EM). В зависимости от выражения репортера измените эти параметры по мере необходимости. Сохраните параметры в качестве конфигурации для последующих сеансов создания образов.
  10. На вкладке «Каналы» хранятся дорожки с определенным освещением и настройками камеры. Выделенный трек позволяет визуализировать в реальном времени, тогда как для получения изображения трек должен быть отмечен галочкой. Выделите канал с brightfield (DIC) для визуализации хвоста червя в рабочем пространстве в реальном времени. Образец фокусируется и центрируется в окне обработки изображений в реальном времени рабочей области.
  11. Выделите канал лазерным возбуждением 488 нм для быстрой фокусировки PLM-нейрона в окне визуализации в реальном времени. После фокусировки начните сбор временных промежутков, задав параметры временных рядов, как указано на следующем шаге.
  12. Используя лазерное освещение 488 нм, постройте эксперимент с временными рядами в течение 2 минут и без временного интервала между кадрами. Чтобы сохранить временные масштабы получения изображения, мы получили только флуоресценцию GFP.
  13. На вкладке Начать эксперимент начните получение. Использование 63-кратного увеличения ограничивает пространственное разрешение до 0,21 мкм, которое сэмплируется камерой с размером пикселя 0,09 мкм. Получите таймлапс со скоростью 3,3 кадра/с для оптимальной выборки события. Покадровое изображение имело 396 таймфреймов, полученных в течение 2 минут. После получения сохраните изображение в формате по умолчанию, к которому позже может получить доступ программное обеспечение по умолчанию или ImageJ.

4. Наблюдение и анализ

  1. Просмотрите получение таймлапса в программном обеспечении по умолчанию или откройте его в Image J через плагин Bioformats.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы описали процесс анализа изображений в Image J.
  2. Установите подключаемый модуль Bioformats в ImageJ.
    1. Кроме того, можно экспортировать файл формата по умолчанию в .tif для обеспечения совместимости файлов в ImageJ. Функция экспорта в ZEN2 приводит к отдельным кадрам изображения в виде дискретных .tif файлов. Мы избегаем этого метода, чтобы предотвратить образование большого количества файлов.
  3. Откройте изображение в формате '.czi' непосредственно в Image J через плагин 'Bioformats'. Изображение откроется в виде стека с несколькими изображениями. Если используется функция «экспорт» программного обеспечения по умолчанию, то воссоздайте изображения как стек из нескольких образов, используя следующий рабочий процесс в ImageJ: Программа ImageJ > меню изображений > стеки подменю > Images To Stack.
  4. Просмотрите изображение как фильм с помощью значка Воспроизвести в левом нижнем углу окна изображения. Кометы можно увидеть как яркие подвижные пунктары в теле клетки и процессы PLM-нейрона. Если кометы видны четко, перейдите к шагу 8, в противном случае выполните шаги 5-7 этого раздела.
  5. Преобразуйте цветовой профиль изображения с помощью таблицы подстановки (LUT) в изображение в градациях серого: программа ImageJ > меню «Изображение» > подменю «Таблицы подстановки» > «Выбор серых».
  6. Инвертировать профиль LUT изображения для удобной визуализации: программа ImageJ > меню «Изображение» > подменю «Таблицы подстановки» > «Инвертировать LUT».
  7. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения для просмотра комет: программа ImageJ > меню «Изображение» > Настроить подменю > Яркость / Контрастность.
    1. Переместите ползунки «Минимум», «Максимум», «Яркость» и «Контрастность» для требуемого масштабирования интенсивности по всему изображению. Мы количественно оценили изображения с кометами, видимыми отчетливо.
  8. Базовая версия ImageJ имеет инструменты запуска, представленные в виде значков. Найдите и щелкните правой кнопкой мыши значок со строкой, чтобы открыть раскрывающееся меню, и выберите сегментированную линию. Нарисуйте сегментированную линию на интересующих областях (ROI) с ее происхождением на теле клетки нейрона или рядом с ней.
    1. Для более поздних соображений сохраните сегментированную линию ROI через менеджер ROI с помощью следующего рабочего процесса: ImageJ > Analyze > Tools > ROI manager > Выберите нарисованную трассировку на изображении и нажмите кнопку Добавить в окне менеджера ROI > Подробнее в окне менеджера ROI > Сохранить.
  9. Перед генерацией кимографа, так как пространственный и временной масштабы различны, уберите масштабирование, чтобы получить измерения в пикселях, используя следующее:
    ImageJ > Анализ > Настройка масштабной > Нажмите, чтобы удалить масштаб > ОК.
  10. С помощью функции «Перелиценция» в раскрывающемся меню «Стеки изображений >» сгенерируйте кимограф. Кимограф представляет собой представление сегментированной roI во времени. Горизонтальная ось представляет расстояние, а вертикальная ось представляет время. Диагональные следы представляют движущиеся кометы. Как правило, кимограф принимает цветовой профиль изображения, в противном случае назначается цветовой профиль, как описано в предыдущих шагах 5-6 для визуализации диагональных следов.
  11. С помощью функции «Прямая линия» в раскрывающемся меню инструмента «Линия» (см. шаг 9 этого раздела) нарисуйте прямые линии над каждой из диагональных трассировок и добавьте их в менеджере ROI.
  12. На вкладке Анализ перейдите в перейти в пункт Задать измерения и выберите Параметры средней интенсивности и ограничивающего прямоугольника для измерения трассировок.
  13. В окне менеджера ROI щелкните Измерить, которое откроет окно Результат, в котором будет выдаваться средняя интенсивность ROI, координаты X и Y трассировок линии, Ширина, Высота, Угол и Длина трассировок линии. Это окно может быть сохранено в формате .csv, а затем импортировано в программу анализа данных.
  14. В программе для работы с электронными таблицами открывается окно результатов со значениями, распределенными по строкам и столбцам. Соответствующими значениями являются ширина, высота и угол трассировки. Ширина дает смещение трассировки, высота дает длительность, а угол представляет вектор. Поскольку значения ширины и высоты находятся в пикселях, умножьте их на пространственный и временной масштабы соответственно для получения стандартных измеримых параметров.
  15. Поскольку левая сторона кимографа находится проксимально к телу клетки, в зависимости от угла, классифицируют кометы на плюс-конец или минус-конец(т.е. вдали от тела клетки или к телу клетки, соответственно). Классифицируйте углы от 1° до -89° и от -91° до -179° как плюс-конец-выход и минус-конец соответственно. Сопоставляйте данные с нескольких кимографов в электронную таблицу для исследования и статистически представляете.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В качестве репрезентативного примера мы описали наблюдение in vivo комет EBP в стационарном состоянии и регенерирующими аксонами нейронов PLM. PLM-нейроны расположены в хвостовой области червя с длинным передним отроском, образующий синапс и короткий задний отроск. Нейроны PLM растут в передне-заднем направлении близко к эпидермису и отвечают за нежное ощущение прикосновения у червей. Благодаря их упрощенной структуре и поддающейся визуализации и микрохирургии, нейроны PLM были тщательно исследованы на наличие их микротрубочкицитоскелета 29,аксонального транспорта30,31и регенерации19,32,полярности нейронов24,33,34,поведения и старения35,36  и многие другие нейронные процессы. Мы использовали нейроны PLM для оценки динамики микротрубочек и ориентации in vivo в трансгенном экспрессирующую EBP-2::GFP под промотером mec-4.

Для проверки стационарной динамики микротрубочек мы выбрали червей, выражающих Pmec-4-EBP-2::GFP reporter. Черви были установлены в полистирольных шариках по 0,1 мкм на 10% агарозных прокладках. Крышка была добавлена осторожно, и черви были изображены на вращающемся дисковом микроскопе. Нейроны PLM были центрированы и сфокусированы на 63x и визуализированы с частотой кадров 3,3 кадра в секунду. Передний отроц PLM показал, что большинство комет отдаляется от тела клетки, тогда как задний отрощения показал двунаправленное движение комет(рисунок 1). Исходя из направления комет, передний отроц PLM содержит униполярные плюс-концевые микротрубочки, в то время как задний отроток имеет смешанную полярность (плюс и минус-конец) микротрубочек(рисунок 2)24.

В качестве применения анализа мы исследовали динамику микротрубочек и ориентацию в регенерирующих аксонах PLM-нейронов. Предыдущие исследования установили методы лазерной опосредообразующей аксотомии с использованием различных типов лазеров, включая УФ, наносекундные, пикосекундные и фемтосекундные лазеры31,37,38,39,40,41,42,43. Для этого исследования мы использовали фемтосекундный лазер для разрыва переднего от процесса PLM-нейронов43. После травмы черви были извлечены на посеянные пластины NGM. Затем черви были сфотозированы в нескольких временных точках после травмы для наблюдения комет EBP-2::GFP. Через 2 ч после травмы был виден разорванный аксон, однако количество комет резко сократилось по сравнению с неповредимым аксоном. Через 11 ч после травмы аксоны вызвали реакцию регенерации в виде аксонального отрастания, где наблюдалось большое количество комет EBP-2::GFP(рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1:Наблюдение и анализ комет EBP. (A) Схема PLM-нейрона, показывающая его положение по отношению к анатомии червя. (B) Точка отсчета выбирается в соответствии с типом нейрона. При этом клеточное тело PLM-нейрона служит ориентиром для областей, представляющих интерес в передних или задних отростках. Кометы (пурпурные круги) видны в виде пункта в теле клетки, передних и задних отростков PLM-нейрона. Сегментированная линия, прослеживающая интересующий нейрит (передний отромент), рисуется для извлечения кимографа. (C) Типичная рентабельность инвестиций может быть преобразована в кимограф, который представляет собой изображение расстояния-времени с диагональными следами, представляющими движущиеся кометы. Что касается тела клетки, то кометы с плюс-концом прослеживаются в синюсом цвете, тогда как минус-концевые кометы прослеживаются в розовом цвете. Для пространственной привязки сегментированная рентабельность инвестиций представлена поверх необработанного кимографа. (D) Параметры измерения включают ширину, высоту, угол и длину следа, которые могут быть преобразованы в параметры микротрубочек. (E) Параметры анализа извлекаются из параметров измерения ширины, высоты и угла трассировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

Figure 2
Рисунок 2:Стационарная динамика микротрубочек в АКСОНЕ PLM. (A) Снимки репрезентативного временного ряда комет EBP-2::GFP в нейронах PLM, показывающие некоторые кометы EBP-2::GFP (цветные стрелки) в переднем и заднем отростках нейрона PLM. (B) Две области в переднем процессе (ROI-A и ROI-B) преобразуются в кимографы, в которых следы, соответствующие кометам, отмеченным в 2(A). Следы были закодированы цветом и числом относительно движущихся комет в 2(A). Нижняя графическая панель представляет наблюдаемые следы, различимые в зависимости от направления их движения. Плюс концевые кометы отмечены в синюсом, тогда как минусовые концевые кометы отмечены розовым цветом. Для справки, расположение тела клетки изображено внизу. (C) ROI-C в заднем отроце преобразуется в кимографы со следами, соответствующими движущимся кометам в заднем отроще на рисунке 2(A). Самая правая панель представляет собой следы плюсового конца и конца минуса относительно положения тела ячейки, отмеченного внизу. Обратите внимание, что большинство следов в аксональных областях (ROI-A и ROI-B) отдаляются от тела клетки, представляя собой микротрубочки с плюсовым концом (синие следы). Напротив, в заднем отроще (ROI-C) следы двунаправленные, представляющие смешанную полярность с плюсовыми (синие следы) и минус-концем (розовые следы) микротрубочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.  

Figure 3
Рисунок 3:Микротрубочки при аксональной регенерации в PLM-нейронах.   (A) Схематическое изображение процедуры аксотомии с использованием фемтосекундного лазера. Лазер создает травму с последующим инициированием роста. Основные реакции регенерации оцениваются как слияние типа 1, слияние типа 2 и рероулинг аксонов. (B) Репрезентативные изображения PLM-нейронов, экспрессирующих EBP-2::GFP у непоранеженных (0 ч), аксотомизированных (2 ч после аксотомии) и условиях роста (11 ч после аксотомии). Рентабельность инвестиций, прослеживаемая для кимографов, была отмечена на изображениях. (C) Репрезентативные кимографы аксональных областей, прослеживаемые на неповрежденных, поврежденных, отрастающих и плавленых аксонах типа 1. Обратите внимание, что количество комет EBP-2::GFP значительно уменьшилось в поврежденных аксонах, за которым последовало их устойчивое движение (увеличение длины и продолжительности роста) в отрастающих аксонах. Отдельные следы могут быть количественно определены и классифицированы в соответствии с их направлением (синие и розовые следы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,46,47. Большая часть этой информации была получена с помощью анализов in vitro, таких как показания рассеяния света свободного и полимеризованного тубулина, анализы роста микротрубочек из флуоресцентного тубулина и т. Д.48. В то время как живое наблюдение флуоресцентных и нефлуоресцентных микротрубочек возможно в тонких клетках, измерения динамики микротрубочек in vivo являются сложными.

Используя этот трансгенный штамм, другие сенсорные нейроны, такие как PVM, ALM и AVM, также могут быть оценены для ориентации микротрубочек. Описанные здесь процедуры визуализации и анализа могут быть адаптированы к другим типам нейронов у C. elegans с соответствующим репортером трансгенным, однако вариабельность динамики кометы по разным нейронам ожидается49,50,51,52. Этот метод также применим к ненейрональным типам клеток у C. elegans53,54,55,56. В ненейрональных типах клеток, таких как эпидермис или эмбрион, динамика микротрубочек наблюдается в двух измерениях53,54,55,56. Для таких событий изображения временных рядов проецируются в одно изображение с использованием Z-проекции или стековых разностных изображений для извлечения ROI для кимографов.

Мы заметили, что коммерчески доступные анестетики, такие как гидрохлорид Левамизола, тетрамизол, не подходят для иммобилизации червей, поскольку они резко смягчают динамику кометы. Микробусы на 10% агарозных прокладках являются подходящим выбором для иммобилизации во время визуализации57,58. Однако более длительное воздействие более высокого процента агарозы и микрошахлопов может привести к физическому стрессу для червей. Также желательно довести раствор микрошруна до комнатной температуры перед монтажом, так как холодный шок может привести к изменению динамики микротрубочек59,60,61,62,63. Влага в агарозных подушечках является чувствительным фактором для иммобилизации, так как черви могут высыхать в сушильных агарозных подушечках, а влажные агарозные прокладки могут не ограничивать подвижность червей. Экспериментатор может визуально осмотреть агарозную прокладку на наличие гладкой и выровнженной поверхности перед монтажом64. Процедура монтажа может быть дополнительно улучшена путем уменьшения бактерий, связанных с червями. Поверхностные адгезивные бактерии препятствуют иммобилизации червя, тогда как кишечные бактерии приводят к аутофлуоресценции, которая может закупорить сигнал комет EBP-2: GFP. Поэтому предпочтительнее выращивать червей на свежепосеянных пластинах OP50 и удалять поверхностные бактерии, помещая червей на несеянные пластины NGM или промывая их буфером M9 или плаванием в растворе сахарозы65,66.

Среди параметров наблюдения пространственный и временной масштабы имеют решающее значение для оптимального отбора проб комет28. EBP-2::GFP чувствителен к фотоотбеливающим, поэтому следует предотвратить ненужное воздействие света. Живая визуализация с флуоресцентными зондами также вызывает фототоксическое повреждение из-за производства свободных радикалов. Это может препятствовать динамике микротрубочек и может быть смертельным для червя. Установка сбора с низкой экспозицией может быть использована для обхода проблем фотоотбеливания и фототоксичности. Параметры анализа будут справедливы и для многомерных движений комет, однако необходимо правильно определить точку отсчета.

Каждый из модулей, описанных в этом исследовании, может быть адаптирован к другим репортерам, которые обнаруживают минусовые концы микротрубочек, везикулярную органеллу в аксоне или дендритах и т. Д. Этот метод также может быть применен к другим организмам или тканям с соответствующей системой трансгенеза и визуализации. Информация о динамике микротрубочек действительна в других клеточных процессах, таких как деление клеток, миграция клеток, поддержание клеточной архитектуры и другие процессы на основе микротрубочек. Различные клинические состояния были связаны с организацией и динамикой микротрубочек7,точная информация о которых может усилить фармакологические подходы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (грант No IA/I/13/1/500874) для A.G.-R и гранта От Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB: CRG/2019/002194) для A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Неврология выпуск 177
<em>In vivo</em> Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter