Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Bedömning av mikrotubuledynamik och orientering i Caenorhabditis elegans Neurons

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Ett protokoll för avbildning av de dynamiska mikrotubulerna in vivo med fluorescerande märkt End bindande protein har presenterats. Vi beskrev metoderna för att märka, bild och analysera de dynamiska mikrotubulerna i bakre laterala microtubule (PLM) neuron av C. elegans.

Abstract

I nervceller har microtubule orientering varit en viktig bedömare för att identifiera axoner som har plus-end ut mikrotubuler och dendriter som i allmänhet har blandad orientering. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande reportrar av mikrotubulespetsar avbildade vi de axonal mikrotubulerna. De lokala förändringarna i mikrotubule beteende som initierar axon regenerering efter axotomy kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Denna analys är anpassningsbar till andra nervceller och genetiska bakgrunder för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer.

Introduction

Neuroner har en utarbetad arkitektur med specialiserade fack som dendriter, cellkroppar, axoner och synapser. Neuronal cytoskeleton består av mikrotubuler, mikrofilament och neurofilament och deras distinkta organisation stöder neuronala fack strukturellt och funktionellt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Under årens lopp har microtubule organisation identifierats som en viktig determinant för neuronal polaritet och funktion. Eftersom nervceller genomgår strukturell ombyggnad under utveckling eller regenerering bestämmer mikrotubuledynamiken och orienteringen identiteten, polariserade transporter, tillväxt och utveckling av olika neuronala fack7. Det är därför absolut nödvändigt att bedöma mikrotubuledynamiken och orienteringen in vivo för att korrelera med den neuronala ombyggnadsprocessen.

Mikrotubuler består av protofilament av α och β Tubulin heterodimers med dynamiska plusändar och relativt stabila minus ändar11,12. Upptäckten av plusspetskomplexet och tillhörande slutbindande proteiner har gjort det möjligt för en plattform att bedöma mikrotubuleorganisationen13. Slutbindande proteiner (EBP) associeras tillfälligt med mikrotubuleens växande plusändar och deras associationsdynamik korreleras till tillväxten av mikrotubuleprotofilamenten14,15. På grund av frekvent association och dissociation av plusspetskomplex med mikrotubule visas punktspridningsfunktionen för GFP-märkt EBP som en "komet" i en timelapse-film15,16. Sedan den banbrytande observationen i däggdjursneuroner16, har slutbindande proteiner märkta med fluorescerande proteiner använts för att bestämma mikrotubuledynamiken i olika modellsystem och neurontyper17,18,19,20,21,22,23.

På grund av sitt enkla nervsystem och transparenta kropp har C. elegans visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att studera neuronal ombyggnad under utveckling och regenerering in vivo. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade EBP-2::GFP, vi avbildade mikrotubulerna i PLM-neuron, vilket gjorde det möjligt för oss att bestämma polariteten hos mikrotubulerna i två olika neuriter av denna neuron24. Denna metod möjliggör observation och kvantifiering av EBP-kometer som ett mått på mikrotubuledynamik i olika cellulära sammanhang, till exempel kan de lokala förändringarna i mikrotubulebeteende som initierar axonregenerering efter axotomi bedömas med hjälp av vårt protokoll. Denna analys kan anpassas för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer i olika celltyper och genetiska bakgrunder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reporterstam: Kultur och underhåll

OBS: För att mäta mikrotubuledynamiken och orienteringen i PLM-nervcellerna använde vi maskstammen som uttrycker EBP-2::GFP under den beröringsneurospecifika promotorn mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. Vi använder standardmaskkultur och underhållsmetoder för denna stam27.

  1. Förbered nematodtillväxtmediet (3,0 g/L natriumklorid, 2,5 g/L pepton, 20,0 g/L agar, 10 mg/L-kolesterol (utspädd från en stamlösning på 10 mg/ml)) i vatten och enklav blandningen.
  2. Kyl blandningen kort i 10-15 min innan du kompletterar den med 1 mM kalciumklorid, 1 mM magnesiumsulfat och 25,0 mM kaliumfosfatmonobasiskt pH 6,0.
  3. Häll cirka 9 ml av blandningen i 60 mm petriskålar med en steril dispenser följt av förvaring vid rumstemperatur och sterila förhållanden under en dag och efterföljande förvaring vid 4 °C.
  4. Förbered 50 ml B-buljong (5,0 g/L natriumklorid, 10,0 g/L Bacto-Tryptone), autoklav och kyl ner den innan du vaccinera med en enda koloni av Escherichia coli (OP50-stam).
  5. Odla bakterierna vid 37 °C i 12 timmar. Ta de kylda NGM-plattorna till rumstemperatur för sådd och använd en steriliserad glasspridare gör ett utstryk av OP50-bakterier på NGM-plattan.
  6. Håll de inokulerade NGM-plattorna på 37 °C i 12 timmar, vilket gör det möjligt att bilda en bakteriell gräsmatta för odling av C. elegans. Dessa plattor kan förvaras i en inkubator på 20 °C fram till användning.
  7. Bakre den transgena stammen på de sådda NGM-plattorna.
  8. Sterilisera en platinatrådsplockning på låga och välj 20-25 gravid vuxna hermafroditer för överföring till en nysådd tallrik.
  9. När plattan har överförts, flytta plattan till en inkubator på 20 °C i 1 timme. Extrahera sedan de vuxna från dessa tallrikar. Dessa tallrikar kommer nu att innehålla ägg som är åldersmatchade.
  10. Flytta plattorna till inkubatorn på 20 °C för uppfödning tills de når det utvecklingsstadium av intresse som i detta fall är L4-stadiet 43,5 timmar efter äggläggning. För fler maskar, bakre flera plattor för att undvika trängsel.
  11. I önskat utvecklingsstadium kan dessa maskar monteras för avbildning av EBP-2::GFP-kometer.

2. Provberedning: Montering av maskar för avbildning av EBP-2-kometer

OBS: För att möjliggöra levande observation av EBP-kometer i PLM-nervcellerna monterade vi maskarna på agarose pads för att minimera deras rörlighet utan att äventyra neurons fysiologi. Bland de olika immobiliseringsmetoderna har vi valt 0,1 μm Polystyren pärlor lösning lätt tillgänglig kommersiellt. Vi har beskrivit det monteringsförfarande som används specifikt för EBP-2:GFP-observation.

  1. Förbered en lösning på 10% agarose genom att smälta 0,2 g agarose i 2 ml 1x M9-buffert (0,02 M KH2PO4,0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) i ett 5 mL glasteströr över en flamma. Detta provrör kan enkelt passa in i ett värmeblock som håller agarosen i smält tillstånd fram till användning.
  2. Använd en bredkäftad droppe och dosera en droppe (cirka 100 μL) av denna smälta agarosa över en ren glasrutschbana på 35 mm x 25 mm dimensioner.
  3. Medan det är i smält tillstånd, tryck på droppen med en annan glasrutschbana för att skapa en tunn film av agarosen mellan glasrutschbanorna. Agarosen stelnas som en film på cirka 0,5 - 1,0 mm i tjocklek på cirka 30 sekunder.
  4. När agarosen stelnar håller du den nedre bilden i den icke-dominerande handen och den övre bilden i den dominerande handen. Vänd upp den övre bilden medan du håller den nedre bilden stadig vilket gör att agarose pad håller fast vid en av de två bilderna.
  5. Om den bildade agarosadynan är större än täckplattans storlek (18 mm x 18 mm), trimma sedan kanterna på dynan för att få de önskade dimensionerna för att säkerställa korrekt placering av täckglaset. Dessa agarose pads är för omedelbar användning och får inte lagras.
  6. Inspektera agarosdynan visuellt för en slät yta som är fuktig och lämplig för montering. Om agarosdynan utsätts för luft och torkas, verkar agarosedynans yta skrynklig. I ett sådant scenario, förbered färsk agarose pad som nämns i steg 2-6 i detta avsnitt.
  7. Lägg 2 μL 0,1 μm polystyrenpärlalösning som monteringsmedium på agarosdynan.
  8. Välj 3-4 maskar med hjälp av en platinatrådsplockning och flytta dem till en osedd NGM-platta. Denna process säkerställer avlägsnande av ytbakterier som hindrar immobiliseringen under monteringen.
  9. När maskarna kryper ut ur sina ytbakterier, plocka upp dem för montering med hjälp av en platinatrådplockning och återanvänd dem i droppen av polystyrenpärlor på agarosplattan.
  10. Placera försiktigt ett 18 mm x 18 mm locklip på maskarna. För att förhindra urtagning av de monterade maskarna, flytta inte täckglaset efter placering.
  11. Montera den förberedda bilden på mikroskopet för avbildning.

3. Bildbehandlingsinstallation och förvärv

OBS: EBP-kometer färdas med en ungefärlig hastighet på 0,22 μm/s enligt observerade i däggdjurs- och PLM-nervcellerna C. elegans16,18. För att på bästa sätt prova händelserna i ett tidsförlopp krävs förvärv enligt Nyquistskriterier 28, rumsliga och tidsmässiga skalor på 0,09 μm respektive 0,43 s. För att förhindra fototoxicitet eller fotoblekning använde vi Spinning Disk förvärv. Vi har beskrivit våra inställningar för bildinställning och förvärv nedan.

  1. Ta bilderna med ett inverterat mikroskop utrustat med en snurrande diskenhet och kamera. Aktivera installationen enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Aktivera programvaran som styr installationen.
  3. Eftersom detta är ett inverterat mikroskop, placera bilden med de monterade maskarna på scenen med ett lågt förstoringsmål (5x eller 10x) med täckglaset vänd nedåt.
  4. Ställ in ljusvägen till ögat eller synligt läge som använder belysning från halogenlampa för överförd ljus- och kvicksilverbågslampa för reflekterat ljus.
  5. Fokusera och centrera en mask i visningsfältet under brightfield.
  6. Lägg nedsänkningsoljan och ändra förstoringen till 63x (1,4NA/Olja) och fokusera om masksvansen i det ljusa fältet för PLM-nervcellerna.
  7. Slå på kvicksilverbågslampans fluorescens för en kort omfokusering av PLM-nervcellerna. Placera rätt uppsättning reflektor (AF488) i ljusbanan för visualisering av GFP.
  8. Ställ in mikroskopet på kameraförvärvet genom att rikta ljusbanan mot kameran.
    OBS: Att styra ovan nämnda steg 4-7 genom TFT-skärmen (Thin Film Transistor) är snabbt och förhindrar onödig exponering för belysningen. Alternativt kan du styra belysningen, reflektorn genom programvaran.
  9. Efter fokuseringen av PLM-neuronen i visningsområdet väljer du i programvarugränssnittet belysningen av 488 nm laser med 30% effekt och 300 ms exponering för kameran med Elektron multiplicera (EM) förstärkningsvärde 70. Beroende på reporteruttrycket varierar du dessa parametrar efter behov. Lagra inställningarna som en konfiguration för efterföljande bildsessioner.
  10. Fliken Kanaler lagrar spåren var och en med en specifik belysning och kamerainställning. Det markerade spåret möjliggör en livevisualisering medan spåret måste kryssas på för att få en bild. Markera en kanal med brightfield (DIC) för livevisualisering av maskens svans på arbetsytan. Exemplet är fokuserat och centrerat i arbetsytans liveavbildningsfönster.
  11. Markera kanalen med 488 nm laserexcitation för en snabb fokusering av PLM-neuronen i live-bildfönstret. När du är fokuserad börjar du förvärvet av tidsfördröjningen genom att ställa in tidsserieparametrarna som nämns i nästa steg.
  12. Använd 488 nm laserbelysning och sätt upp ett experiment med tidsserier i 2 minuter och inget tidsintervall mellan bildrutorna. För att upprätthålla de temporala skalor av bildförvärv förvärvade vi endast GFP fluorescens.
  13. Börja förvärvet med fliken Starta experiment. Genom att använda en förstoring på 63x begränsar den rumsliga upplösningen till 0,21 μm som provtas av kameran med pixelstorleken 0,09 μm. Skaffa en tidsfördröjning på 3,3 bildrutor/s för att på bästa sätt prova händelsen. Time lapse-bilden hade 396 tidsramar förvärvade under en varaktighet av 2 minuter. Efter förvärvet sparar du bilden i standardformatet, som senare kan nås av standardprogramvaran eller ImageJ.

4. Observation och analys

  1. Förhandsgranska timelapse-förvärvet i standardprogramvaran eller öppna det i bild J via plugin-programmet Bioformats.
    OBS: Vi har beskrivit processen för bildanalys i bild J.
  2. Installera plugin-programmet Bioformats i ImageJ.
    1. Du kan också exportera standardformatfilen till .tif för filkompatibilitet i ImageJ. Exportfunktionen i ZEN2 resulterar i enskilda bildramar som diskreta .tif filer. Vi undviker denna metod för att förhindra bildandet av ett stort antal filer.
  3. Öppna bilden i '.czi'-format direkt i Bild J genom plugin-programmet "Bioformats". Bilden öppnas som en stack med flera bilder. Om du använder standardprogramvarans "exportfunktion" återskapar du bilderna som en stack med flera bilder med hjälp av följande arbetsflöde i ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
  4. Förhandsgranska bilden som en film med ikonen Spela upp längst ned i bildfönstrets vänstra nedre hörn. Kometer kan ses som ljus mobil punctae i cellkroppen och processer i PLM-neuron. Om kometer är synliga tydligt, fortsätt till steg 8 annars följ steg 5-7 i detta avsnitt.
  5. Konvertera bildens färgprofil med hjälp av uppslagstabellen (LUT) till en gråskalebild: ImageJ-programmet > Image-menyn > Undermenyn Uppslagstabeller > Select Grays.
  6. Invertera LUT-profilen för bilden för enkel visualisering: ImageJ-> Bildmeny > Uppslagstabeller undermeny > Invertera LUT.
  7. Justera bildens ljusstyrka och kontrast för att se kometer: ImageJ-programmet > Bildmenyn > Justera undermeny > Ljusstyrka/Kontrast.
    1. Flytta skjutreglagen För minsta, Högsta, Ljusstyrka och Kontrast för önskad skalning av intensiteterna över bilden. Vi kvantifierade bilderna med kometer synliga tydligt.
  8. Den grundläggande versionen av ImageJ har startverktyg representerade som ikoner. Leta reda på och högerklicka på ikonen med en rad för att öppna en rullgardinsmeny och markera den segmenterade raden. Rita den segmenterade linjen på de regioner av intresse (ROI) med sitt ursprung på eller nära neuronens cellkropp.
    1. För senare överväganden sparar du den segmenterade rad-ROI:t via ROI-chefen med följande arbetsflöde: ImageJ > Analyze > Tools > ROI-chef > Välj den ritade spårningen i bilden och klicka på Lägg till i ROI-chefsfönstret > Mer i ROI-chefsfönstret > Spara.
  9. Innan kymografin genereras, eftersom de rumsliga och tidsmässiga skalorna är olika, tar du bort skalningen för att få måtten i pixlar med hjälp av följande:
    ImageJ > Analysera > Ange skalning > Klicka för att ta bort > Ok.
  10. Om du använder funktionen Reslice under rullgardinsmenyn > Stacks genererar du en kymografi. Kymograph är en representation av den segmenterade ROI i tid. Den vågräta axeln representerar avståndet och den lodräta axeln representerar tiden. De diagonala spåren representerar de rörliga kometer. I allmänhet tar kymografin bildens färgprofil annars en färgprofil enligt beskrivningen i föregående steg 5-6 för visualisering av diagonala spår.
  11. Om du använder funktionen Rak linje i listrutan i linjeverktyget (se steg 9 i det här avsnittet) drar du raka linjer över vart och ett av de diagonala spåren och lägger till dem i ROI-chefen.
  12. Gå till Ange mått under fliken Analysera och välj Parametrar för medelintensitet och begränsning av rektangel för att mäta spåren.
  13. I ROI-chefsfönstret klickar du på Mått som öppnar ett resultatfönster som ger genomsnittlig intensitet för ROI,X- och Y-koordinaterna för linjespåren, Bredd, Höjd, Vinkel och Längden på linjespåren. Det här fönstret kan sparas som ett .csv format och senare importeras till ett dataanalysprogram.
  14. I kalkylbladsprogrammet öppnas resultatfönstret med värdena fördelade i rader och kolumner. De relevanta värdena är spårens bredd, höjd och vinkel. Bredden ger spårets förskjutning, höjden ger varaktigheten och vinkeln representerar vektorn. Eftersom bredd- och höjdvärdena finns i pixlar multiplicerar du dem med de rumsliga respektive temporala skalorna för att erhålla de vanliga mätbara parametrarna.
  15. Eftersom kymografins vänstra sida är proximal för cellkroppen, klassificerar kometer i plus-end-out respektive minus-end-out (dvs. bort från cellkroppen respektive mot cellkroppen). Klassificera vinklar mellan 1° till -89° och -91° till -179° som plus-end-out respektive minus-end-out. Sortera data från flera kymografier i ett kalkylblad för en studie och representerar statistiskt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett representativt exempel har vi beskrivit in vivo observation av EBP kometer i steady-state och regenerera axons av PLM nervceller. PLM-nervceller ligger i maskens svansregion med en lång främre process som bildar en synaps och en kort bakre process. PLM-nervceller växer i den främre bakre riktningen nära epidermis och är ansvariga för den milda beröringskänslan i maskarna. På grund av deras förenklade struktur, och mottaglighet för bildbehandling och mikrokirurgi, PLM nervceller har undersökts utförligt för deras microtubule cytoskeleton29,axonal transport30,31, och regenerering19,32, neuronal polaritet24,33,34, beteende och åldrande35,36  och många andra neuronala processer. Vi använde PLM nervceller för att bedöma microtubule dynamik och orientering in vivo i en transgen uttrycker EBP-2::GFP under mec-4 promotorn.

För att kontrollera mikrotubulernas steady-state dynamik plockade vi maskarna som uttryckte Pmec-4-EBP-2::GFP-reportern. Maskarna monterades i 0,1 μm polystyrenpärlor på 10% agarose pads. Täckglaset lades till försiktigt och maskarna avbildades på spinndiskmikroskopet. PLM nervcellerna var centrerade och fokuserade på 63x och avbildas med en bildhastighet på 3,3 bilder per sekund. Plm:s främre process visade att en majoritet av kometer rörde sig bort från cellkroppen, medan den bakre processen visade en dubbelriktad rörelse av kometer (figur 1). Baserat på kometerns riktning innehåller PLM:s främre process unipolära mikrotubuler med plus-end-out medan den bakre processen har blandad polaritet (plus och minus-end-out) av mikrotubuler(figur 2)24.

Som en tillämpning av analysen utforskade vi mikrotubuledynamiken och orienteringen i de regenererande axonerna av PLM-nervceller. Tidigare studier har fastställt metoder för lasermedi axotomi med olika typer av lasrar inklusive, UV, nanosekund, picosecond och femtosekundlasrar31,37,38,39,40,41,42,43. För denna studie använde vi en femtosekonslaser för att bryta den främre processen hos PLM-neuronerna43. Efter skadan återfanns maskarna på sådda NGM-plattor. Maskarna avbildades sedan vid flera tidpunkter efter skada för observation av EBP-2::GFP kometer. Vid 2 h efter skada, en avhuggen axon var synlig dock, kometer minskade drastiskt i antal jämfört med en oskadd axon. Vid 11 h efter skada har axonerna framkallat ett regenereringssvar i form av axonal återväxt där ett stort antal EBP-2::GFP-kometer observerades (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Observation och analys av EBP-kometer. A) Schematisk av PLM-neuron som visar sin position med avseende på maskens anatomi. B) Referenspunkten väljs enligt neurontypen. I detta fall fungerar cellkroppen i PLM-neuronen som referenspunkt för de regioner som är av intresse för främre eller bakre processer. Kometer (magenta cirklar) är synliga som punctae i cellkroppen, främre och bakre processer av PLM neuron. En segmenterad linje som spårar neuriten av intresse (främre processen) ritas för att extrahera en kymografi. c) En typisk ROI kan omvandlas till en kymografi som är en avståndsbild med diagonala spår som representerar de rörliga kometer. När det gäller cellkroppen spåras de plus-end-out kometer i cyan medan minus-end-out kometer spåras i rosa. För rumslig referens representeras den segmenterade ROI ovanpå den råa kymografen. (D) Mätparametrarna inkluderar bredd, höjd, vinkel och längd på spårningen som kan översättas till mikrotubuleparametrar. e) Analysparametrar extraheras från mätparametrarna bredd, höjd och vinkel för spåren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. 

Figure 2
Figur 2:Mikrotubulernas steady-state-dynamik i PLM-axonen. a) Ögonblicksbilder av en representativ tidsserie av EBP-2::GFP-kometer i PLM-nervcellerna som visar några av EBP-2::GFP-kometer (färgade pilar) i PLM-neuronens främre och bakre processer. B) Två regioner i den främre processen (ROI-A och ROI-B) omvandlas till kymografier där de spår som motsvarar de kometer som är märkta i punkt 2 A. Spåren har färgats och nummer kodats med avseende på de rörliga kometer i 2(A). Nedre grafiska panelen representerar de observerade spåren som utmärks baserat på deras rörelseriktning. Plus slut kometer är markerade i cyan medan minus slut kometer är markerade i rosa. Som referens avbildas cellkroppens placering längst ner. C) ROI-C i den bakre processen omvandlas till kymografierna med spår som motsvarar de rörliga kometer som är i efterhand i figur 2A. Den högra panelen representerar plussluts- och minusslutspåren med avseende på cellkroppens position markerad längst ner. Observera att de flesta spår i axonalregionerna (ROI-A och ROI-B) rör sig bort från cellkroppen som representerar plus-end-out mikrotubuler (cyanspår). Tvärtom, i den bakre processen (ROI-C) är spåren dubbelriktade som representerar den blandade polariteten med plus (cyanspår) och minus-end-out (rosa spår) mikrotubuler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.  

Figure 3
Figur 3: Mikrotubuler under axonal regenerering i PLM-nervceller.   A) Schematisk representation av axotomi förfarandet med hjälp av en femtosekon laser. Lasern skapar en skada följt av initieringen av återväxten. Stora regenereringssvar poängsätts som typ 1 fusion, typ 2 fusion och återväxt axoner. (B) Representativa bilder av PLM-nervceller som uttrycker EBP-2::GFP i de oskadda (0 h), axotomerade (2 h post axotomy) och återväxt villkor (11 h post axotomy). Roi som spåras för kymografierna har markerats på bilderna. C) Representativa kymographs av axonal regioner spåras på oskadade, skadade, återväxt och typ 1 smält axoner. Observera att antalet EBP-2::GFP-kometer minskade avsevärt i de skadade axonerna följt av deras robusta rörelse (ökad tillväxtlängd och varaktighet) i återväxt axon. Enskilda spår kan kvantifieras och klassificeras enligt deras riktning (cyan och rosa spår). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att förstå mikrotubuledynamiken har varit ett centralt fokus inom området cytoskeletal forskning genom åren. Mikrotubuler genomgår nukleation och katastrof tillsammans med en kontinuerlig process av dynamisk instabilitet44,45,46,47. Mycket av denna information har erhållits genom in vitro-analyser som ljusspridningsutläsningar av fritt vs polymeriserat tubulin, mikrotubuletillväxtanalyser från fluorescerande tubulin, etc.48. Medan levande observation av fluorescerande och icke-fluorescerande mikrotubuler är genomförbar i tunna celler, är in vivo-mätningar av mikrotubuledynamik utmanande.

Med hjälp av denna transgena stam kan andra beröringsneuroner som PVM, ALM och AVM också bedömas för mikrotubuleorienteringen. De avbildnings- och analysprocedurer som beskrivs här kan anpassas till andra neurontyper i C. elegans med en lämplig reporter transgen, men variationen i kometdynamiken över olika nervceller förväntas49,50,51,52. Denna metod är också tillämplig på icke-neuronala celltyper i C. elegans53,54,55,56. I icke-neuronala celltyper som epidermis eller embryo observeras mikrotubuledynamiken i tvådimensioner 53,54,55,56. För sådana händelser projiceras bilder av tidsserien i en enda bild med Z-projektion eller Stack-differensbilder för att extrahera ROI för kymografierna.

Vi observerade att de kommersiellt tillgängliga bedövningsmedel som Levamisole hydroklorid, Tetramisole är inte lämpliga för immobilisering av maskarna eftersom de dämpar kometdynamiken drastiskt. Mikrober på 10% agarose pads är ett lämpligt val för immobilisering underbildbehandling 57,58. Längre exponering för en högre andel agaros och mikrober kan dock leda till fysisk stress för maskarna. Det är också lämpligt att ta mikroberlösningen till rumstemperatur innan du monterar eftersom kall chock kan leda till en förändring i mikrotubuledynamiken59,60,61,62,63. Fukt i agarose pads är en känslig faktor för immobilisering, eftersom maskar kan bli uttorkade i torktumlare agarose pads och fuktiga agarose pads kanske inte begränsar maskarnas rörlighet. Experimenteraren kan visuellt inspektera agarosdynan för slät och jämn yta innan montering64. Monteringsproceduren kan förbättras ytterligare genom att minska bakterierna i samband med maskarna. Ytpåhäftande bakterier hindrar immobiliseringen av masken medan tarmbakterierna resulterar i autofluorescens som kan blockera signalen från EBP-2::GFP-kometer. Så det är att föredra att odla maskarna på nysådda OP50-plattor och ta bort ytbakterierna genom att sätta maskarna på osedda NGM-plattor eller tvätta dem med M9-buffert eller flyt i sackaroslösning65,66.

Bland observationsparametrarna är de rumsliga och tidsmässiga skalorna avgörande för att optimalt prova kometer28. EBP-2:GFP är känsligt för fotoblekning, vilket innebär att onödig exponering för ljus bör förhindras. Levande avbildning med fluorescerande sonder orsakar också fototoxiska skador på grund av produktion av fria radikaler. Detta kan hämma mikrotubuledynamiken och kan vara dödligt för masken. En anskaffningsinställning med låg exponering kan användas för att kringgå problemen med fotoblekning och fototoxicitet. Analysparametrarna kommer också att vara giltiga för flerdimensionella kometrörelser, men man måste bestämma referenspunkten korrekt.

Var och en av de moduler som beskrivs i denna studie kan anpassas till andra reportrar som upptäcker minusändarna på mikrotubuler, en fordonsorganell inom axon eller dendriter etc. Denna teknik kan också tillämpas på andra organismer eller vävnader med lämpligt transgenes- och bildsystem. Informationen om mikrotubuledynamik är giltig i andra cellulära processer som celldelning, cellmigrering, underhåll av cellarkitektur och andra mikrotubulebaserade processer. Olika kliniska tillstånd har associerats med microtubule organisation ochdynamik 7, korrekt information som kan stärka farmakologiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Yishi Jin och Andrew Chisholm för det initiala stödet och den stam som används i studien. Bakteriestammen OP50 utnyttjades kommersiellt från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi tackar också Dharmendra Puri för standardiseringen av de experimentella förfarandena. Studien finansieras genom kärnbidrag från National Brain Research Centre (med stöd av Institutionen för bioteknik, Govt. av Indien), DBT/Wellcome förtroende Indien allians tidig sortkarriärbidrag (anslag # IA/E/18/1/504331) till S.D., Wellcome förtroende-DBT Indien allians intermediate anslag (anslag # IA/I/13/1/500874) till A.G.-R och ett anslag från vetenskap och iscensätta forskningsnämnden (SERB: CRG/2019/002194) till A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Neurovetenskap nummer 177
<em>In vivo</em> Bedömning av mikrotubuledynamik och orientering <em>i Caenorhabditis elegans</em> Neurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter