Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Vurdering av mikrotubul dynamikk og orientering i Caenorhabditis elegans Neurons

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

En protokoll for avbildning av de dynamiske mikrotubulene in vivo ved hjelp av fluorescerende merket End bindingsprotein har blitt presentert. Vi beskrev metodene for å merke, bilde og analysere de dynamiske mikrotubulene i Posterior lateral microtubule (PLM) neuron av C. elegans.

Abstract

I nevroner har mikrotubul orientering vært en viktig takstmann for å identifisere axoner som har pluss-end ut mikrotubuler og dendritter som generelt har blandet orientering. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende reportere av mikrotubule tips, avbildet vi de axonale mikrotubulene. De lokale endringene i mikrotubul oppførsel som starter axon regenerering etter axotomi kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen. Denne analysen er tilpasningsdyktig til andre nevroner og genetisk bakgrunn for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser.

Introduction

Nevroner har en forseggjort arkitektur med spesialiserte rom som dendritter, cellelegemer, axoner og synapser. Den nevronale cytoskjelettet består av mikrotubuler, mikrofilamenter og nevrofilamenter, og deres distinkte organisasjon støtter nevronrommene strukturelt og funksjonelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Gjennom årene har mikrotubul organisasjon blitt identifisert som en nøkkeldeterminant for nevronal polaritet og funksjon. Når nevroner gjennomgår strukturell ombygging under utvikling eller regenerering, bestemmer mikrotubuldynamikken og orienteringen identiteten, polarisert transport, vekst og utvikling av ulike nevronrom7. Det er derfor viktig å vurdere mikrotubuldynamikken og orienteringsinvoen for å korrelere med den nevronale ombyggingsprosessen.

Mikrotubuler består av protofilaments av α og β Tubulin heterodimers med dynamiske pluss ender og relativt stabile minus ender11,12. Oppdagelsen av plussspisskomplekset og tilhørende sluttbindingsproteiner har gjort det mulig for en plattform å vurdere mikrotubuleorganisasjonen13. Sluttbindingsproteiner (EBP) forbigående forbinder med de voksende pluss endene av mikrotubulen, og deres assosiasjonsdynamikk er korrelert med veksten av mikrotubule-protofilamentene14,15. På grunn av hyppig assosiasjon og dissosiasjon av plussspisskompleks med mikrotubulen, vises punktspredningsfunksjonen til GFP-merket EBP som en "komet" i en timelapse-film15,16. Siden den banebrytende observasjonen i pattedyr nevroner16, sluttbinding proteiner merket med fluorescerende proteiner har blitt brukt til å bestemme mikrotubule dynamikken på tvers av ulike modellsystemer og neuron typer17,18,19,20,21,22,23.

På grunn av sitt enkle nervesystem og gjennomsiktige kropp har C. elegans vist seg å være et utmerket modellsystem for å studere nevronal ombygging under utvikling og regenerering in vivo. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodet EBP-2::GFP, avbildet vi mikrotubulene i PLM-nevronen, noe som tillot oss å bestemme mikrotubulens polaritet i to forskjellige neuritter i denne nevron24. Denne metoden tillater observasjon og kvantifisering av EBP-kometene som et mål på mikrotubuldynamikk i forskjellige cellulære sammenhenger, for eksempel kan de lokale endringene i mikrotubuladferd som initierer axonregenerering etter axotomi vurderes ved hjelp av vår protokoll. Denne analysen kan tilpasses for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser i ulike celletyper og genetisk bakgrunn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reporter belastning: Kultur og vedlikehold

MERK: For å måle mikrotubuldynamikken og orienteringen i PLM-nevronene brukte vi ormstammen som uttrykte EBP-2::GFP under berøring nevronspesifikk promotor mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. Vi bruker standard ormkultur og vedlikeholdsmetoder for denne stammen27.

  1. Forbered Nematode Growth Medium (3,0 g/l natriumklorid, 2,5 g/l pepton, 20,0 g/l agar, 10 mg/l kolesterol (fortynnet fra en lageroppløsning på 10 mg/ml)) i vann og autoklaver blandingen.
  2. Avkjøl blandingen kort i 10-15 min før du supplerer den med 1 mM kalsiumklorid, 1 mM magnesiumsulfat og 25,0 mM kaliumfosfatmonobasisk pH 6,0.
  3. Hell rundt 9 ml av blandingen i 60 mm Petri-retter ved hjelp av en steril dispenser etterfulgt av lagring ved romtemperatur og sterile forhold i en dag og etterfølgende lagring ved 4 °C.
  4. Forbered 50 ml B-buljong (5,0 g/l natriumklorid, 10,0 g/l Bacto-Tryptone), autoklav og avkjøl den før den inokuleres med en enkelt koloni av Escherichia coli (OP50-stamme).
  5. Kultur bakteriene ved 37 °C i 12 timer. Bring de nedkjølte NGM-platene til romtemperatur for såing og bruk av en sterilisert glassspreder gjør et smør av OP50-bakterier på NGM-platen.
  6. Hold de inokulerte NGM-platene ved 37 °C i 12 timer, noe som gjør det mulig å danne en bakteriell plen for dyrking av C. elegans. Disse platene kan lagres i en 20 °C inkubator til bruk.
  7. Bak den transgene belastningen på de frøede NGM-platene.
  8. Steriliser et platinatrådplukk på flammen og velg 20-25 gravid voksne hermafroditter for overføring til en nyseedet tallerken.
  9. Når den er overført, skift platen til en 20 °C inkubator i 1 time. Trekk deretter ut de voksne fra disse platene. Disse platene vil nå inneholde egg som er alderstilpasset.
  10. Flytt platene til 20 °C inkubatoren for oppdrett til de når utviklingsstadiet av interesse, som i dette tilfellet er L4-stadiet på 43,5 timer etter egglegging. For flere ormer, bak flere plater for å unngå trengsel.
  11. På ønsket utviklingsstadium kan disse ormene monteres for avbildning av EBP-2::GFP-kometene.

2. Prøvepreparering: Montering av ormer for avbildning av EBP-2 kometer

MERK: For å muliggjøre live observasjon av EBP-kometene i PLM-nevronene, monterte vi ormene på agarose pads for å minimere mobiliteten mens de ikke kompromitterte nevronens fysiologi. Blant de ulike immobiliseringsmetodene har vi valgt 0,1 μm Polystyren perleløsning lett tilgjengelig kommersielt. Vi har skissert monteringsprosedyren som brukes spesielt for EBP-2::GFP observasjon.

  1. Forbered en løsning på 10% agarose ved å smelte 0,2 g agarose i 2 ml 1x M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) i et 5 ml glassprøverør over en flamme. Dette reagensglasset kan enkelt passe inn i en varmeblokk som holder agarose i smeltet tilstand til bruk.
  2. Bruk en bredmunnet dropper, dispenser en dråpe (rundt 100 μL) av denne smeltede agarose over en ren glasssklie på 35 mm x 25 mm dimensjoner.
  3. Mens det er i smeltet tilstand, trykk på dråpen med en annen glasssklie for å lage en tynn film av agarose mellom glasssklier. Agarose størkner som en film på rundt 0,5 - 1,0 mm i tykkelse på rundt 30 sekunder.
  4. Når agarose størkner, hold det nederste lysbildet i den ikke-dominerende hånden og det øverste lysbildet i den dominerende hånden. Vend opp det øverste lysbildet mens du holder det nederste lysbildet stødig, noe som resulterer i at agaroseputen fester seg til ett av de to lysbildene.
  5. Hvis den dannede agaroseputen er større enn dekslene (18 mm x 18 mm), må du trimme kantene på puten for å oppnå de nødvendige dimensjonene for å sikre riktig plassering av dekslene. Disse agarose pads er for umiddelbar bruk og ikke å bli lagret.
  6. Inspiser agaroseputen visuelt for en jevn overflate som er fuktig og egnet for montering. Hvis agaroseputen blir utsatt for luft og blir tørket, vises overflaten av agaroseputen rynket. I et slikt scenario, forbered fersk agarose pad som nevnt i trinn 2-6 i denne delen.
  7. På agaroseputen legger du 2 μL 0,1 μm polystyrenperleløsning som monteringsmedium.
  8. Velg 3-4 ormer ved hjelp av et platinatrådplukk og flytt dem til en usett NGM-plate. Denne prosessen sikrer fjerning av overflatebakterier som hindrer immobilisering under montering.
  9. Når ormene kryper ut av overflatebakteriene, plukk dem opp for montering ved hjelp av en platinatrådplukk og resuspender dem i dråpen av polystyrenperler på agaroseputen.
  10. Plasser forsiktig en 18 mm x 18 mm deksler på ormene. For å unngå evisceration av de monterte ormene, ikke flytt dekslene etter plassering.
  11. Monter den klargjorte gliden på mikroskopet for avbildning.

3. Bildeoppsett og oppkjøp

MERK: EBP-kometer reiser med en omtrentlig hastighet på 0,22 μm/s som observert hos pattedyret og PLM-nevronene til C. elegans16,18. For å prøve hendelsene optimalt i et tidsforløpsanskaffelse i henhold tilNyquist-kriteriene 28, er det nødvendig med romlige og tidsmessige skalaer på henholdsvis 0,09 μm og 0,43 s. For å forebygge fototoksisitet eller fotobleaching brukte vi Spinning Disk oppkjøp. Nedenfor har vi beskrevet innstillingene for bildebehandlingsoppsett og -anskaffelse.

  1. Ta bildene ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med en roterende diskenhet og kamera. Slå på oppsettet i henhold til produsentens instruksjon.
  2. Slå på programvaren som styrer oppsettet.
  3. Siden dette er et invertert mikroskop, plasser lysbildet med de monterte ormene på scenen med et lavt forstørrelsesmål (5x eller 10x) med dekslene vendt ned.
  4. Sett opp lysbanen til øye- eller synlig modus som bruker belysning fra halogenlampe for overført lys og kvikksølvbuelampe for reflektert lys.
  5. Fokuser og midtstill en orm i visningsfeltet under brightfield.
  6. Sett nedsenkningsoljen og endre forstørrelsen til 63x (1,4NA / olje) og fokuser ormhalen på nytt i brightfield for PLM-nevronene.
  7. Slå på fluorescensen til kvikksølvbuelampen for en kort refokusering av PLM-nevronene. Plasser riktig sett med reflektor (AF488) i lysbanen for visualisering av GFP.
  8. Sett mikroskopet til kameraanskaffelsen ved å lede lysbanen til kameraet.
    MERK: Det er raskt å kontrollere ovennevnte trinn 4-7 gjennom Thin Film Transistor (TFT)-skjermen på mikroskopet og forhindrer unødvendig eksponering for belysningen. Alternativt kan du kontrollere belysningen, reflektoren gjennom programvaren.
  9. Etter fokusering av PLM-nevronen i visningsfeltet, velger du belysningen av 488 nm laser med 30% effekt og 300 ms eksponering for kameraet med Electron Multiplisering (EM) gevinstverdi 70. Avhengig av reporteruttrykket varierer du disse parameterne etter behov. Lagre innstillingene som en konfigurasjon for påfølgende bildebehandlingsøkter.
  10. Kanalfanen lagrer sporene hver med en bestemt belysnings- og kamerainnstilling. Det uthevede sporet tillater en live visualisering, mens for å skaffe seg et bilde må sporet krysses av. Uthev en kanal med brightfield (DIC) for live visualisering av halen på ormen i arbeidsområdet. Eksemplet er fokusert og midtstilt i det direkte bildevinduet i arbeidsområdet.
  11. Fremhev kanalen med 488 nm lasereksitasjon for en rask fokusering av PLM-nevronen i live bildevinduet. Når du er fokusert, starter du anskaffelsen av tidsforløpet ved å angi tidsserieparameterne som nevnt i neste trinn.
  12. Bruk 488 nm laserbelysning, sett opp et eksperiment med tidsserier i 2 minutter og ingen tidsintervall mellom rammene. For å opprettholde de tidsmessige skalaene for bildeanskaffelse, kjøpte vi bare GFP fluorescens.
  13. Start anskaffelsen ved hjelp av kategorien Start eksperiment. Bruk av en 63x forstørrelse begrenser den romlige oppløsningen til 0,21 μm som er samplet av kameraet med pikselstørrelsen 0,09 μm. Skaff deg et tidsforløp på 3,3 bilder/s for å prøve hendelsen optimalt. Tidsforløpbildet hadde 396 tidsrammer oppnådd over en varighet på 2 minutter. Etter oppkjøpet lagrer du bildet i standardformatet, som senere kan nås av standardprogramvaren eller ImageJ.

4. Observasjon og analyse

  1. Forhåndsvis oppkjøpet av tidsforløpet i standardprogramvaren, eller åpne den i Bilde J gjennom plugin-modulen Bioformats.
    MERK: Vi har beskrevet prosessen med bildeanalyse i bilde J.
  2. Installer plugin-modulen Bioformats ImageJ.
    1. Du kan også eksportere standardformatfilen til .tif for filkompatibilitet i ImageJ. Eksportfunksjonen i ZEN2 resulterer i individuelle delbilder av bildet som atskilte .tif filer. Vi unngår denne metoden for å forhindre dannelse av et stort antall filer.
  3. Åpne bildet i '.czi' -format direkte i Bilde J gjennom plugin-modulen 'Bioformats'. Bildet åpnes som en stakk med flere bilder. Hvis du bruker "eksport"-funksjonen for standardprogramvaren, må du rekonstituere bildene som en flerbildestakk ved hjelp av følgende arbeidsflyt i ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
  4. Forhåndsvis bildet som en film ved hjelp av Spill av-ikonet nederst til venstre i bildevinduet. Kometene kan sees på som lyse mobile punctae i cellekroppen og prosessene til PLM-nevronen. Hvis kometene er synlige tydelig, går du videre til trinn 8 ellers følger du trinn 5-7 i denne delen.
  5. Konverter fargeprofilen for bildet ved hjelp av oppslagstabellen (LUT) til et gråtonebilde: ImageJ-program > Bilde -menyen > undermenyen Oppslagstabeller > Velg gråtoner.
  6. Inverter LUT-profilen for bildet for enkel visualisering: ImageJ-program > Bilde-menyen > undermenyen Oppslagstabeller > Inverter LUT.
  7. Juster lysstyrken og kontrasten i bildet for å se kometene: ImageJ-programmet > Bilde-menyen > Juster undermenyen > Lysstyrke/kontrast.
    1. Flytt glidebryterne for Minimum, Maksimum, Lysstyrke og Kontrast for ønsket skalering av intensitetene over bildet. Vi kvantifiserte bildene med kometer synlige tydelig.
  8. Den grunnleggende versjonen av ImageJ har oppstartsverktøy representert som ikoner. Finn og høyreklikk ikonet med en linje for å åpne en rullegardinmeny, og velg Segmentert linje. Tegn den segmenterte linjen på interesseområdene (ROI) med opprinnelsen på eller i nærheten av nevronens cellelegeme.
    1. Hvis du vil ha senere vurderinger, kan du lagre den segmenterte linje-avkastningen via ROI-lederen ved hjelp av følgende arbeidsflyt: ImageJ > Analyze > Tools > ROI manager > Velg den tegnede sporingen i bildet, og klikk Legg til i ROI manager-vinduet > Mer i ROI Manager-vinduet > Lagre.
  9. Før du genererer kymografien, da de romlige og tidsmessige skalaene er forskjellige, fjern skaleringen for å oppnå målingene i piksler ved hjelp av følgende:
    ImageJ > Analyser > Angi skala > Klikk for å fjerne skalaen > OK.
  10. Bruk Reslice-funksjonen under rullegardinmenyen Bilde > stabler, og generer en kymografi. Kymografen er en representasjon av den segmenterte avkastningen i tide. Den vannrette aksen representerer avstanden, og den loddrette aksen representerer klokkeslettet. De diagonale sporene representerer de bevegelige kometene. Vanligvis tar kymografien fargeprofilen til bildet ellers tilordner en fargeprofil som beskrevet i de foregående trinnene 5-6 for visualisering av diagonale spor.
  11. Bruk Straight line-funksjonen i rullegardinmenyen til linjeverktøyet (se trinn 9 i denne delen) til å tegne rette linjer over hver av de diagonale sporene og føye dem til i ROI-lederen.
  12. Gå til Angi mål på Analyser-fanen, og velg Parametere for gjennomsnittlig intensitet og markeringsfirkant for måling av sporene.
  13. I ROI manager-vinduet klikker du mål som åpner et resultatvindu som gir gjennomsnittlig intensitet for avkastning, X- og Y-koordinatene for linjesporene, bredde, høyde, vinkel og lengde på linjesporene. Dette vinduet kan lagres som et .csv-format og senere importeres til et dataanalyseprogram.
  14. I regnearkprogrammet åpnes resultatvinduet med verdiene fordelt i rader og kolonner. De relevante verdiene er bredden, høyden og vinkelen på sporene. Bredden gir forskyvningen av sporet, høyden gir varigheten og vinkelen representerer vektoren. Ettersom bredde- og høydeverdiene er i piksler, multipliserer du dem med henholdsvis romlige og tidsmessige skalaer for å oppnå standard målbare parametere.
  15. Ettersom venstre side av kymografen er proksimal for cellekroppen, avhengig av vinkelen, klassifiserer kometer til henholdsvis plus-end-out eller minus-end-out (dvs. vekk fra cellekroppen eller mot cellekroppen). Kliff vinkler mellom 1° til -89° og -91° til -179° som henholdsvis plus-end-out og minus-end-out. Samle data fra flere kymografier i et regneark for en studie og statistisk representere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et representativt eksempel har vi beskrevet in vivo observasjon av EBP-kometene i steady-state og regenererende axoner av PLM-nevronene. PLM-nevroner ligger i haleområdet av ormen med en lang fremre prosess som danner en synapse og en kort bakre prosess. PLM-nevroner vokser i den fremre bakre retningen nær epidermis og er ansvarlige for den milde berøringsfølelsen i ormene. På grunn av deres forenklede struktur, og egnethet til avbildning og mikrokirurgi, har PLM-nevroner blitt grundig undersøkt for deres mikrotubule cytoskeleton29, axonal transport30,31og regenerering19,32, nevronal polaritet24,33,34, oppførsel og aldring35,36  og mange andre nevronprosesser. Vi brukte PLM-nevroner for å vurdere mikrotubuldynamikk og orientering in vivo i en transgen som uttrykte EBP-2::GFP under mec-4-promotoren.

For å sjekke mikrotubulenes steady-state-dynamikk, valgte vi ormene som uttrykte Pmec-4-EBP-2::GFP-reporteren. Ormene ble montert i 0,1 μm polystyrenperler på 10% agarose pads. Dekslene ble lagt forsiktig til, og ormene ble avbildet på det spinnende diskmikroskopet. PLM-nevronene var sentrert og fokusert på 63x og avbildet med en bildefrekvens på 3,3 bilder per sekund. Den fremre prosessen med PLM viste et flertall av kometene som beveget seg bort fra cellekroppen, mens den bakre prosessen viste en toveis bevegelse av kometene (figur 1). Basert på kometenes retning inneholder den fremre prosessen til PLM unipolare pluss-end-out mikrotubuler mens bakre prosess har blandet polaritet (pluss og minus-end-out) av mikrotubuler (Figur 2)24.

Som en anvendelse av analysen utforsket vi mikrotubuldynamikken og orienteringen i de regenererende axonene til PLM-nevroner. Tidligere studier har etablert metoder for lasermediert axotomi ved hjelp av ulike typer lasere, inkludert UV, nanosekund, picosecond og femtosecond lasere31,37,38,39,40,41,42,43. For denne studien brukte vi en femtosecond laser for å kutte den fremre prosessen til PLM nevronene43. Etter skaden ble ormene gjenvunnet på frø NGM-plater. Ormene ble deretter avbildet på flere tidspunkter etter skade for observasjon av EBP-2::GFP-kometer. Ved 2 timer etter skade var en avkuttet axon synlig, men kometene ble drastisk redusert i antall sammenlignet med en uskadet axon. Ved 11 timer etter skade har axonene fremkalt en regenereringsrespons i form av axonal gjenvekst der et stort antall EBP-2::GFP-kometer ble observert (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Observasjon og analyse av KBP-kometer. (A) Skjematisk for PLM-nevronen som viser sin posisjon med hensyn til ormanatomien. (B) Referansepunktet velges i henhold til nevrontypen. I dette tilfellet fungerer plm-nevronens cellelegeme som referansepunkt for regionene av interesse for fremre eller bakre prosesser. Kometer (magenta sirkler) er synlige som punctae i cellekroppen, fremre og bakre prosesser i PLM-nevronen. En segmentert linje som sporer neuritt av interesse (fremre prosess) trekkes for å trekke ut en kymografi. (C) En typisk avkastning kan konverteres til en kymograf som er et avstandstidsbilde med diagonale spor som representerer de bevegelige kometene. Med hensyn til cellekroppen spores pluss-end-out kometene i cyan, mens minus-end-out kometer spores i rosa. For romlig referanse er den segmenterte avkastningen representert på toppen av rå kymografen. (D) Måleparametere inkluderer bredden, høyden, vinkelen og lengden på sporet som kan oversettes til mikrotubulparametere. (E) Analyseparametere trekkes ut fra måleparametrene for bredde, høyde og vinkel på sporene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 2
Figur 2: Steady-state dynamikken i mikrotubulene i PLM axon. (A) Øyeblikksbilder av en representativ tidsserie av EBP-2::GFP-kometer i PLM-nevronene som viser noen av EBP-2::GFP-kometene (fargede piler) i de fremre og bakre prosessene i PLM-nevronen. (B) To regioner i den fremre prosessen (ROI-A og ROI-B) konverteres til kymografier der sporene som tilsvarer kometene merket i 2(A). Sporene har vært farge og nummerkodet med hensyn til de bevegelige kometene i 2 (A). Lavere grafisk panel representerer de observerte sporene som skiller seg ut basert på deres bevegelsesretning. Pluss ende ut kometer er merket med cyan, mens minus ende ut kometer er merket med rosa. For referanse er plasseringen av cellekroppen avbildet nederst. (C) ROI-C i bakre prosess omdannes til kymografiene med spor som tilsvarer de bevegelige kometene i bakre prosess i figur 2(A). Panelet lengst til høyre representerer pluss- og minussluttsporene med hensyn til plasseringen av cellekroppen som er merket nederst. Legg merke til at de fleste sporene i axonalområdene (ROI-A og ROI-B) beveger seg bort fra cellekroppen som representerer pluss-end-out mikrotubuler (cyan spor). Tvert imot, i den bakre prosessen (ROI-C), er sporene toveis som representerer blandet polaritet med pluss (cyan spor) og minus-end-out (rosa spor) mikrotubuler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.  

Figure 3
Figur 3: Mikrotubuler under axonal regenerering i PLM-nevroner.   (A) Skjematisk representasjon av axotomy prosedyren ved hjelp av en femtosecond laser. Laseren skaper en skade etterfulgt av oppstart av gjenveksten. Store regenereringsresponser scores som Type 1-fusjon, Type 2-fusjon og Regrowing-axoner. (B) Representative bilder av PLM-nevroner som uttrykker EBP-2::GFP i de uskadede (0 t), axotomiserte (2 t postaxotomy) og gjenvekstforhold (11 t postaxotomi). Avkastningen som spores for kymoografiene er merket på bildene. (C) Representative kymografier av axonale regioner sporet på de uskadede, skadde, regrowing og Type 1 smeltet aksoner. Legg merke til at antall EBP-2::GFP-kometer betydelig redusert i de skadede axonene etterfulgt av deres robuste bevegelse (økt vekstlengde og varighet) i regrowing axon. Individuelle spor kan kvantifiseres og klassifiseres i henhold til deres retning (cyan og rosa spor). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å forstå mikrotubuldynamikken har vært et sentralt fokus innen cytoskeletal forskning gjennom årene. Mikrotubuler gjennomgår kjernedannelse og katastrofe sammen med en kontinuerlig prosess med dynamisk ustabilitet44,45,46,47. Mye av denne informasjonen er oppnådd gjennom in vitro-analyser som lysspredningsavlesninger av fri vs polymerisert tubulin, mikrotubul vekstanalyser fra fluorescerende tubulin, etc.48. Mens den levende observasjonen av fluorescerende og ikke-fluorescerende mikrotubuler er mulig i tynne celler, er in vivo-målinger av mikrotubuldynamikk utfordrende.

Ved hjelp av denne transgene stammen kan andre berøringsnevroner som PVM, ALM og AVM også vurderes for mikrotubul orientering. Avbildnings- og analyseprosedyrene som er beskrevet her, kan tilpasses andre nevrontyper i C. elegans med en passende reportertransgen, men variasjonen i kometdynamikken på tvers av forskjellige nevroner forventes49,50,51,52. Denne metoden gjelder også for ikke-nevronale celletyper i C. elegans53,54,55,56. I ikke-nevronale celletyper som epidermis eller embryo observeres mikrotubuldynamikken i to dimensjoner53,54,55,56. For slike hendelser projiseres bilder av tidsserien til ett enkelt bilde ved hjelp av Z-projeksjons- eller stakkforskjellsbilder for å trekke ut avkastningen for kymografiene.

Vi observerte at de kommersielt tilgjengelige bedøvelsene som Levamisolhydroklorid, Tetramisole ikke er egnet for immobilisering av ormene da de demper kometdynamikken drastisk. Mikrober på 10% agarose pads er et passende valg for immobilisering under bildebehandling57,58. Imidlertid kan lengre eksponering for en høyere prosentandel av agarose og mikrober føre til fysisk stress for ormene. Det anbefales også å bringe mikrobeadløsningen til romtemperatur før montering, da kaldt støt kan føre til en endring i mikrotubuldynamikken59,60,61,62,63. Fuktighet i agarose pads er en følsom faktor for immobilisering, da ormer kan bli tørket i tørketrommel agarose pads og fuktige agarose pads kan ikke begrense ormenes mobilitet. Eksperimentet kan visuelt inspisere agaroseputen for jevn og nivellert overflate før montering64. Monteringsprosedyren kan videre forbedres ved å redusere bakteriene forbundet med ormene. Overflatetilklypende bakterier hindrer immobilisering av ormen, mens tarmbakteriene resulterer i autofluorescence som kan okkludere signalet fra EBP-2::GFP-kometer. Så det er å foretrekke å dyrke ormene på nysåede OP50-plater og fjerne overflatebakteriene ved å sette ormene på usette NGM-plater eller vaske dem med M9-buffer eller flyte i sukroseoppløsning65,66.

Blant observasjonsparametrene er de romlige og tidsmessige skalaene avgjørende for å optimalt prøve kometene28. EBP-2::GFP er følsom for fotobleking, og unødvendig eksponering for lys bør forhindres. Levende avbildning med fluorescerende sonder forårsaker også fototoksisk skade på grunn av produksjon av frie radikaler. Dette kan hemme mikrotubuldynamikken og kan være dødelig for ormen. Et oppkjøpsoppsett med lav eksponering kan brukes til å omgå problemene med fotobleaching og fototoksisitet. Analyseparametrene vil også være gyldige for flerdimensjonale kometbevegelser, men man må bestemme referansepunktet riktig.

Hver av modulene beskrevet i denne studien kan tilpasses andre reportere som oppdager minus endene av mikrotubuler, en vesikulær organelle i axon eller dendritter, etc. Denne teknikken kan også brukes på andre organismer eller vev med passende transgenese og bildebehandlingssystem. Informasjonen om mikrotubuldynamikk er gyldig i andre cellulære prosesser som celledeling, cellemigrering, vedlikehold av cellulær arkitektur og andre mikrotubulebaserte prosesser. Ulike kliniske forhold har vært forbundet med mikrotubul organisasjon ogdynamikk 7, nøyaktig informasjon som kan styrke farmakologiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Yishi Jin og Andrew Chisholm for den første støtten og belastningen som ble brukt i studien. Bakteriestammen OP50 ble kommersielt benyttet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi takker også Dharmendra Puri for standardiseringen av eksperimentelle prosedyrer. Studien er finansiert av kjernestipendet til National Brain Research Centre (støttet av Institutt for bioteknologi, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1/504331) til S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1/500874) til A.G.-R og et stipend fra Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) til A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Nevrovitenskap utgave 177
<em>In vivo</em> Vurdering av mikrotubul dynamikk og orientering i <em>Caenorhabditis elegans</em> Neurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter