Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

Abstract

In neuronen is microtubule-oriëntatie een belangrijke beoordelaar geweest om axonen te identificeren die plus-end microtubuli en dendrieten hebben die over het algemeen een gemengde oriëntatie hebben. Hier beschrijven we methoden om de microtubule-dynamiek en -groei te labelen, in beeld te brengen en te analyseren tijdens de ontwikkeling en regeneratie van aanraakneuronen in C. elegans. Met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers van microtubule-tips hebben we de axonale microtubuli in beeld. De lokale veranderingen in microtubulegedrag die axonregeneratie na axotomie initiëren, kunnen met behulp van dit protocol worden gekwantificeerd. Deze test is aanpasbaar aan andere neuronen en genetische achtergronden om de regulatie van microtubulidynamica in verschillende cellulaire processen te onderzoeken.

Introduction

Neuronen hebben een uitgebreide architectuur met gespecialiseerde compartimenten zoals dendrieten, cellichamen, axonen en synapsen. Het neuronale cytoskelet bestaat uit de microtubuli, microfilamenten en neurofilamenten en hun afzonderlijke organisatie ondersteunt de neuronale compartimenten structureel en functioneel1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . In de loop der jaren is microtubule-organisatie geïdentificeerd als een belangrijke determinant van neuronale polariteit en functie. Terwijl neuronen structurele remodellering ondergaan tijdens ontwikkeling of regeneratie, bepalen de microtubule-dynamiek en oriëntatie de identiteit, gepolariseerd transport, groei en ontwikkeling van verschillende neuronalecompartimenten 7. Het is daarom noodzakelijk om de microtubulidynamica en oriëntatie in vivo te beoordelen om te correleren met het neuronale remodelleringsproces.

Microtubuli zijn samengesteld uit protofilamenten van α en β Tubuline heterodimeren met dynamische plus uiteinden en relatief stabiele min uiteinden11,12. De ontdekking van het plus tip-complex en bijbehorende eindbindende eiwitten hebben een platform in staat gesteld om de microtubule-organisatie te beoordelen13. Eindbindende eiwitten (EBP) associëren zich tijdelijk met de groeiende pluspunten van de microtubuli en hun associatiedynamiek is gecorreleerd met de groei van de microtubuli protofilamenten14,15. Vanwege frequente associatie en dissociatie van pluspuntcomplex met de microtubule, verschijnt de puntspreidingsfunctie van GFP-gelabelde EBP als een "komeet" in een timelapse-film15,16. Sinds de baanbrekende observatie in zoogdierneuronen16, zijn eindbindende eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten gebruikt om de dynamiek van microtubuli te bepalen in verschillende modelsystemen en neurontypen17,18,19,20,21,22,23.

Vanwege zijn eenvoudige zenuwstelsel en transparante lichaam heeft C. elegans bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn om neuronale remodellering tijdens ontwikkeling en regeneratie in vivo te bestuderen. Hier beschrijven we methoden om de microtubule-dynamiek en -groei te labelen, in beeld te brengen en te analyseren tijdens de ontwikkeling en regeneratie van aanraakneuronen in C. elegans. Met behulp van genetisch gecodeerde EBP-2::GFP hebben we de microtubuli in het PLM-neuron in beeld gesteld, waardoor we de polariteit van de microtubuli in twee verschillende neurieten van dit neuron konden bepalen24. Deze methode maakt observatie en kwantificering van de EBP-kometen mogelijk als een maat voor microtubule-dynamiek in verschillende cellulaire contexten, bijvoorbeeld de lokale veranderingen in microtubulegedrag die axonregeneratie na axotomie initiëren, kunnen worden beoordeeld met behulp van ons protocol. Deze test kan worden aangepast om de regulatie van microtubule-dynamica in verschillende cellulaire processen in verschillende celtypen en genetische achtergronden te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reporter strain: Cultuur en onderhoud

OPMERKING: Om de microtubule-dynamiek en oriëntatie in de PLM-neuronen te meten, gebruikten we de wormstam die EBP-2::GFP tot expressie brengen onder de aanraking neuron specifieke promotor mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. We gebruiken standaard wormkweek- en onderhoudsmethoden voor deze stam27.

  1. Bereid het groeimedium van de nematoden (3,0 g/l natriumchloride, 2,5 g/l pepton, 20,0 g/l agar, 10 mg/l cholesterol (verdund uit een stamoplossing van 10 mg/ml)) in water en autoclaaf het mengsel.
  2. Koel het mengsel kort gedurende 10-15 minuten voordat u het aanvult met 1 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumsulfaat en 25,0 mM kaliumfosfaat monobasische pH 6.0.
  3. Giet ongeveer 9 ml van het mengsel in petrischalen van 60 mm met behulp van een steriele dispenser, gevolgd door opslag bij kamertemperatuur en steriele omstandigheden gedurende een dag en daaropvolgende opslag bij 4 °C.
  4. Bereid 50 ml B-bouillon (5,0 g /l natriumchloride, 10,0 g / l Bacto-trypton), autoclaaf en koel het af voordat u het inent met een enkele kolonie Escherichia coli (OP50-stam).
  5. Kweek de bacteriën bij 37 °C gedurende 12 uur. Breng de gekoelde NGM-platen op kamertemperatuur voor zaaien en maak met behulp van een gesteriliseerde glazen spreader een uitstrijkje van OP50-bacteriën op de NGM-plaat.
  6. Houd de ingeënte NGM-platen gedurende 12 uur op 37 °C, waardoor een bacterieel gazon kan worden gedraaid voor het kweken van C. elegans. Deze platen kunnen tot gebruik in een incubator van 20 °C worden bewaard.
  7. Kweek de transgene spanning op de gezaaide NGM-platen.
  8. Steriliseer een platina draadplectrum op vlam en pluk 20-25 gravid volwassen hermafrodieten voor overdracht op een vers gezaaide plaat.
  9. Eenmaal overgebracht, verschuift u de plaat gedurende 1 uur naar een incubator van 20 °C. Haal vervolgens de volwassenen uit deze platen. Deze platen zullen nu eieren bevatten die op leeftijd zijn afgestemd.
  10. Verschuif de platen naar de incubator van 20 °C voor opfok totdat ze het ontwikkelingsstadium van belang bereiken, in dit geval het L4-stadium op 43,5 uur na het leggen van eieren. Voor meer wormen, achter meerdere platen om drukte te voorkomen.
  11. In het gewenste ontwikkelingsstadium kunnen deze wormen worden gemonteerd voor beeldvorming van de EBP-2::GFP-kometen.

2. Monstervoorbereiding: Montage van wormen voor beeldvorming van EBP-2-kometen

OPMERKING: Om live observatie van de EBP-kometen in de PLM-neuronen mogelijk te maken, monteerden we de wormen op agarose-pads om hun mobiliteit te minimaliseren zonder de fysiologie van het neuron in gevaar te brengen. Onder de verschillende immobilisatiemethoden hebben we gekozen voor een 0,1 μm polystyreenkraaloplossing die in de handel verkrijgbaar is. We hebben de montageprocedure beschreven die specifiek wordt gebruikt voor EBP-2::GFP-observatie.

  1. Bereid een oplossing van 10% agarose door 0,2 g agarose te smelten in 2 ml 1x M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) in een glazen reageerbuis van 5 ml boven een vlam. Deze reageerbuis past gemakkelijk in een verwarmingsblok dat de agarose in de gesmolten toestand houdt tot gebruik.
  2. Gebruik een druppelaar met brede mond en deel een druppel (ongeveer 100 μL) van deze gesmolten agarose af over een schone glasplaat van 35 mm x 25 mm afmetingen.
  3. Terwijl het zich in de gesmolten toestand bevindt, drukt u op de druppel met een andere glasplaat om een dunne film van de agarose tussen de glasplaten te maken. De agarose stolt als een film van ongeveer 0,5 - 1,0 mm dikte in ongeveer 30 seconden.
  4. Zodra de agarose stolt, houdt u de onderste dia in de niet-dominante hand en de bovenste dia in de dominante hand. Klap de bovenste dia omhoog terwijl u de onderste dia stabiel houdt, waardoor de agarose-pad aan een van de twee dia's blijft plakken.
  5. Als de gevormde agarose-pad groter is dan de coverlip-grootte (18 mm x 18 mm), knip dan de randen van de pad bij om de vereiste afmetingen te verkrijgen om de juiste plaatsing van de coverslip te garanderen. Deze agarose pads zijn voor direct gebruik en niet op te slaan.
  6. Inspecteer de agarose pad visueel voor een glad oppervlak dat vochtig is en geschikt voor montage. Als de agarose pad wordt blootgesteld aan lucht en droog wordt, lijkt het oppervlak van de agarose pad gerimpeld. Bereid in een dergelijk scenario een nieuwe agarose pad zoals vermeld in stap 2-6 van deze sectie.
  7. Leg op de agarosepad 2 μL 0,1 μm polystyreenkraaloplossing als bevestigingsmedium.
  8. Kies 3-4 wormen met behulp van een platina draadplectrum en verschuif ze naar een ongeplaatste NGM-plaat. Dit proces zorgt voor de verwijdering van oppervlaktebacteriën die de immobilisatie tijdens de montage belemmeren.
  9. Zodra de wormen uit hun oppervlaktebacteriën kruipen, pak je ze op voor montage met behulp van een platina draadplectrum en resuspend in de druppel polystyreen kralen op de agarose pad.
  10. Plaats voorzichtig een afdeklip van 18 mm x 18 mm op de wormen. Om te voorkomen dat de ingewanden van de gemonteerde wormen worden weggedoopt, moet u de afdeklip na plaatsing niet verplaatsen.
  11. Monteer de voorbereide dia op de microscoop voor beeldvorming.

3. Imaging setup en acquisitie

OPMERKING: EBP-kometen reizen met een geschatte snelheid van 0,22 μm / s zoals waargenomen in de zoogdier- en PLM-neuronen van C. elegans16,18. Om de gebeurtenissen in een timelapse-acquisitie optimaal te bemonsteren volgens Nyquist-criteria28,zijn ruimtelijke en temporele schalen van respectievelijk 0,09 μm en 0,43 s vereist. Voor het voorkomen van fototoxiciteit of fotobleaching hebben we Spinning Disk acquisitie gebruikt. We hebben onze imaging setup en acquisitie instellingen hieronder beschreven.

  1. Leg de beelden vast met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een draaiende schijfeenheid en camera. Schakel de installatie in volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Schakel de software in die de installatie regelt.
  3. Omdat dit een omgekeerde microscoop is, plaatst u de dia met de gemonteerde wormen op het podium met een lage vergrotingsobjector (5x of 10x) met de coverslip naar beneden gericht.
  4. Stel het lichtpad naar het oog of de zichtbare modus in die verlichting van halogeenlamp gebruikt voor doorlatend licht en kwikbooglamp voor gereflecteerd licht.
  5. Focus en centreer een worm in het weergaveveld onder het heldere veld.
  6. Plaats de dompelolie en verander de vergroting naar 63x (1,4NA / olie) en richt de wormstaart opnieuw in het brightfield voor de PLM-neuronen.
  7. Schakel de fluorescentie van de kwikbooglamp in voor een korte herfocus van de PLM-neuronen. Plaats de juiste set reflector (AF488) in het lichtpad voor de visualisatie van GFP.
  8. Stel de microscoop in op de camera-acquisitie door het lichtpad naar de camera te richten.
    OPMERKING: Het besturen van de bovengenoemde stappen 4-7 via het Thin Film Transistor (TFT) scherm van de microscoop is snel en voorkomt onnodige blootstelling aan de verlichting. U kunt ook de verlichting, reflector via de software regelen.
  9. Na het scherpstellen van het PLM-neuron in het weergaveveld, selecteert u in de software-interface de verlichting van 488 nm laser met 30% vermogen en 300 ms belichting voor de camera met Electron Multiplying (EM) gain value 70. Afhankelijk van de expressie van de verslaggever, varieert u deze parameters indien nodig. Sla de instellingen op als configuratie voor volgende beeldbewerkingssessies.
  10. Op het tabblad Kanalen worden de tracks opgeslagen met elk een specifieke verlichtings- en camera-instelling. De gemarkeerde track maakt een live visualisatie mogelijk, terwijl voor het verkrijgen van een afbeelding de track moet worden aangevinkt. Markeer een kanaal met brightfield (DIC) voor live visualisatie van de staart van de worm in de werkruimte. Het voorbeeld is gericht en gecentreerd in het live imaging-venster van de werkruimte.
  11. Markeer het kanaal met 488 nm laserexcitatie voor een snelle scherpstelling van het PLM-neuron in het live imaging-venster. Eenmaal gefocust, begin je met de timelapse-acquisitie door de tijdreeksparameters in te stellen zoals vermeld in de volgende stap.
  12. Gebruik 488 nm laserverlichting om een experiment op te zetten met tijdreeksen gedurende 2 minuten en zonder tijdsinterval tussen frames. Om de temporele schalen van beeldacquisitie te behouden, hebben we alleen GFP-fluorescentie verkregen.
  13. Begin op het tabblad Experiment starten met de acquisitie. Het gebruik van een vergroting van 63x beperkt de ruimtelijke resolutie tot 0,21 μm die door de camera wordt bemonsterd met een pixelgrootte van 0,09 μm. Verkrijg een timelapse van 3,3 frames/s om het evenement optimaal te bemonsteren. De timelapse-afbeelding had 396 tijdframes verkregen over een duur van 2 minuten. Sla na de acquisitie de afbeelding op in het standaardformaat, dat later kan worden geopend door de standaardsoftware of ImageJ.

4. Observatie en analyse

  1. Bekijk een voorbeeld van de timelapse-acquisitie in de standaardsoftware of open deze in Afbeelding J via de Bioformats-plug-in.
    OPMERKING: We hebben het proces van beeldanalyse beschreven in afbeelding J.
  2. Installeer de Bioformats-plug-in in ImageJ.
    1. U kunt ook het standaardindelingsbestand exporteren naar .tif voor bestandscompatibiliteit in ImageJ. Exportfunctie in ZEN2 resulteert in individuele frames van het beeld als discrete .tif bestanden. We vermijden deze methode om de vorming van een groot aantal bestanden te voorkomen.
  3. Open de afbeelding in '.czi'-formaat rechtstreeks in Afbeelding J via de plug-in 'Bioformats'. De afbeelding wordt geopend als een stapel met meerdere afbeeldingen. Als u de functie 'exporteren' van de standaardsoftware gebruikt, reconstitueert u de afbeeldingen als een stapel met meerdere afbeeldingen met behulp van de volgende workflow in ImageJ: ImageJ-programma > afbeeldingsmenu > submenu Stapels > afbeeldingen om te stapelen.
  4. Bekijk een voorvertoning van de afbeelding als een film met het pictogram Afspelen in de linkerbenedenhoek van het afbeeldingsvenster. De kometen kunnen worden gezien als heldere mobiele punctae in het cellichaam en processen van het PLM-neuron. Als de kometen duidelijk zichtbaar zijn, gaat u verder met stap 8, anders volgt u de stappen 5-7 van deze sectie.
  5. Converteer het kleurprofiel van de afbeelding met behulp van de OPZOEKTABEL (LUT) naar een grijswaardenafbeelding: het programma ImageJ > menu Afbeelding > submenu Opzoektabellen > Selecteer grijswaarden.
  6. Het LUT-profiel van de afbeelding omkeren voor eenvoudige visualisatie: ImageJ-programma > het menu Afbeelding > submenu Opzoektabellen > LUT omkeren.
  7. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan voor het zien van de kometen: ImageJ-programma > menu Afbeelding > Het submenu aanpassen > Helderheid / contrast.
    1. Verplaats de schuifregelaars Minimum, Maximum, Helderheid en Contrast voor de gewenste schaling van de intensiteiten in de afbeelding. We kwantificeerden de beelden met kometen die duidelijk zichtbaar waren.
  8. De basisversie van ImageJ heeft opstarttools die worden weergegeven als pictogrammen. Zoek en klik met de rechtermuisknop op het pictogram met een regel om een vervolgkeuzemenu te openen en selecteer de gesegmenteerde regel. Teken de gesegmenteerde lijn op de gebieden van belang (ROI) met zijn oorsprong op of nabij het cellichaam van het neuron.
    1. Voor latere overwegingen slaat u de roi van de gesegmenteerde regel op via de ROI-manager met behulp van de volgende workflow: ImageJ > Analyseer > tools > ROI-manager > Selecteer de getekende tracering in de afbeelding en klik op Toevoegen in het venster ROI-manager > Meer in het venster ROI-manager > Opslaan.
  9. Voordat u de kymograaf genereert, verwijdert u de schaal, omdat de ruimtelijke en temporele schalen verschillend zijn, de schaal om de metingen in pixels te verkrijgen met behulp van het volgende:
    AfbeeldingJ > Analyseren > Stel schaal in > Klik om schaal te verwijderen > OK.
  10. Gebruik de functie Reslice onder het vervolgkeuzemenu Afbeelding > stapels en genereer een kymograaf. De kymograaf is een weergave van de gesegmenteerde ROI in de tijd. De horizontale as vertegenwoordigt de afstand en de verticale as vertegenwoordigt de tijd. De diagonale sporen stellen de bewegende kometen voor. Over het algemeen neemt de kymograaf het kleurprofiel van de afbeelding anders een kleurprofiel toe zoals beschreven in de voorgaande stappen 5-6 voor de visualisatie van de diagonale sporen.
  11. Teken met de functie Rechte lijn in het vervolgkeuzemenu van het gereedschap Lijn (zie stap 9 van deze sectie) rechte lijnen over elk van de diagonale sporen en voeg deze toe in de ROI-manager.
  12. Ga op het tabblad Analyseren naar Metingen instellen en selecteer Parameters gemiddelde intensiteit en begrenzelingenrecht voor het meten van de sporen.
  13. Klik in het venster ROI-beheer op Meten om een resultaatvenster te openen dat de gemiddelde intensiteit van de ROI, de X- en Y-coördinaten van de lijnsporen, breedte, hoogte, hoek en lengte van de lijnsporen oplevert. Dit venster kan worden opgeslagen als een .csv-indeling en later worden geïmporteerd in een gegevensanalyseprogramma.
  14. In het spreadsheetprogramma wordt het resultatenvenster geopend met de waarden verdeeld in rijen en kolommen. De relevante waarden zijn de breedte, hoogte en hoek van de sporen. De breedte geeft de verplaatsing van het spoor, hoogte geeft de duur en de hoek vertegenwoordigt de vector. Aangezien de breedte- en hoogtewaarden in pixels zijn, vermenigvuldigt u deze met respectievelijk de ruimtelijke en temporele schalen om de standaard meetbare parameters te verkrijgen.
  15. Omdat de linkerkant van de kymograaf proximaal is aan het cellichaam, classificeren kometen, afhankelijk van de hoek, in plus-end-out of minus-end-out (d.w.z. weg van het cellichaam of naar het cellichaam, respectievelijk). Classificeer hoeken tussen 1° tot -89° en -91° tot -179° als respectievelijk plus-end-out en minus-end-out. Verzamel gegevens uit meerdere kymografen in een spreadsheet voor een onderzoek en geef deze statistisch weer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Als representatief voorbeeld hebben we in vivo observatie van de EBP-kometen in de steady-state en regenererende axonen van de PLM-neuronen beschreven. PLM-neuronen bevinden zich in het staartgebied van de worm met een lang voorste proces dat een synaps en een kort posterieur proces vormt. PLM-neuronen groeien in de voorste-achterste richting dicht bij de opperhuid en zijn verantwoordelijk voor het zachte aanrakingsgevoel in de wormen. Vanwege hun vereenvoudigde structuur en vatbaarheid voor beeldvorming en microchirurgie, zijn PLM-neuronen uitgebreid onderzocht voor hun microtubule cytoskelet29, axonaal transport30,31en regeneratie19,32,neuronale polariteit24,33,34, gedrag en veroudering35,36  en vele andere neuronale processen. We gebruikten PLM-neuronen om de dynamiek en oriëntatie van microtubuli in vivo te beoordelen in een transgene expressie EBP-2::GFP onder de mec-4 promotor.

Voor het controleren van de steady-state dynamiek van de microtubuli, kozen we de wormen die de Pmec-4-EBP-2::GFP reporter tot expressie brengen. De wormen werden gemonteerd in 0,1 μm polystyreen kralen op 10% agarose pads. De coverslip werd voorzichtig toegevoegd en de wormen werden afgebeeld op de draaiende schijfmicroscoop. De PLM-neuronen waren gecentreerd en gericht op 63x en afgebeeld met een framesnelheid van 3,3 frames per seconde. Het voorste proces van de PLM toonde aan dat een meerderheid van de kometen zich van het cellichaam afbewoog, terwijl het achterste proces een bidirectionele beweging van de kometen liet zien (figuur 1). Op basis van de richting van de kometen bevat het voorste proces van de PLM unipolaire plus-end-out microtubuli, terwijl het posterieure proces gemengde polariteit (plus en minus-end-out) van microtubuli heeft (Figuur 2)24.

Als toepassing van de assay onderzochten we de microtubule-dynamiek en oriëntatie in de regenererende axonen van PLM-neuronen. Eerdere studies hebben methoden voor lasermedite axotomie vastgesteld met behulp van verschillende soorten lasers, waaronder UV-, nanoseconde-, picoseconde- en femtosecondelasers31,37,38,39,40,41,42,43. Voor deze studie gebruikten we een femtoseconde laser om het voorste proces van de PLM-neuronen te verbreken43. Na de verwonding werden de wormen teruggevonden op gezaaide NGM-platen. De wormen werden vervolgens op meerdere tijdstippen na verwonding in beeld brengen voor de observatie van EBP-2::GFP-kometen. Om 2 uur na verwonding was een afgehakt axon zichtbaar, maar de kometen waren drastisch in aantal verminderd in vergelijking met een ongedeerd axon. Na 11 uur na verwonding hebben de axonen een regeneratierespons opgewekt in de vorm van axonale hergroei waarbij een groot aantal EBP-2::GFP-kometen werd waargenomen(figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Observatie en analyse van EBP-kometen. (A) Schema van het PLM-neuron dat zijn positie ten opzichte van de anatomie van de worm weergeeft. (B) Het referentiepunt wordt gekozen volgens het neurontype. In dit geval dient het cellichaam van het PLM-neuron als referentiepunt voor de gebieden van belang in anterieure of posterieure processen. Kometen (magenta cirkels) zijn zichtbaar als punctae in het cellichaam, anterieure en posterieure processen van het PLM neuron. Een gesegmenteerde lijn die de neuriet van belang volgt (anterieur proces) wordt getrokken om een kymograaf te extraheren. (C) Een typische ROI kan worden omgezet in een kymograaf, een afstandsbeeld met diagonale sporen die de bewegende kometen vertegenwoordigen. Met betrekking tot het cellichaam worden de plus-end-out kometen getraceerd in cyaan, terwijl minus-end-out kometen worden getraceerd in roze. Voor ruimtelijke referentie wordt de gesegmenteerde ROI weergegeven bovenop de ruwe kymograaf. (D) Meetparameters omvatten de breedte, hoogte, hoek en lengte van het spoor die kunnen worden vertaald in microtubuleparameters. (E) Analyseparameters worden geëxtraheerd uit de meetparameters van breedte, hoogte en hoek van de sporen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Figure 2
Figuur 2: Steady-state dynamica van de microtubuli in het PLM-axon. (A) Snapshots van een representatieve tijdreeks van EBP-2::GFP-kometen in de PLM-neuronen die enkele van de EBP-2::GFP-kometen (gekleurde pijlen) in de voorste en achterste processen van het PLM-neuron laten zien. (B) Twee gebieden in het voorste proces (ROI-A en ROI-B) worden omgezet in kymografen waarin de sporen overeenkomen met de kometen gemarkeerd in 2(A). De sporen zijn kleur- en cijfergecodeerd ten opzichte van de bewegende kometen in 2(A). Onderste grafische paneel vertegenwoordigt de waargenomen sporen die worden onderscheiden op basis van hun richting van de beweging. Plus end out kometen zijn gemarkeerd in cyaan, terwijl minus end out kometen zijn gemarkeerd in roze. Ter referentie wordt de locatie van het cellichaam onderaan weergegeven. (C) ROI-C in het posterieure proces wordt omgezet in de kymografen met sporen die overeenkomen met de bewegende kometen in het posterieure proces in figuur 2(A). Het meest rechtse paneel vertegenwoordigt de plus- en minuiteindesporen ten opzichte van de positie van het cellichaam dat onderaan is gemarkeerd. Merk op dat de meeste sporen in de axonale gebieden (ROI-A en ROI-B) zich van het cellichaam verplaatsen en plus-end-out microtubuli (cyaansporen) vertegenwoordigen. Integendeel, in het posterieure proces (ROI-C) zijn de sporen bidirectioneel en vertegenwoordigen ze de gemengde polariteit met plus (cyaansporen) en minus-end-out (roze sporen) microtubuli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.  

Figure 3
Figuur 3: Microtubuli tijdens axonale regeneratie in PLM-neuronen.   (A) Schematische weergave van de axotomieprocedure met behulp van een femtosecondelaser. De laser creëert een verwonding gevolgd door het initiëren van de hergroei. Belangrijke regeneratieresponsen worden gescoord als Type 1-fusie, Type 2-fusie en Hergroeiende axonen. (B) Representatieve beelden van PLM-neuronen die EBP-2::GFP tot expressie brengen bij niet-gewonden (0 uur), axotomiseerd (2 uur na axotomie) en hergroeiomstandigheden (11 uur na axotomie). De ROI die voor de kymografen is getraceerd, is gemarkeerd op de afbeeldingen. (C) Representatieve kymografen van axonale gebieden die zijn getraceerd op de ongedeerde, gewonde, opnieuw groeiende en type 1 gefuseerde axonen. Merk op dat het aantal EBP-2::GFP-kometen significant afnam in de gewonde axonen, gevolgd door hun robuuste beweging (verhoogde groeilengte en -duur) in het hergroeiende axon. Individuele sporen kunnen worden gekwantificeerd en geclassificeerd volgens hun richting (cyaan en roze sporen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het begrijpen van de microtubule-dynamiek is door de jaren heen een belangrijk aandachtspunt geweest op het gebied van cytoskeletonderzoek. Microtubuli ondergaan nucleatie en catastrofe samen met een continu proces van dynamische instabiliteit44,45,46,47. Veel van deze informatie is verkregen door in vitro assays zoals lichtverstrooiingsuitlezingen van vrije versus gepolymeriseerde tubuline, microtubule groei assays van fluorescerende tubuline, enz.48. Hoewel de live observatie van fluorescerende en niet-fluorescerende microtubuli haalbaar is in dunne cellen, zijn in vivo metingen van microtubulidynamica een uitdaging.

Met behulp van deze transgene stam kunnen andere aanraakneuronen zoals PVM, ALM en AVM ook worden beoordeeld op de oriëntatie van de microtubuli. De beeldvormings- en analyseprocedures die hier worden beschreven, kunnen worden aangepast aan andere neurontypen in C. elegans met een geschikte reportertransgeen, maar de variabiliteit in de komeetdynamiek over verschillende neuronen wordt verwacht49,50,51,52. Deze methode is ook van toepassing op niet-neuronale celtypen in C. elegans53,54,55,56. In niet-neuronale celtypen zoals epidermis of embryo wordt de microtubulidynamica waargenomen in twee dimensies53,54,55,56. Voor dergelijke gebeurtenissen worden afbeeldingen van de tijdreeksen in één beeld geprojecteerd met behulp van Z-projectie- of Stack-verschilafbeeldingen om de ROI voor de kymografen te extraheren.

We hebben waargenomen dat de in de handel verkrijgbare anesthetica zoals Levamisole hydrochloride, Tetramisole niet geschikt zijn voor immobilisatie van de wormen omdat ze de komeetdynamiek drastisch verzwakken. Microbeads op 10% agarose pads zijn een geschikte keuze voor immobilisatie tijdens beeldvorming57,58. Langere blootstelling aan een hoger percentage agarose en microbeads kan echter leiden tot fysieke stress voor de wormen. Het is ook raadzaam om de microbead-oplossing op kamertemperatuur te brengen voordat deze wordt gemonteerd, omdat koude schokken kunnen leiden tot een verandering in de microtubuledynamiek59,60,61,62,63. Vocht in de agarose pads is een gevoelige factor voor immobilisatie, omdat wormen kunnen worden uitgedroogd in droger agarose pads en vochtige agarose pads de mobiliteit van wormen niet kunnen beperken. De experimentator kan de agarose pad visueel inspecteren voor een glad en vlak oppervlak voordat hij64 monteert. De montageprocedure kan verder worden verbeterd door de bacteriën die bij de wormen horen te verminderen. De oppervlakteklevende bacteriën belemmeren de immobilisatie van de worm, terwijl de darmbacteriën resulteren in autofluorescentie die het signaal van EBP-2::GFP-kometen kan uitschakelen. Het heeft dus de voorkeur om de wormen op vers gezaaide OP50-platen te laten groeien en de oppervlaktebacteriën te verwijderen door de wormen op niet-gezaaide NGM-platen te plaatsen of ze te wassen met M9-buffer of floatatie in sucrose-oplossing65,66.

Onder de observatieparameters zijn de ruimtelijke en temporele schalen van cruciaal belang om de kometen optimaal te bemonsteren28. EBP-2::GFP is gevoelig voor fotobleaching, dus onnodige blootstelling aan licht moet worden voorkomen. Live beeldvorming met fluorescerende sondes veroorzaakt ook fototoxische schade als gevolg van de productie van vrije radicalen. Dit kan de microtubule-dynamiek belemmeren en kan dodelijk zijn voor de worm. Een instelling voor het verkrijgen van lage belichting kan worden gebruikt om de problemen van fotobleaching en fototoxiciteit te omzeilen. De analyseparameters zijn ook geldig voor multidimensionale komeetbewegingen, maar men moet het referentiepunt correct bepalen.

Elk van de modules die in deze studie worden beschreven, kan worden aangepast aan andere verslaggevers die de minus-uiteinden van microtubuli, een vesiculair organel in axon of dendrieten, enz. Detecteren. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere organismen of weefsels met een geschikt transgenese- en beeldvormingssysteem. De informatie van microtubuledynamica is geldig in andere cellulaire processen zoals celdeling, celmigratie, onderhoud van cellulaire architectuur en andere op microtubuli gebaseerde processen. Verschillende klinische aandoeningen zijn in verband gebracht met microtubule organisatie en dynamica7, waarvan nauwkeurige informatie farmacologische benaderingen kan versterken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

We bedanken Yishi Jin en Andrew Chisholm voor de eerste ondersteuning en de soort die in de studie is gebruikt. De bacteriestam OP50 werd commercieel gebruikt door Caenorhabditis Genetics Center (CGC) gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We danken ook Dharmendra Puri voor de standaardisatie van de experimentele procedures. De studie wordt gefinancierd door de kernsubsidie van het National Brain Research Centre (ondersteund door het Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1 / 504331) aan S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1 / 500874) aan A.G.-R en een subsidie van Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) naar A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 177
<em>In vivo</em> Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in <em>Caenorhabditis elegans</em> neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter