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Neuroscience

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62744
Automatic Translation
1, 1
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

Abstract

En las neuronas, la orientación de los microtúbulos ha sido un evaluador clave para identificar los axones que tienen microtúbulos y dendritas de extremo superior que generalmente tienen una orientación mixta. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Usando reporteros fluorescentes codificados genéticamente de puntas de microtúbulos, tomamos imágenes de los microtúbulos axonales. Los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración del axón después de la axotomía se pueden cuantificar utilizando este protocolo. Este ensayo es adaptable a otras neuronas y antecedentes genéticos para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares.

Introduction

Las neuronas tienen una arquitectura elaborada con compartimentos especializados como dendritas, cuerpos celulares, axones y sinapsis. El citoesqueleto neuronal está constituido por los microtúbulos, microfilamentos y neurofilamentos y su organización distinta soporta los compartimentos neuronales estructural y funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . A lo largo de los años, la organización de los microtúbulos se ha identificado como un determinante clave de la polaridad y función neuronal. A medida que las neuronas experimentan una remodelación estructural durante el desarrollo o la regeneración, la dinámica y la orientación de los microtúbulos determinan la identidad, el transporte polarizado, el crecimiento y el desarrollo de varios compartimentos neuronales7. Por lo tanto, es imperativo evaluar la dinámica y la orientación de los microtúbulos in vivo para correlacionarlos con el proceso de remodelación neuronal.

Los microtúbulos están compuestos por protofilamentos de α y β heterodímeros de Tubulina con extremos más dinámicos y extremos menos relativamente estables11,12. El descubrimiento del complejo de punta más y las proteínas de unión final asociadas han permitido una plataforma para evaluar la organización de los microtúbulos13. Las proteínas de unión al final (EBP) se asocian transitoriamente con los extremos de crecimiento más del microtúbulo y su dinámica de asociación se correlaciona con el crecimiento de los protofilamentos de microtúbulos14,15. Debido a la frecuente asociación y disociación del complejo de punta más con el microtúbulo, la función de dispersión puntual del EBP marcado con GFP aparece como un "cometa" en una película de lapso de tiempo15,16. Desde la observación pionera en neuronas de mamíferos16,las proteínas de unión final marcadas con proteínas fluorescentes se han utilizado para determinar la dinámica de microtúbulos a través de diferentes sistemas modelo y tipos de neuronas17,18, 19,20, 21,22,23.

Debido a su sistema nervioso simple y cuerpo transparente, C. elegans ha demostrado ser un excelente sistema modelo para estudiar la remodelación neuronal durante el desarrollo y la regeneración in vivo. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Utilizando EBP-2::GFP codificado genéticamente, tomamos imágenes de los microtúbulos en la neurona PLM, lo que nos permitió determinar la polaridad de los microtúbulos en dos neuritas diferentes de esta neurona24. Este método permite la observación y cuantificación de los cometas EBP como medida de la dinámica de los microtúbulos en diferentes contextos celulares, por ejemplo, los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración de los axones después de la axotomía se pueden evaluar utilizando nuestro protocolo. Este ensayo se puede adaptar para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares en diversos tipos de células y antecedentes genéticos.

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Protocol

1. Cepa reportera: Cultura y mantenimiento

NOTA: Para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas PLM, utilizamos la cepa de gusano que expresa EBP-2::GFP bajo el promotor específico de la neurona táctil mec-4 (alelo juIs338) 18,25,26. Utilizamos métodos estándar de cultivo y mantenimiento de gusanos para esta cepa27.

  1. Preparar el nematodo growth medium (3,0 g/L de cloruro de sodio, 2,5 g/L de peptona, 20,0 g/L de agar, 10 mg/L de colesterol (diluido de una solución caldo de 10 mg/mL)) en agua y autoclave la mezcla.
  2. Enfríe la mezcla brevemente durante 10-15 min antes de complementarla con 1 mM de cloruro de calcio, 1 mM de sulfato de magnesio y 25.0 mM de fosfato de potasio monobásico pH 6.0.
  3. Vierta alrededor de 9 ml de la mezcla en placas de Petri de 60 mm utilizando un dispensador estéril, seguido de almacenamiento a temperatura ambiente y condiciones estériles durante un día y posterior almacenamiento a 4 °C.
  4. Preparar 50 ml de caldo B (5,0 g/L de cloruro de sodio, 10,0 g/L de bacto-triptona), autoclave y enfriarlo antes de inocular con una sola colonia de Escherichia coli (cepa OP50).
  5. Culta la bacteria a 37 °C durante 12 horas. Lleve las placas NGM refrigeradas a temperatura ambiente para la siembra y, con un esparcidor de vidrio esterilizado, haga un frotis de bacterias OP50 en la placa NGM.
  6. Mantenga las placas NGM inoculadas a 37 °C durante 12 horas, lo que permitirá la formación de un césped bacteriano para el cultivo de C. elegans. Estas placas se pueden almacenar en una incubadora de 20 °C hasta su uso.
  7. Criar la cepa transgénica en las placas NGM secuescas.
  8. Esterilice una púa de alambre de platino en llama y elija 20-25 hermafroditas adultos grávidos para transferirlos a un plato recién sembrado.
  9. Una vez transferida, cambie la placa a una incubadora de 20 °C durante 1 h. Luego, extraiga a los adultos de estas placas. Estas placas ahora contendrán huevos que son compatibles con la edad.
  10. Cambie las placas a la incubadora de 20 ° C para la cría hasta que alcancen la etapa de desarrollo de interés, que en este caso es la etapa L4 a las 43,5 horas después de la puesta de huevos. Para más gusanos, retrovisormente múltiples placas para evitar aglomeraciones.
  11. En la etapa de desarrollo deseada, estos gusanos se pueden montar para obtener imágenes de los cometas EBP-2::GFP.

2. Preparación de la muestra: Montaje de gusanos para la obtención de imágenes de cometas EBP-2

NOTA: Para permitir la observación en vivo de los cometas EBP en las neuronas PLM, montamos los gusanos en almohadillas de agarosa para minimizar su movilidad sin comprometer la fisiología de la neurona. Entre los diversos métodos de inmovilización, hemos elegido una solución de perlas de poliestireno de 0,1 μm fácilmente disponible comercialmente. Hemos esbozado el procedimiento de montaje utilizado específicamente para la observación EBP-2::GFP.

  1. Preparar una solución de agarosa al 10% fundiendo 0,2 g de agarosa en 2 mL de tampón 1x M9 (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) en un tubo de ensayo de vidrio de 5 mL sobre una llama. Este tubo de ensayo puede caber fácilmente en un bloque de calentamiento que mantiene la agarosa en estado fundido hasta su uso.
  2. Usando un gotero de boca ancha, dispense una gota (alrededor de 100 μL) de esta agarosa fundida sobre un portaobjetos de vidrio limpio de dimensiones de 35 mm x 25 mm.
  3. Mientras esté en estado fundido, presione la gota con otro portaobjetos de vidrio para crear una película delgada de la agarosa entre los portaobjetos de vidrio. La agarosa se solidifica como una película de alrededor de 0,5 a 1,0 mm de espesor en unos 30 segundos.
  4. Una vez que la agarosa se solidifique, sostenga la diapositiva inferior en la mano no dominante y la diapositiva superior en la mano dominante. Voltee hacia arriba la diapositiva superior mientras mantiene la diapositiva inferior estable como resultado de lo cual la almohadilla de agarosa se adhiere a una de las dos diapositivas.
  5. Si la almohadilla de agarosa formada es más grande que el tamaño de la cubierta (18 mm x 18 mm), recorte los bordes de la almohadilla para obtener las dimensiones requeridas para garantizar la colocación adecuada de la cubierta. Estas almohadillas de agarosa son para el uso inmediato y no para ser almacenadas.
  6. Inspeccione visualmente la almohadilla de agarosa para obtener una superficie lisa que esté húmeda y sea adecuada para el montaje. Si la almohadilla de agarosa se expone al aire y se seca, la superficie de la almohadilla de agarosa aparece arrugada. En tal escenario, prepare una almohadilla de agarosa fresca como se menciona en los pasos 2-6 de esta sección.
  7. En la almohadilla de agarosa, coloque 2 μL de solución de perlas de poliestireno de 0,1 μm como medio de montaje.
  8. Elija 3-4 gusanos usando una púa de alambre de platino y desplazándolos a una placa NGM sin semilla. Este proceso asegura la eliminación de bacterias superficiales que dificultan la inmovilización durante el montaje.
  9. Una vez que los gusanos se arrastran fuera de sus bacterias superficiales, recójalos para montarlos con una púa de alambre de platino y resuspendlos en la gota de perlas de poliestireno en la almohadilla de agarosa.
  10. Con cuidado, coloque una funda de 18 mm x 18 mm sobre los gusanos. Para evitar la evisceración de los gusanos montados, no mueva la cubierta después de la colocación.
  11. Monte la diapositiva preparada en el microscopio para obtener imágenes.

3. Configuración y adquisición de imágenes

NOTA: Los cometas EBP viajan con una velocidad aproximada de 0,22 μm/s como se observa en las neuronas de mamíferos y PLM de C. elegans16,18. Para muestrear de manera óptima los eventos en una adquisición de lapso de tiempo según el criterio de Nyquist28,se requieren escalas espaciales y temporales de 0.09 μm y 0.43 s, respectivamente. Para la prevención de la fototoxicidad o el fotobleaching, se utilizó la adquisición de Spinning Disk. Hemos descrito nuestra configuración de imágenes y la configuración de adquisición a continuación.

  1. Capture las imágenes utilizando un microscopio invertido equipado con una unidad de disco giratorio y una cámara. Active la configuración según las instrucciones del fabricante.
  2. Encienda el software que controla la configuración.
  3. Como se trata de un microscopio invertido, coloque la diapositiva con los gusanos montados en el escenario con un objetivo de bajo aumento (5x o 10x) con la cubierta hacia abajo.
  4. Configure la trayectoria de la luz hacia el ojo o el modo visible que utiliza la iluminación de la lámpara halógena para la luz transmitida y la lámpara de arco de mercurio para la luz reflejada.
  5. Enfoca y centra un gusano en el campo de visión debajo del campo brillante.
  6. Coloque el aceite de inmersión y cambie el aumento a 63x (1.4NA / Aceite) y vuelva a enfocar la cola de gusano en el campo brillante para las neuronas PLM.
  7. Encienda la fluorescencia de la lámpara de arco de mercurio para un breve reenfoque de las neuronas PLM. Coloque el conjunto correcto de reflectores (AF488) en la trayectoria de la luz para la visualización de GFP.
  8. Ajuste el microscopio a la adquisición de la cámara dirigiendo la trayectoria de la luz hacia la cámara.
    NOTA: El control de los pasos 4-7 mencionados anteriormente a través de la pantalla del transistor de película delgada (TFT) del microscopio es rápido y evita la exposición innecesaria a la iluminación. Alternativamente, controle la iluminación, el reflector a través del software.
  9. Después del enfoque de la neurona PLM en el campo de visión, en la interfaz del software seleccione la iluminación del láser de 488 nm con 30% de potencia y 300 ms de exposición para la cámara con multiplicación de electrones (EM) valor de ganancia 70. Dependiendo de la expresión del reportero, varíe estos parámetros según sea necesario. Almacene la configuración como una configuración para las sesiones de creación de imágenes posteriores.
  10. La pestaña Canales almacena las pistas, cada una con una iluminación y una configuración de cámara específicas. La pista resaltada permite una visualización en vivo, mientras que para adquirir una imagen la pista debe estar marcada. Resalte un canal con campo brillante (DIC) para la visualización en vivo de la cola del gusano en el espacio de trabajo. La muestra está enfocada y centrada en la ventana de imágenes en vivo del espacio de trabajo.
  11. Resalte el canal con excitación láser de 488 nm para un enfoque rápido de la neurona PLM en la ventana de imágenes en vivo. Una vez enfocado, comience la adquisición de lapso de tiempo estableciendo los parámetros de la serie de tiempo como se menciona en el siguiente paso.
  12. Usando iluminación láser de 488 nm, configure un experimento con series de tiempo durante 2 minutos y sin intervalo de tiempo entre fotogramas. Para mantener las escalas temporales de adquisición de imágenes, solo adquirimos fluorescencia GFP solamente.
  13. Con la pestaña Iniciar experimento, comience la adquisición. El uso de un aumento de 63x restringe la resolución espacial a 0.21 μm que es muestreada por la cámara al tamaño de píxel de 0.09 μm. Adquiera un lapso de tiempo a 3.3 fotogramas / s para muestrear de manera óptima el evento. La imagen de lapso de tiempo tenía 396 marcos de tiempo adquiridos durante una duración de 2 minutos. Después de la adquisición, guarde la imagen en el formato predeterminado, al que luego se puede acceder mediante el software predeterminado o ImageJ.

4. Observación y análisis

  1. Obtenga una vista previa de la adquisición de lapso de tiempo en el software predeterminado o ábrala en Image J a través de su complemento Bioformats.
    NOTA: Hemos descrito el proceso de análisis de imágenes en la Imagen J.
  2. Instale el complemento Bioformats en ImageJ.
    1. Alternativamente, exporte el archivo de formato predeterminado a .tif para la compatibilidad de archivos en ImageJ. La función de exportación en ZEN2 da como resultado fotogramas individuales de la imagen como archivos discretos .tif. Evitamos este método para evitar la formación de un gran número de archivos.
  3. Abra la imagen en formato '.czi' directamente en la Imagen J a través de su plugin 'Bioformatos'. La imagen se abre como una pila de varias imágenes. Si utiliza la función "exportar" del software predeterminado, reconstituya las imágenes como una pila de varias imágenes utilizando el siguiente flujo de trabajo en ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenú > Images To Stack.
  4. Obtenga una vista previa de la imagen como una película utilizando el icono Reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen. Los cometas se pueden ver como puntinos móviles brillantes en el cuerpo celular y los procesos de la neurona PLM. Si los cometas son visibles claramente, continúe con el paso 8, de lo contrario, siga los pasos 5-7 de esta sección.
  5. Convierta el perfil de color de la imagen utilizando la tabla de búsqueda (LUT) en una imagen en escala de grises: el programa ImageJ > menú Imagen > submenú Tablas de búsqueda > Seleccionar grises.
  6. Invierta el perfil LUT de la imagen para una fácil visualización: el programa ImageJ > menú Imagen > submenú Tablas de búsqueda > Invertir LUT.
  7. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para ver los cometas: Programa ImageJ > menú Imagen > Ajustar submenú > Brillo/Contraste.
    1. Mueva los controles deslizantes de Mínimo, Máximo, Brillo y Contraste para obtener la escala deseada de las intensidades en toda la imagen. Cuantificamos las imágenes con cometas visibles claramente.
  8. La versión básica de ImageJ tiene herramientas de inicio representadas como iconos. Localice y haga clic con el botón derecho en el icono con una línea para abrir un menú desplegable y seleccione la línea segmentada. Dibuje la línea segmentada en las regiones de interés (ROI) con su origen en o cerca del cuerpo celular de la neurona.
    1. Para consideraciones posteriores, guarde el ROI de la línea segmentada a través del administrador de ROI utilizando el siguiente flujo de trabajo: ImageJ > Analizar herramientas > > gestor de ROI > Seleccione el rastro dibujado en la imagen y haga clic en Agregar en la ventana del gestor de ROI > Más en la ventana del gestor de ROI > Guardar.
  9. Antes de generar el kymograph, como las escalas espaciales y temporales son diferentes se quita la escala para obtener las medidas en píxeles utilizando lo siguiente:
    ImageJ > Analizar > Establecer escala > Haga clic para quitar la escala > Aceptar.
  10. Usando la función Reslice en el menú desplegable Image > Stacks, genere un kymograph. El kymograph es una representación del ROI segmentado en el tiempo. El eje horizontal representa la distancia y el eje vertical representa el tiempo. Las trazas diagonales representan los cometas en movimiento. Generalmente, el kymograph toma el perfil de color de la imagen, de lo contrario, asigne un perfil de color como se describe en los pasos anteriores 5-6 para la visualización de las trazas diagonales.
  11. Usando la función Línea recta en el menú desplegable de la herramienta Línea (consulte el paso 9 de esta sección) dibuje líneas rectas sobre cada una de las trazas diagonales y adíslas en el administrador de ROI.
  12. En la pestaña Analizar, vaya a Establecer mediciones y seleccione Intensidad media y Parámetros de rectángulo delimitador para medir las trazas.
  13. En la ventana del administrador de ROI, haga clic en Medir, que abrirá una ventana de resultados que arrojará la intensidad media del ROI, las coordenadas X e Y de las trazas de línea, Ancho, Alto, Ángulo y Longitud de las trazas de línea. Esta ventana se puede guardar como un formato .csv y luego importarse a un programa de análisis de datos.
  14. En el programa de hoja de cálculo, se abre la ventana de resultados con los valores distribuidos en filas y columnas. Los valores relevantes son el ancho, el alto y el ángulo de las trazas. El ancho da el desplazamiento de la traza, la altura da la duración y el ángulo representa el vector. Como los valores de anchura y altura están en píxeles, multiplíquelos con las escalas espacial y temporal, respectivamente, para obtener los parámetros medibles estándar.
  15. Como el lado izquierdo del kymograph es proximal al cuerpo celular, dependiendo del ángulo, clasifique los cometas en más-extremo-fuera o menos-extremo-fuera (es decir, lejos del cuerpo celular o hacia el cuerpo celular, respectivamente). Clasifique los ángulos entre 1° a -89° y -91° a -179° como más-extremo-out y menos-extremo-fuera, respectivamente. Recopile datos de múltiples kymographs en una hoja de cálculo para un estudio y represente estadísticamente.

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Representative Results

Como ejemplo representativo, hemos descrito la observación in vivo de los cometas EBP en estado estacionario y los axones regeneradores de las neuronas PLM. Las neuronas PLM se encuentran en la región de la cola del gusano con un proceso anterior largo que forma una sinapsis y un proceso posterior corto. Las neuronas PLM crecen en la dirección anterior-posterior cerca de la epidermis y son responsables de la suave sensación de tacto en los gusanos. Debido a su estructura simplificada y su facilidad para la obtención de imágenes y la microcirugía, las neuronas PLM han sido ampliamente investigadas por su citoesqueleto de microtúbulos29,transporte axonal30,31y regeneración19,32,polaridad neuronal24,33,34,comportamiento y envejecimiento35,36  y muchos otros procesos neuronales. Utilizamos neuronas PLM para evaluar la dinámica y orientación de los microtúbulos in vivo en un transgénico que expresa EBP-2::GFP bajo el promotor mec-4.

Para verificar la dinámica de estado estacionario de los microtúbulos, elegimos los gusanos que expresan el reportero Pmec-4-EBP-2::GFP. Los gusanos se montaron en perlas de poliestireno de 0,1 μm en almohadillas de agarosa al 10%. El coverslip se agregó suavemente y los gusanos fueron fotografiado en el microscopio de disco giratorio. Las neuronas PLM se centraron y enfocaron en 63x y se imaginaron con una velocidad de fotogramas de 3,3 fotogramas por segundo. El proceso anterior del PLM mostró que la mayoría de los cometas se alejan del cuerpo celular, mientras que el proceso posterior mostró un movimiento bidireccional de los cometas(Figura 1). Basado en la dirección de los cometas, el proceso anterior del PLM contiene microtúbulos unipolares más-extremo-fuera, mientras que el proceso posterior tiene polaridad mixta (más y menos-extremo-fuera) de microtúbulos (Figura 2)24.

Como aplicación del ensayo, exploramos la dinámica y orientación de los microtúbulos en los axones regeneradores de las neuronas PLM. Estudios previos han establecido métodos de axotomía mediada por láser utilizando varios tipos de láseres, incluidos los láseres UV, nanosegundo, picosegundo y femtosegundo31,37,38,39,40,41,42,43. Para este estudio, utilizamos un láser de femtosegundo para corte el proceso anterior de las neuronas PLM43. Después de la lesión, los gusanos fueron recuperados en placas NGM secuembadas. Los gusanos fueron fotografiado en múltiples puntos de tiempo después de la lesión para la observación de cometas EBP-2::GFP. A las 2 h después de la lesión, un axón cortado era visible, sin embargo, los cometas se redujeron drásticamente en número en comparación con un axón ileso. A las 11 h después de la lesión, los axones han provocado una respuesta de regeneración en forma de rebrote axonal donde se observó un gran número de cometas EBP-2::GFP(Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Observación y análisis de cometas EBP. (A) Esquema de la neurona PLM mostrando su posición con respecto a la anatomía del gusano. (B) El punto de referencia se selecciona según el tipo de neurona. En este caso, el cuerpo celular de la neurona PLM sirve como punto de referencia para las regiones de interés en procesos anteriores o posteriores. Los cometas (círculos magenta) son visibles como puntiagudos en el cuerpo celular, procesos anteriores y posteriores de la neurona PLM. Se dibuja una línea segmentada que traza la neurita de interés (proceso anterior) para extraer un kymograph. (C) Un ROI típico se puede convertir en un kymograph que es una imagen de distancia-tiempo con trazas diagonales que representan los cometas en movimiento. Con respecto al cuerpo celular, los cometas más-extremo-fuera se trazan en cian, mientras que los cometas menos-extremo-fuera se trazan en rosa. Para referencia espacial, el ROI segmentado se representa en la parte superior del kymograph en bruto. (D) Los parámetros de medición incluyen el ancho, la altura, el ángulo y la longitud de la traza que se pueden traducir en parámetros de microtúbulos. (E) Los parámetros de análisis se extraen de los parámetros de medición de ancho, alto y ángulo de las trazas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2: Dinámica en estado estacionario de los microtúbulos en el axón PLM. (A) Instantáneas de una serie temporal representativa de cometas EBP-2::GFP en las neuronas PLM que muestran algunos de los cometas EBP-2::GFP (flechas de colores) en los procesos anterior y posterior de la neurona PLM. (B) Dos regiones en el proceso anterior (ROI-A y ROI-B) se convierten en kymographs en los que las trazas correspondientes a los cometas marcados en 2(A). Las huellas han sido codificadas por color y número con respecto a los cometas en movimiento en 2(A). El panel gráfico inferior representa las trazas observadas distinguidas en función de su dirección del movimiento. Los cometas de extremo más hacia afuera están marcados en cian, mientras que los cometas de extremo menos hacia afuera están marcados en rosa. Como referencia, la ubicación del cuerpo celular se representa en la parte inferior. (C) El ROI-C en el proceso posterior se convierte en los kymographs con trazas correspondientes a los cometas en movimiento en proceso posterior en la Figura 2(A). El panel más a la derecha representa las trazas de extremo más y extremo menos con respecto a la posición del cuerpo celular marcado en la parte inferior. Observe que la mayoría de los rastros en las regiones axonales (ROI-A y ROI-B) se están alejando del cuerpo celular representando microtúbulos más extremos (rastros cian). Por el contrario, en el proceso posterior (ROI-C), las trazas son bidireccionales que representan la polaridad mixta con microtúbulos más (trazas cian) y menos -extremo (trazas rosadas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  

Figure 3
Figura 3: Microtúbulos durante la regeneración axonal en neuronas PLM.   (A) Representación esquemática del procedimiento de axotomía mediante un láser de femtosegundo. El láser crea una lesión seguida del inicio del rebrote. Las principales respuestas de regeneración se califican como fusión tipo 1, fusión tipo 2 y axones regeneradores. (B) Imágenes representativas de neuronas PLM que expresan EBP-2::GFP en las condiciones no lesionadas (0 h), axotomizadas (2 h después de la axotomía) y de rebrote (11 h después de la axotomía). El ROI trazado para los kymographs se ha marcado en las imágenes. (C) Kymógrafos representativos de regiones axonales rastreadas en los axones fusionados no lesionados, lesionados, recrecidas y tipo 1. Observe que el número de cometas EBP-2::GFP disminuyó significativamente en los axones lesionados seguido de su movimiento robusto (mayor longitud y duración del crecimiento) en el axón que vuelve a crecer. Los rastros individuales se pueden cuantificar y clasificar según su dirección (rastros cian y rosa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La comprensión de la dinámica de los microtúbulos ha sido un enfoque clave en el campo de la investigación citoesquelética a lo largo de los años. Los microtúbulos sufren nucleación y catástrofe junto con un proceso continuo de inestabilidad dinámica44,45,46,47. Gran parte de esta información se ha obtenido a través de ensayos in vitro como lecturas de dispersión de luz de tubulina libre vs polimerizada, ensayos de crecimiento de microtúbulos de tubulina fluorescente, etc.48. Si bien la observación en vivo de microtúbulos fluorescentes y no fluorescentes es factible en células delgadas, las mediciones in vivo de la dinámica de los microtúbulos son un desafío.

Usando esta cepa transgénica, otras neuronas táctiles como PVM, ALM y AVM también se pueden evaluar para la orientación de los microtúbulos. Las imágenes y los procedimientos de análisis descritos aquí se pueden adaptar a otros tipos de neuronas en C. elegans con un reportero transgénico apropiado, sin embargo, se espera la variabilidad en la dinámica del cometa a través de diferentes neuronas49,50,51,52. Este método también es aplicable a los tipos de células no neuronales en C. elegans53,54,55,56. En tipos de células no neuronales como la epidermis o el embrión, la dinámica de los microtúbulos se observa en dos dimensiones53,54,55,56. Para tales eventos, las imágenes de la serie temporal se proyectan en una sola imagen utilizando imágenes de diferencia Z-projection o Stack para extraer el ROI de los kymographs.

Observamos que los anestésicos disponibles comercialmente como el clorhidrato de levamisol, el tetramisol no son adecuados para la inmovilización de los gusanos, ya que atenúan drásticamente la dinámica del cometa. Las microperlas en almohadillas de agarosa al 10% son una opción adecuada para la inmovilización durante la obtención de imágenes57,58. Sin embargo, una exposición más prolongada a un mayor porcentaje de agarosa y microperlas puede provocar estrés físico para los gusanos. Además, es aconsejable llevar la solución de microperlas a temperatura ambiente antes de montarla, ya que el choque frío puede provocar un cambio en la dinámica de los microtúbulos59,60,61,62,63. La humedad en las almohadillas de agarosa es un factor sensible para la inmovilización, ya que los gusanos pueden deseccarse en las almohadillas de agarosa más secas y las almohadillas de agarosa húmedas pueden no restringir la movilidad de los gusanos. El experimentador puede inspeccionar visualmente la almohadilla de agarosa para obtener una superficie lisa y nivelada antes de montar64. El procedimiento de montaje se puede mejorar aún más mediante la reducción de las bacterias asociadas con los gusanos. Las bacterias adherentes de la superficie dificultan la inmovilización del gusano, mientras que las bacterias intestinales dan lugar a la autofluorescencia que puede ocluir la señal de los cometas EBP-2::GFP. Por lo tanto, es preferible cultivar los gusanos en placas OP50 recién sembradas y eliminar las bacterias de la superficie colocando los gusanos en placas NGM sin sembrar o lavándolas con tampón M9 o flotación en solución de sacarosa65,66.

Entre los parámetros de observación, las escalas espacial y temporal son críticas para muestrear de manera óptima los cometas28. EBP-2::GFP es sensible al fotobleaching, por lo que se debe evitar la exposición innecesaria a la luz. Las imágenes en vivo con sondas fluorescentes también causan daños fototóxicos debido a la producción de radicales libres. Esto podría obstaculizar la dinámica de los microtúbulos y puede ser fatal para el gusano. Se puede utilizar una configuración de adquisición de baja exposición para eludir los problemas de fotobleaching y fototoxicidad. Los parámetros de análisis también serán válidos para los movimientos multidimensionales de los cometas, sin embargo, es necesario determinar el punto de referencia correctamente.

Cada uno de los módulos descritos en este estudio se puede adaptar a otros reporteros que detectan los extremos negativos de los microtúbulos, un orgánulo vesicular dentro del axón o las dendritas, etc. Esta técnica también se puede aplicar a otros organismos o tejidos con la transgénesis adecuada y el sistema de imágenes. La información de la dinámica de los microtúbulos es válida en otros procesos celulares como la división celular, la migración celular, el mantenimiento de la arquitectura celular y otros procesos basados en microtúbulos. Diversas condiciones clínicas se han asociado con la organización y dinámica de los microtúbulos7,información precisa de las cuales puede fortalecer los enfoques farmacológicos.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a Yishi Jin y Andrew Chisholm por el apoyo inicial y la cepa utilizada en el estudio. La cepa bacteriana OP50 fue aprovechada comercialmente del Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). También agradecemos a Dharmendra Puri por la estandarización de los procedimientos experimentales. El estudio está financiado por la subvención básica del Centro Nacional de Investigación del Cerebro (apoyado por el Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/ E/18/1/504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1/500874) a A.G.-R y una subvención de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB: CRG/2019/002194) a A.G.-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation

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Neurociencia Número 177
<em>In vivo</em> Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las <em>neuronas caenorhabditis elegans</em>
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In… More

Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).

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