Summary
यह प्रोटोकॉल विच्छेदन प्रक्रिया, संस्कृति की स्थिति, और घ्राण सर्किट असेंबली के अध्ययन के लिए एक एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण प्रणाली की लाइव इमेजिंग का वर्णन करता है।
Abstract
~ न्यूरॉन्स मस्तिष्क के उचित कार्य के लिए आवश्यक सर्किट बनाने के लिए ठीक से जुड़े हुए हैं। ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली इस प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है क्योंकि एंटीना और मैक्सिलरी पाल्प्स से 50 प्रकार के घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) अपने अक्षतंतुओं को एंटीनेल लोब में 50 पहचानयोग्य ग्लोमेरुली में प्रोजेक्ट करते हैं और 50 प्रकार के दूसरे-क्रम के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) से डेंड्राइट्स के साथ सिनैप्टिक कनेक्शन बनाते हैं। पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया जो निश्चित ऊतकों का उपयोग करके घ्राण सर्किट में सटीक लक्ष्यीकरण को विनियमित करते हैं। यहां, एक एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण प्रणाली जो संस्कृति में घ्राण सर्किट असेंबली के प्रमुख विकासात्मक मील के पत्थर को दोहराती है, का वर्णन किया गया है। बाहरी छल्ली को विच्छेदन करने और विकासशील प्यूपल मस्तिष्क को कवर करने वाले अपारदर्शी वसा निकायों की सफाई के माध्यम से, जीवित दिमाग से एकल न्यूरॉन्स की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है। यह लाइव ऊतक से एकल ओआरएन अक्षतंतु लक्ष्यीकरण के समय-अंतराल इमेजिंग की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण सेल जैविक संदर्भों और पहले से पहचाने गए महत्वपूर्ण जीनों के कार्यों को प्रकट करने में मदद करेगा और सर्किट असेंबली की गतिशील प्रक्रिया को रेखांकित करने वाले तंत्र की पहचान करेगा।
Introduction
न्यूरॉन्स मस्तिष्क के उचित कार्य के लिए आवश्यक सर्किट बनाने के लिए ठीक से जुड़े हुए हैं। 100 से अधिक वर्षों के लिए, न्यूरोसाइंटिस्ट यह समझने की कोशिश कर रहे हैं कि न्यूराइट्स अत्यधिक सटीकता के साथ अपने मध्यवर्ती और अंतिम लक्ष्यों की ओर कैसे विस्तार करते हैं। नतीजतन, उन्होंने महत्वपूर्ण जीनों की पहचान की है जो न्यूरोनल प्रक्रियाओं के विकास के लिए मार्गदर्शन संकेतों को एन्कोड करतेहैं। ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली इस प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है क्योंकि घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन, प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स) रूढ़िवादी आकार, आकार और सापेक्ष स्थिति के साथ 50 पहचानयोग्य ग्लोमेरुली को प्रोजेक्ट करते हैं, जहां वे 50 प्रकार के दूसरे-क्रम प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) से डेंड्राइट्स के साथ सिनैप्टिक कनेक्शन बनाते हैं, जिनमें से प्रत्येक 50 ग्लोमेरुली2 (चित्रा 1 ए) में से एक में डेंड्राइट्स भेजता है ।। ). इसलिए, फ्लाई घ्राण प्रणाली में सिनैप्टिक (ग्लोमेरुलर) रिज़ॉल्यूशन पर उत्परिवर्ती फेनोटाइप की पहचान करना अपेक्षाकृत आसान है। इसने महत्वपूर्ण जीनों की खोजों को जन्म दिया जो घ्राण सर्किट असेंबली 3 को विनियमित करतेहैं।
फ्लाई घ्राण परिपथ की असेंबली अस्थायी और स्थानिक रूप से समन्वित विकास प्रक्रियाओं पर निर्भर करतीहै। ORNs और PNs अलग-अलग सेल fates प्राप्त करते हैं, जो उनकी तारों की विशिष्टताओं के लिए कार्यक्रम स्थापित करते हैं। अगला, पीएन डेंड्राइट्स एंटीनेल लोब (चित्रा 1 बी) को प्रीपैटर्न करते हैं। ORNs के अक्षतंतु तब ipsilateral एंटीनाल लोब का चक्कर लगाते हैं और contralateral एंटीनाल लोब तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क की मध्य रेखा को पार करते हैं। इसके बाद, ORN अक्षतंतु ipsi- और contralateral एंटीनाल लोब दोनों पर आक्रमण करते हैं और विशिष्ट ग्लोमेरुली में अपने साथी PNs के डेंड्राइट्स के साथ synapses बनाते हैं। घ्राण सर्किट असेंबली के लिए यह मोटा मॉडल विकास के दौरान मध्यवर्ती समय बिंदुओं से निश्चित नमूनों के लक्षण वर्णन के आधार पर प्रस्तावित किया गया था। गरीब अस्थायी संकल्प और निश्चित ऊतक से विकास के पार एक ही न्यूरोनल प्रक्रियाओं का पालन करने में असमर्थता सर्किट असेंबली प्रक्रिया की यांत्रिक समझ को सीमित करती है।
यह तकनीकी रूप से वीवो में लाइव छवि ओआरएन और पीएन प्रक्रियाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वायरिंग प्रक्रिया प्यूपल चरण की पहली छमाही में होती है जब एंटीनेल लोब प्यूपल मामले के अंदर अपारदर्शी वसा शरीर से घिरा होता है। इसलिए, बरकरार प्यूपे से विकासशील घ्राण सर्किट को सीधे छवि बनाना असंभव है। विच्छेदित ऊतक सुसंस्कृत पूर्व विवो ऊतक अस्पष्टता को दरकिनार कर सकते हैं और सफलतापूर्वक तंत्रिका विकास 4,5,6 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। प्यूपल मस्तिष्क में न्यूरोनल वायरिंग का अध्ययन करने के लिए एक समान पूर्व विवो स्पष्टीकरण संस्कृति रणनीति का उपयोग करने की चुनौती यह है कि क्या यह एक संस्कृति की स्थिति में सटीक न्यूरॉन लक्ष्यीकरण को दोहराता है। फ्लाई आई-ब्रेन कॉम्प्लेक्स7 के लिए पहले से रिपोर्ट की गई पूर्व विवो संस्कृति की स्थिति के आधार पर, एक स्पष्टीकरण जिसमें पूरे प्यूपल मस्तिष्क, एंटीना और कनेक्टिंग एंटेना नसों को बरकरार रखा गया है, को हाल ही में विकसित किया गया है, जो घ्राण सर्किट के सटीक लक्ष्यीकरण को बरकरार रखता है और हर 20 मिनट की आवृत्ति पर 24 घंटे तक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी-आधारित लाइव इमेजिंग के अधीन किया जा सकताहै। . यहां, स्पष्टीकरण संस्कृति और इमेजिंग के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। स्पष्टीकरण प्रणाली केंद्रीय मस्तिष्क में घ्राण सर्किट और संभावित रूप से अन्य सर्किटों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करती है।
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Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों को कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाता है जब तक कि अन्यथा समझाया न जाए।
- टाइम लैप्स इमेजिंग के दौरान स्पष्टीकरण को स्थिर करने के लिए संस्कृति पकवान तैयार करने के लिए, 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश की निचली सतह पर 0.5 सेमी मोटी सिलगार्ड (उपयोग से पहले 10: 1 अनुपात में दो तरल घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं) बिछाएं और इसे कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए इलाज दें (चित्रा 2 ए, जिसे निम्नलिखित पाठ में सिलगार्ड प्लेट के रूप में संदर्भित किया जाता है)।
- इस प्लेट पर स्पष्टीकरण को स्थिर करने के लिए माइक्रो पिन तैयार करने के लिए, एक तरफ संरेखित तेज सिरों के साथ एक टेप पर कई माइक्रो पिन चिपकाने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)। माइक्रो पिन (चित्रा 2B') के तेज सिरों से ~ 2 मिमी काटने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। कटे हुए माइक्रो पिन को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें और एक पूर्व-निर्मित सिलगार्ड प्लेट (चित्रा 2 सी) की सिलगार्ड परत में डालें। एक स्पष्टीकरण को स्थिर करने के लिए दो माइक्रो पिन का उपयोग किया जाता है।
- सफेद प्यूपे एकत्र करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें, जो 1 घंटे के भीतर प्यूपेरियम बनाता है, एचएसएफएलपी, कंकड़-GAL4 / + का; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 जीनोटाइप और उन्हें नई शीशियों में स्थानांतरित करें। यादृच्छिक प्रकार से विरल ORN क्लोन को प्रेरित करने के लिए 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्मी का झटका। गर्मी के झटके के बाद, शीशियों को 30 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जिसके परिणामस्वरूप प्यूपेरियम गठन (एपीएफ) के बाद 30 घंटे की उम्र में प्यूपे की आयु हो गई।
- स्पष्टीकरण के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, 500 एमएल श्नाइडर के ड्रोसोफिला मीडियम में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) के 5 एमएल जोड़ें। माध्यम को फ़िल्टर करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 45 एमएल ऐलीकोट बनाएं। माध्यम को 1-2 महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- इमेजिंग के दिन, श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम के 45 मिलीलीटर की एक ट्यूब लें और 5 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (10% वी / वी), 4 मिलीग्राम / एमएल मानव इंसुलिन स्टॉक समाधान (10 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता) के 125 μL जोड़ें, 1 मिलीग्राम / एमएल 20-hydroxyecdysone स्टॉक समाधान के 50 μL इथेनॉल में भंग (1 μg / mL अंतिम एकाग्रता)। अच्छी तरह से मिलाएं और एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूर्ण माध्यम के 15 मिलीलीटर स्थानांतरित करें। शेष पूर्ण माध्यम को एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। भ्रूण गोजातीय सीरम, मानव इंसुलिन स्टॉक समाधान और 20-hydroxyecdysone स्टॉक समाधान को एलीकोट किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
- 20-30 मिनट के लिए एक बुलबुले / एस की दर से एक बाँझ 5 एमएल पिपेट टिप के माध्यम से तरल सतह के नीचे एक ऑक्सीजन सिलेंडर से ऑक्सीजन बुलबुले पंप करके 15 एमएल पूर्ण माध्यम को ऑक्सीजन के बुलबुले को ऑक्सीजन सेट करें। इस प्रक्रिया के दौरान ट्यूब के उद्घाटन को कवर करने के लिए एक पैराफिन फिल्म का उपयोग करें।
- विच्छेदन अच्छी तरह से सतह और सिलगार्ड प्लेट (सिलगार्ड परत पर डाले गए माइक्रो पिन के साथ, चरण A1 और A2 में तैयार) को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल करें। उपयोग करने से पहले उन्हें सूखने दें।
2. स्पष्टीकरण विच्छेदन
- 30 h APF (puparium गठन के बाद 30 h) pupae को एक कागज के ऊतकों में स्थानांतरित करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें और 5 मिनट के लिए प्यूपे की बाहरी सतह को सुखाएं।
- कांच की स्लाइड पर डबल-साइडेड टेप का एक टुकड़ा रखें। ध्यान से टेप की चिपचिपा सतह पर सूखे pupae पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ संलग्न. धीरे से एक ब्रश के साथ pupae दबाएँ pupae के ventral पक्ष टेप करने के लिए अच्छी तरह से संलग्न करने में मदद करने के लिए (चित्रा 3A). प्यूपा को नुकसान न पहुंचाएं।
- सिर के पृष्ठीय पक्ष को कवर करने वाले भूरे रंग के पिल्ला मामले को हटाने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें (चित्रा 3 ए, बी)। भूरे रंग के प्यूपल केस और पार्श्व पक्ष से प्यूपा के बीच संदंश की एक तेज नोक डालें और प्यूपा के पीछे के छोर पर एक रेखा के माध्यम से भूरे रंग के पिल्ला मामले को सावधानीपूर्वक तोड़ दें (चित्रा 3 बी, सी)। भूरे रंग की प्यूपल केस खोलें। संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए धीरे से पिल्ला पकड़ और विच्छेदन के लिए अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम के साथ हस्तांतरण. मध्यम सतह पर फ्लोटिंग प्यूपा को डुबोएं ताकि इसे कुएं के नीचे डूबने में मदद मिल सके (चित्रा 3 डी)।
नोट: संदंश के साथ प्यूपा को घायल करने से रोकने के लिए भूरे रंग के पिल्ला मामले के अंदर संदंश टिप को बहुत गहराई से न डालें। - प्यूपा से एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण को विच्छेदित करने के लिए, एक हाथ से प्यूपा को धीरे से पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें और दूसरे हाथ से प्यूपा के पीछे की ओर से एक छोटे से छेद को काटने के लिए माइक्रोसिस्सर्स की एक जोड़ी का उपयोग करें (चित्रा 3 ई)। यह छोटा सा छेद प्यूपा के अंदर उच्च दबाव छोड़ता है।
- छेद से प्यूपा के वेंट्रल मिडलाइन के माध्यम से काटें जब तक कि गर्दन (संकीर्ण संरचना जो सिर और वक्ष को जोड़ती है) माइक्रोसिस्सर्स (चित्रा 3 एफ) के साथ नहीं। फिर, प्यूपा के शरीर से सिर को अलग करने के लिए गर्दन की परिधि के माध्यम से काटें (चित्रा 3 जी)। शरीर को हटा दें और इसे एक अलग कुएं में रखें।
नोट: प्यूपा के पृष्ठीय / वेंट्रल पक्ष से सीधे गर्दन को न काटें, जो मस्तिष्क को निचोड़ सकता है। - पारदर्शी छल्ली को काटें जो मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष को कवर करता है (चित्रा 3 एच)। यह मस्तिष्क के शीर्ष पर वसा शरीर को उजागर करेगा। कुछ छल्ली रखें जिसमें रेटिना और एंटीना संलग्न होते हैं। मस्तिष्क के वेंट्रल पक्ष के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: छल्ली के नीचे कैंची के ब्लेड को बहुत गहराई से न डालें क्योंकि यह एंटीना और मस्तिष्क को जोड़ने वाले एंटीना तंत्रिकाओं के विच्छेदन का कारण बनेगा (चित्रा 3 एच')। - एक P10 पिपेट का उपयोग करने के लिए धीरे से बाहर वसा शरीर है कि मस्तिष्क और एंटीना को कवर करने के लिए सिर के पृष्ठीय और वेंट्रल पक्षों पर खुले क्षेत्रों की ओर माध्यम pipetting द्वारा (चित्रा 3I).
नोट: बहुत कोमल हो जब माध्यम pipetting के रूप में मस्तिष्क आसानी से छल्ली से अलग किया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि इस चरण के दौरान सभी वसा शरीर को हटा दिया जाता है। ओआरएन अक्षतंतुओं के गिरफ्तार विकास को तब देखा गया जब वसा शरीर को अच्छी तरह से साफ नहीं किया गया था, शायद माध्यम से खराब ऑक्सीजन पहुंच के कारण। - पीएन डेंड्राइट लक्ष्यीकरण के लिए द्विपक्षीय ओआरएन अक्षतंतुओं या ओआरएन अक्षतंतुओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इस चरण के दौरान माइक्रोसिस्सर के साथ एक या दो एंटीना नसों को अलग करें(चित्रा 3 जे)। छल्ली और मस्तिष्क के बीच कैंची के ब्लेड को ध्यान से रखें और रुचि रखने वाले एंटेना नसों को अलग करें।
- सिलगार्ड प्लेट में विच्छेदित स्पष्टीकरण को स्थानांतरित करने के लिए, सिलगार्ड सतह पर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम (~ 200 μL) की एक बूंद रखें। विच्छेदित ट्रंक (चरण 1.6) से वसा शरीर के साथ एक 200 μL चौड़े टिप पिपेट टिप की आंतरिक सतह को वसा शरीर को कई बार पिपेट करके कोट करें, जो स्थानांतरण के दौरान पिपेट टिप को चिपकाने से रोकता है। फिर, इस विस्तृत टिप पिपेट टिप का उपयोग विच्छेदन से अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (चित्रा 3K) पर मध्यम बूंद पर स्पष्टीकरण को स्थानांतरित करने के लिए करें।
- दो ऑप्टिक लोब (चित्रा 3एल) में सिलगार्ड परत पर स्पष्टीकरण को पिन करने के लिए संदंश का उपयोग करें। ध्यान से इमेजिंग स्टेशन पर सिलगार्ड प्लेट की स्थिति और टेप के साथ प्लेट को स्थिर करें। धीरे-धीरे P1000 पिपेट का उपयोग करके सिलगार्ड प्लेट में 10 मिलीलीटर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम जोड़ें।
नोट:: Sylgard प्लेट के लिए माध्यम जोड़ते समय स्पष्टीकरण को बाधित करने से बचें।
3. दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी आधारित लाइव इमेजिंग
- टाइम-लैप्स इमेजिंग करने के लिए, एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप, एक टीआई: नीलम लेजर, एक 20x जल-विसर्जन उद्देश्य (1.0 एनए) और एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इमेजिंग जीएफपी प्रोटीन के लिए 920 एनएम पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें। पिक्सेल रहने का समय 10 μs में समायोजित करें.
- इमेजिंग स्टेशन की स्थिति को समायोजित करें ताकि स्पष्टीकरण मोटे तौर पर उद्देश्य के तहत हों। इमेजिंग से पहले लेंस को निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। धीरे-धीरे स्पष्टीकरण के करीब माध्यम के तहत उद्देश्य को कम करें। जांचें कि उद्देश्य के लेंस पर कोई बुलबुला है या नहीं।
- यदि हां, तो उद्देश्य को माध्यम के ऊपर उठाएं और इसे तब तक दोहराएं जब तक कि बुलबुला नहीं चला जाता है। आईपीस का उपयोग करके स्पष्टीकरण ढूंढें और क्षेत्र में एक स्पष्टीकरण को केंद्र में रखें।
- समय चूक इमेजिंग के लिए लेबल किए गए कुछ ORNs के साथ एक स्पष्टीकरण सुनिश्चित करने के लिए, हर बार ~ 10 स्पष्टीकरण को विच्छेदित करें और संस्कृति प्लेट पर y अक्ष पर संरेखित करें। वाई अक्ष के साथ उद्देश्य को स्थानांतरित करके सभी स्पष्टीकरणों को स्क्रीन करें और एक स्पष्टीकरण चुनें जिसमें कुछ एकल ओआरएन अक्षतंतु इमेजिंग (चित्रा 4 ए) के लिए एंटीनेल लोब तक पहुंच गए हैं।
- अपने अंडाकार आकार और ORN अक्षतंतु है कि यह परिक्रमा करने के लिए शुरू कर रहे हैं द्वारा ऐन्टेनाल लोब को पहचानें। छवि एक ~ 150 μm x 150 xy विमान में μm क्षेत्र (20x उद्देश्य के साथ 3x ज़ूम). दो एंटेनाल लोब की सीमा का अनुमान लगाएं और उन्हें इमेजिंग क्षेत्र में केंद्रित करें।
- नीचे के अनुभाग और स्कैनिंग के शीर्ष अनुभाग को परिभाषित करके z अक्ष के साथ एक प्रारंभिक इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें. z अक्ष के साथ इमेजिंग क्षेत्र सेट करें. पहले इमेजिंग सत्र के रूप में ORN अक्षतंतु संकेतों के साथ सबसे गहरा अनुभाग सेट करें और अंतिम इमेजिंग सत्र (चित्रा 4 B) के रूप में ऊपर (अधिक सतही पक्ष) सत्र 100 μm ऊपर (अधिक सतही पक्ष)।
नोट: यह ORN अक्षतंतुओं के शीर्ष (सतही पक्ष) पर कुछ वर्गों को छोड़ देता है और संस्कृति के दौरान मस्तिष्क के विकास के कारण इमेजिंग क्षेत्र के बाहर ORN अक्षतंतुओं को ऊपर की ओर स्थानांतरित करने से बचता है।- 2 μm अंतराल पर छवि. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके हर 20 मिनट की आवृत्ति पर स्वचालित इमेजिंग स्कैनिंग सेट करें।
- पहले 4 घंटे इमेजिंग के बाद जेड अक्ष के साथ इमेजिंग क्षेत्र 20 μm ऊपर की ओर शिफ्ट करें और 16 h इमेजिंग के बाद z अक्ष के साथ एक और 20 μm ऊपर की ओर। यह इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में एक स्क्रिप्ट और अलग जेड स्टैक सेट करके प्राप्त किया जा सकता है।
- एन-कैडरिन, एक न्यूरोपिल मार्कर के साथ निर्धारण और धुंधला होने से पहले एक अतिरिक्त अवधि के बाद इमेजिंग (24 ज एक्स वीवो तक) के लिए स्पष्टीकरण को संस्कृति करें, ताकि ग्लोमेरुलस द्वारा प्रत्येक एकल ओआरएन की आनुवंशिक पहचान को प्रकट किया जा सके।
4. छवि प्रसंस्करण
- फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर ली गई अनुभाग श्रृंखला से z स्टैक छवियों को संसाधित करने के लिए, छवि अनुभाग श्रृंखला खोलें, छवि | पर क्लिक करें स्टैक्स | Z परियोजना [/].
- संस्कृति के दौरान नमूने के पार्श्व बहाव को सही करने के लिए, फिजी में TurboReg प्लगइन स्थापित करें।
- श्रृंखला से एक z स्टैक छवि श्रृंखला और एक एकल z स्टैक छवि खोलें। प्लगइन्स | खोलें पंजीकरण | टर्बोरेग ।
- स्रोत में z स्टैक छवि श्रृंखला और लक्ष्य | में एकल z स्टैक छवि का चयन करें अनुवाद । खुले जेड स्टैक छवि श्रृंखला से सभी छवियों को पंजीकृत करने के लिए बैच बटन पर क्लिक करें।
- इमेज्ड नमूनों की उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए, 3 डी छवि वर्गों के बाद जेड स्टैक छवियों से एक दूसरे के लिए आसपास के क्षेत्र में अलग-अलग लेबल किए गए एकल अक्षतंतुओं को अलग-अलग किया जाता है।
- एक ही छवि में कुछ अक्षतंतुओं से एकल ORN अक्षतंतु निकालने के लिए, छवि अनुभाग श्रृंखला खोलें, प्लगइन्स पर क्लिक करें | विभाजन | विभाजन संपादक [/]. ब्रश उपकरण का चयन करें और प्रत्येक छवि अनुभाग पर "+" या "-" बटन का चयन करें का उपयोग कर विभाजन संपादक कार्य विंडो में रुचि ORN अक्षतंतु मुखौटा.
- Process | पर क्लिक करें छवि कैलकुलेटर [/]. छवि 1 में "छवि X", ऑपरेशन में "गुणा करें", छवि 2, [/] में "छवि X. लेबल" का चयन करें। यह केवल रुचि अक्षतंतु के साथ एक नई छवि श्रृंखला फ़ाइल उत्पन्न करता है। z स्टैक छवि को संसाधित करने के लिए चरण 4.1 निष्पादित करें। एक समय श्रृंखला छवि फ़ाइल जनरेट करने के लिए सभी समय बिंदुओं के लिए इस चरण को दोहराएँ।
- एक ही छवि से विभिन्न अक्षतंतुओं को स्यूडोकलर करने के लिए, पहले प्रत्येक अक्षतंतु की समय श्रृंखला छवि फ़ाइल को अलग से उत्पन्न करने के लिए चरण 4.3 निष्पादित करें। एक ही कच्चे डेटा छवि से विभिन्न एकल अक्षतंतुओं के लिए समय श्रृंखला छवि फ़ाइलें खोलें। Image | पर क्लिक करें रंग | चैनल मर्ज करें. विभिन्न रंग चैनलों में विभिन्न समय श्रृंखला छवि फ़ाइलों का चयन करें और ठीकक्लिक करें।
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Representative Results
ओआरएन अक्षतंतु 18 घंटे और 36 एच एपीएफ के बीच एंटीनेल लोब पर पहुंचते हैं। फिर वे एंटीनाल लोब को नेविगेट करते हैं, मध्यरेखा को पार करते हैं, और ग्लोमेरुली को इनरवेट करते हैं। वीडियो 1 एक प्रतिनिधि वीडियो है जो कई व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य अक्षतंतुओं के लिए पूरी प्रक्रिया दिखाता है, जो 24 घंटे के लिए हर 20 मिनट की आवृत्ति पर लिया जाता है। TurboReg का उपयोग करके पंजीकरण से पहले, अक्षतंतु कुछ पार्श्व बहती प्रदर्शित करते हैं क्योंकि मस्तिष्क विकसित होता है (वीडियो की पहली छमाही)। पंजीकरण के बाद, बहती को सही किया जाता है (वीडियो का दूसरा भाग)।
एक ही स्पष्टीकरण से कुछ ORN अक्षतंतुओं को अलग करने के लिए, एक उदाहरण चित्र 5 में दिखाया गया है। चरण 4.3 में प्रक्रिया के बाद, VA1d और VA1v अक्षतंतुओं को चित्र 5A में दिखाए गए स्पष्टीकरण से केवल इन दो अक्षतंतुओं (चित्रा 5B) के साथ एक नई z स्टैक छवि उत्पन्न करने के लिए निकाला गया था। इसी तरह, VM2 और VM3 अक्षतंतु (चित्रा 5B') और DL2 अक्षतंतु (चित्रा 5B') निकाले गए थे। चित्रा 5C स्यूडोकलर्स के साथ चित्र 5B-B ' में छवियों का एक विलय दिखाता है। प्रत्येक ORN अक्षतंतुओं की आनुवंशिक पहचान निश्चित स्पष्टीकरण (चित्रा 5D, E) के एक न्यूरोपिल मार्कर N-कैडरिन के immunostaining द्वारा प्रकट की गई थी।
चित्रा 1: मक्खी घ्राण सर्किट की संरचना। (ए) एक वयस्क मक्खी सिर को दाएं एंटीना (हरे) से एक ओआरएन के साथ दिखाया गया है, जो मस्तिष्क में दोनों एंटीनाल लोब (एएल) को अपने अक्षतंतु को भेजता है और एक विशिष्ट ग्लोमेरुलस में सिनैप्टिक कनेक्शन बनाता है जिसमें पीएन (लाल) के डेंड्राइट्स होते हैं। धराशायी ऊर्ध्वाधर रेखा इस और बाद के आरेखों और छवियों में मध्यरेखा को इंगित करती है। (बी) घ्राण परिपथ विकास को दर्शाने वाला आरेख। (1) पीएन डेंड्राइट्स पहले एंटेना लोब (लाल) में एक क्षेत्र को इनरवेट करते हैं। ओआरएन अक्षतंतु मस्तिष्क में एंटीनेल लोब तक पहुंचते हैं। (2) ORN अक्षतंतु या तो एक dorsolateral (हरे) या ventromedial (नीले) प्रक्षेपवक्र लेने के लिए एंटीना लोब circumnaviated. (3) ORN अक्षतंतु मध्यरेखा को पार करते हैं। (4) ओआरएन अक्षतंतु एंटेनाल लोब में इनरवेट ग्लोमेरुली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: स्पष्टीकरण के लिए इमेजिंग कक्ष की तैयारी। (ए) 60 मिमी पेट्री डिश के तल पर सिलिकॉन इलास्टोमर (~ 0.5 सेमी) की एक परत बिछाएं। (B-B') एक टेप पर पिन संरेखित करें और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके ~ 2 मिमी लंबे समय तक काटें। (सी) संस्कृति प्लेट के सिलिकॉन इलास्टोमर परत पर माइक्रो पिन पिन पिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण के लिए विच्छेदन प्रक्रिया। (A) कांच की स्लाइड पर एक डबल-साइडेड टेप पर एक पेपर टिशू-सूखे प्यूपा के वेंट्रल साइड को संलग्न करें। (B-C) अंदर प्यूपा को उजागर करने के लिए बाहरी भूरे रंग की छल्ली को काटने के लिए संदंश का उपयोग करें। (d) प्यूपा को ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम के साथ एक विच्छेदन अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। (ई-जी) माइक्रोसिस्सर का उपयोग करके सिर से प्यूपल ट्रंक को सावधानीपूर्वक अलग करें। (एच) मस्तिष्क के पृष्ठीय और वेंट्रल पक्षों को कवर करने वाले अर्धपारदर्शी छल्ली के टुकड़ों को काटें। रेटिना, एंटीना और मस्तिष्क के बीच कनेक्शन बनाए रखने के लिए मस्तिष्क के पूर्वकाल और पार्श्व पक्षों पर कुछ छल्ली रखें। (H') इस चरण के दौरान एंटीना तंत्रिका को अलग करने से बचें। (I) मस्तिष्क को कवर करने वाले वसा शरीर को धीरे से पिपेटिंग द्वारा साफ करें। (जे) कुछ प्रयोगों में माइक्रोसिस्सर का उपयोग करके एक या दो एंटीनाल तंत्रिका (ओं) को अलग करें। (के) संस्कृति प्लेट की सतह पर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम की एक बूंद रखें। एक विस्तृत टिप पिपेट टिप का उपयोग करके विच्छेदित स्पष्टीकरण को स्थानांतरित करें। (एल) सिलिकॉन इलास्टोमर परत पर स्पष्टीकरण के दो ऑप्टिक लोब को पिन करने के लिए संदंश का उपयोग करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एक स्पष्टीकरण से लक्ष्यीकरण करने वाले एकल ORN अक्षतंतु की टाइम-लैप्स इमेजिंग। (A) कुछ ORN अक्षतंतुओं के साथ एक स्पष्टीकरण का चयन करें जो केवल ऐन्टेनाल लोब तक पहुंच रहा है। अक्षतंतुओं की वक्रता द्वारा दो एंटेना लोब के आकार का अनुमान लगाएं और इमेजिंग क्षेत्र में एंटीनाल लोब को केंद्र में रखें। (बी) जेड अक्ष के साथ इमेजिंग क्षेत्र सेट करें। विचार करें कि एंटीनेल लोब ऊपर की ओर स्थानांतरित हो जाएगा क्योंकि मस्तिष्क बढ़ता है और विकसित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एकल ORNs निकालें और उनकी ग्लोमेरुलर पहचान प्रकट करते हैं। (A) 20x उद्देश्य और 3x ज़ूम इन के साथ दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 5-10 एकल ORN अक्षतंतुओं के साथ एक स्पष्टीकरण की अधिकतम प्रक्षेपण छवि। (B-B') 1-2 एकल अक्षतंतुओं को कच्चे छवि डेटा से छवि वर्गों में मैन्युअल रूप से मास्क बनाकर (A) से निकाला जाता है। (सी) प्रत्येक अक्षतंतु छद्म रंग के साथ (बी-बी') की छवियों को अलग-अलग मर्ज करें। (D-D') अधिकतम प्रक्षेपण confocal छवियों 40x उद्देश्य और 1.5x ज़ूम के साथ लिया. (ए) में दिखाए गए स्पष्टीकरण को एंटी-जीएफपी और एंटी-एन-कैडरिन (न्यूरोपिल मार्कर) के साथ धुंधला करने के बाद तय किया गया था। एंटीनाल लोब के पूर्वकाल और पीछे के हिस्से (डी) और (डी' में अलग-अलग स्टैक होते हैं। (ई) ऐन्टेनाल लोब मानचित्र (बी, सी) में निकाले गए ओआरएन अक्षतंतु दिखाता है। इस आंकड़े में दिखाई गई कुछ छवियों को एक पूर्व अध्ययन8 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी आधारित समय-अंतराल छवियां छवि पंजीकरण से पहले और बाद में दो ओआरएन अक्षतंतुओं को लक्षित करती हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
ड्रोसोफिला एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण घ्राण सर्किट के सामान्य लक्ष्यीकरण को बरकरार रखता है। हमने देखा कि विकास विवो की तुलना में 2 गुना धीमा पूर्व वीवो है। यह ध्यान दिया जाता है कि स्पष्टीकरण प्रणाली मैक्सिलरी पाल्प को बरकरार नहीं रखती है, जो छह प्रकार के ओआरएन की मेजबानी करती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सामान्य विकास पूर्व विवो को पुनर्जीवित किया जाता है, एंटीना नसों के खिंचाव को स्पष्टीकरण विच्छेदन के दौरान टाला जाना चाहिए। पूर्व विवो संस्कृति के दौरान बैक्टीरिया की वृद्धि आमतौर पर घ्राण सर्किट के गिरफ्तार विकास का कारण बनती है। इसलिए, इमेजिंग से पहले संस्कृति पकवान और पिन की पूरी तरह से नसबंदी और इमेजिंग रूम को साफ और अलग रखना महत्वपूर्ण है।
यह स्पष्टीकरण दीर्घकालिक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी आधारित समय-अंतराल इमेजिंग का समर्थन करता है। एकल ORNs के विरल लेबलिंग के लिए एक नए विकसित रिपोर्टर के साथ संयुक्त, स्पष्टीकरण प्रणाली एकल अक्षतंतु टर्मिनस से उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देती है। यह प्रणाली घ्राण सर्किट असेंबली 8 की गतिशील प्रक्रिया को रेखांकित करने वाले सेल जैविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए शक्तिशालीहै। यद्यपि घ्राण सर्किट विकास को यहां एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया था, इस प्रणाली को संभावित रूप से विकासशील केंद्रीय मस्तिष्क में अन्य सर्किट या अन्य विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए विस्तारित किया जा सकता है।
स्पष्टीकरण कम से कम 24 घंटे के लिए संस्कृति में सामान्य विकास को बनाए रखता है, जो ओआरएन लक्ष्यीकरण की पूरी प्रक्रिया पर कब्जा कर सकता है। यह शोधकर्ताओं को न्यूरोपिल मार्कर पोस्ट फिक्सेशन के साथ काउंटर-स्टेनिंग के माध्यम से एकल ओआरएन अक्षतंतुओं की आनुवंशिक पहचान को प्रकट करने में सक्षम बनाता है, क्योंकि एंटीना लोब पहले से ही संस्कृति के अंत तक स्पष्ट ग्लोमेरुलर संरचना विकसित करता है। यह रणनीति पैन-ओआरएन ड्राइवर का उपयोग करके विशिष्ट प्रकार के ओआरएन की इमेजिंग प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक विकास चरण में कई ओआरएन प्रकारों के लिए विशिष्ट आनुवंशिक ड्राइवरों की कमी की समस्या को दरकिनार करती है।
उच्च spatiotemporal संकल्प प्राप्त करने के लिए, इस स्पष्टीकरण प्रणाली को अधिक उन्नत माइक्रोस्कोपी, अनुकूली प्रकाशिकी-जाली प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी (एओ-एलएलएसएम) का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि एओ-एलएलएसएम अक्षतंतु टर्मिनलों की ठीक संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और प्रत्येक 30 सेकंड प्रति वॉल्यूम 8,9,10,11 पर स्कैनिंग आवृत्ति को सक्षम बनाता है। स्पष्टीकरण का एक लाभ जेनेलिया फ्लोरोफोर डाई 12,13,14 लेबलिंग के साथ इसकी संगतता है, जो इमेजिंग से पहले माध्यम में रंजक के साथ विशिष्ट न्यूरॉन्स में हेलो-टैग को व्यक्त करने वाले स्पष्टीकरण को इनक्यूबेट करके है। यह देखा गया था कि डाई युक्त माध्यम के साथ स्पष्टीकरण को इनक्यूबेट करने के परिणामस्वरूप डाई के साथ लार्वा को खिलाने की तुलना में बहुत मजबूत लेबलिंग होती है। इस अद्वितीय लाभ ने हमें शुरुआती विकास के चरण में अक्षतंतुओं की छवि बनाने की अनुमति दी, जिसे शायद ही जीएफपी लेबलिंग8 द्वारा कल्पना की गई थी।
टाइम-लैप्स इमेजिंग के अलावा, स्पष्टीकरण प्रणाली के अन्य फायदे हैं। उदाहरण के लिए, विशिष्ट विकास ता्मक समय बिंदुओं (चरण 2.8) पर एकपक्षीय या द्विपक्षीय रूप से विच्छेदित स्पष्टीकरण से एंटीना नसों को अलग करना संभव है। यह शोधकर्ताओं को अलग-अलग विकासात्मक चरणों में घ्राण सर्किट में किसी भी न्यूरॉन प्रकार के लक्ष्यीकरण में ओआरएन अक्षतंतुओं की आवश्यकता की जांच करने की अनुमति देता है। विशेष रूप से एकतरफा एंटीनाल तंत्रिका विच्छेदन assays, जो पारंपरिक आनुवंशिक हेरफेर द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है, एक दिलचस्प खोज के लिए नेतृत्व किया कि द्विपक्षीय ORN अक्षतंतुओं के बीच बातचीत ORN अक्षतंतु8 के सही contralateral लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, स्पष्टीकरण को एगारोज़ में एम्बेडेड होने के बजाय सीधे माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, इसलिए तेजी से वितरण की अनुमति देता है और कुछ छोटे अणुओं या दवाओं से बाहर निकलता है। आनुवांशिक हेरफेर की तुलना में, दवा उपचार में हेरफेर के तेजी से प्रभाव और उलटापन के फायदे हैं। यह शोधकर्ताओं को आनुवंशिक जोड़तोड़ के माध्यम से संरचनात्मक व्यवधान के कारण सेल घातकता या अस्वास्थ्यकर मुद्दों को दरकिनार करके बाद के विकास चरणों में कोशिकाओं के लिए कुछ आवश्यक प्रक्रियाओं का आकलन करने में सक्षम बनाता है। यह दवा के उपचार से पहले और बाद में तुलना करके, और दवा धोने के बाद सूक्ष्म परिवर्तनों के विज़ुअलाइज़ेशन में भी मदद करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम एन Özel और आर Hiesinger स्पष्टीकरण संस्कृति पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद; दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी की तकनीकी सहायता के लिए एम वैगनर; ट्रांसजेनिक मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए डीजे लुगिनबुहल; फिजी सॉफ्टवेयर विश्लेषण के सुझावों के लिए डी फ्रीडमैन; मक्खी के काम पर सहायता के लिए Y. Ge; C. McLaughlin और K.K.L. वोंग पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए। एलएल एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान 1K99DC01883001 (T.L.) और R01-DC005982 (L.L. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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