Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62991
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Reproductive Endocrinology and Infertility, Baylor College of Medicine, 2Family Fertility Center, Texas Children’s Hospital, 3Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 4Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Summary

تصف هذه الدراسة القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأر متلازمة المبيض المتعدد الكيسات باستخدام متتبع جلوكوز نظائري مستقر عبر الوريد الخلفي في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية بالجلوكوز جنبا إلى جنب.

Abstract

متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو مرض شائع يؤدي إلى اضطرابات في استقلاب الجلوكوز، مثل مقاومة الأنسولين وعدم تحمل الجلوكوز. استقلاب الجلوكوز Dysregulated هو مظهر مهم من مظاهر المرض وهو المفتاح لمسببات الأمراض. لذلك، فإن الدراسات التي تنطوي على تقييم استقلاب الجلوكوز في PCولين الكلور ذات أهمية قصوى. وقد حددت دراسات قليلة جدا إنتاج الجلوكوز الكبدي مباشرة في نماذج PC أو إس باستخدام متتبعات الجلوكوز غير المشعة. في هذه الدراسة، نناقش التعليمات خطوة بخطوة لقياس كمي لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PC أو سي إس من خلال قياس إثراء M+2 من الجلوكوز [6,6-2H2]، وهو متتبع مستقر للجلوكوز النظيري، عن طريق كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي (GCMS). يتضمن هذا الإجراء إنشاء محلول مستقر لتتبع الجلوكوز النظيري ، واستخدام موضع قسطرة الوريد الذيل وضخ متتبع الجلوكوز في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية في نفس الماوس جنبا إلى جنب. يتم قياس إثراء [6,6-2H2] الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات في GCMS. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة واسعة من الدراسات التي تنطوي على قياس مباشر لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي.

Introduction

متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو اضطراب شائع يحدث في 12٪ -20٪ من النساء في سن الإنجاب1،2. وهو مرض معقد يؤدي إلى أنماط الظاهرية المتغيرة التي تنطوي على المبيضين المتعدد الكيسات، الحيض غير النظامية والأدلة السريرية أو المختبرية من فرط الذكورة، وعادة ما يتم تشخيص عندما تلبي المرأة اثنين من المعايير الثلاثة3. أحد الجوانب السائدة في متلازمة تكيس المبايض، والعامل الرئيسي في مسببات الأمراض، هو الاختلالات الأيضية الموجودة في النساء المصابات بالمرض. النساء المصابات بمتلازمة تكيس المبايض أكثر من حالات مقاومة الأنسولين، وعدم تحمل الجلوكوز، والسمنة، ومتلازمة التمثيل الغذائي3،4،5،6. مقاومة الأنسولين ليست مجرد مظهر من مظاهر المرض، ولكن يعتقد أن تسهم في الإمراض من خلال قوة عمل هرمون اللوتين في المبيض مما يؤدي إلى زيادة إنتاج الاندروجين7،8. ويعتقد أن مقاومة الأنسولين لها العديد من الأصول المحتملة ولكن الدراسات تشير إلى أنه قد يكون بسبب أنماط غير طبيعية من مستقبلات الأنسولين مما يشير إلى 9,10. وقد قيمت الدراسات مقاومة الأنسولين في مرضى PCولينوس باستخدام تقنية معيار الذهب من المشبك hyperinsulinemic-euglycemic11,12,13,14,15. النساء المصابات بذلك، بغض النظر عن مؤشر كتلة الجسم، يتمتعن بمستويات أعلى من مقاومة الأنسولين مقارنة بالضوابط. يضعف التحكم في الأنسولين على إنتاج الجلوكوز في اضطرابات مقاومة الأنسولين مما يؤدي إلى إنتاج الجلوكوز الزائد. على سبيل المثال، مرضى السكري قد زادت معدلات جلوكونيوجينيسيس وضعف قمع انحلال الجليكوجين16. وعلاوة على ذلك، لوحظ ضعف قمع إنتاج الجلوكوز في الفئران السكري17. على الرغم من أن الدراسات المشبك يمكن أن تعطي قياس مقاومة الأنسولين، إلا أن القليل من الدراسات في PCولين مبايسول الخماسي الكلور تركز على القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز في حالات الصيام والتغذية. وهذا يتطلب استخدام ضخ متتبع الجلوكوز غير المشع وقياسه عن طريق قياس الطيف الكتلي.

وقد استخدمت نماذج الحيوانات على نطاق واسع في بحوث PCOS. تم إنشاء كل من نماذج العجاف والسمنة من نوع PCوس مورين عن طريق إدارة الاندروجين قبل الولادة, prepubertally, أو ما بعد pubertally18. نماذج القوارض متلازمة تكيس المبايض تظهر أيضا الاختلافات الأيضية مقارنة مع الضوابط الخاصة بهم. أظهرت البيانات السابقة من مختبرنا اختبارات تحمل الجلوكوز غير الطبيعية (GTT) في نماذج فأرة PCOS (الهزيل والبدناء) ، بما يتفق مع أدب PCOS البشري19. استخدام نموذج العجاف والسمنة يسمح بمزيد من التحقيق في الاختلافات الأيضية. على وجه التحديد، يسمح هذا النموذج بتقييم معدل إنتاج الجلوكوز مباشرة باستخدام متتبعات الجلوكوز النظيرية. واحدة من الأكثر استخداما مستقرة تتبع الجلوكوز النظائري هو [6,6-2H2]الجلوكوز. [6,6-2H2]يمكن قياس إثراء الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات كما هو موضح سابقا20.

في هذه الدراسة، كان هدفنا هو قياس معدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في حالة الصيام والجلوكوز الغنية في فئران PC أو إس باستخدام ضخ الجلوكوز النظائري. ويمكن تطبيق هذه التقنيات على مجموعة واسعة من التجارب التي تنطوي على حركية الجلوكوز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة لكلية بايلور للطب.

1. إعداد [6,6-2H2] الجلوكوز

  1. قبل يوم واحد من الإجراء، قم بإعداد متتبع الجلوكوز النظيري المستقر في المحلول الملحي الطبيعي. لهذه التجربة، [6,6-2H2] تم استخدام الجلوكوز كمتتبع لقياس معدل ظهور الجلوكوز البلازما.
    ملاحظة: في هذه التجربة، تم قياس إنتاج الجلوكوز أثناء الصيام والحالات الغنية بالجلوكوز، لذلك تم إعداد نظائر الجلوكوز في تحضيرين مختلفين. إعداد الحلول بطريقة أن الجرعة النهائية غرس ستكون قريبة من 1 ملغ / (kg·min) و 2 ملغ / (كغ · دقيقة) ، على التوالي. وقد تم تحسين هذه التركيزات من خلال العديد من الدراسات التجريبية السابقة.
  2. إعداد أول غرس مع الجلوكوز فقط [6,6-2H2] كمتتبع لتمثيل حالة الصيام عن طريق حل المعقمة والبيروجين الحرة [6,6-2H2] الجلوكوز في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ معقمة.
  3. إعداد غرس الثاني عن طريق حل كل من [6,6-2H2] متتبع الجلوكوز جنبا إلى جنب مع الجلوكوز غير النظائري (~ 20 ملغ /كغ·دقيقة) في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ معقمة لمحاكاة حالة تغذية.
    ملاحظة: في التجربة الحالية، تم استخدام ضخ معدل ثابت جاهز من [6,6-2H2] الجلوكوز في (~) 1.08 ملغ/(kg·min) (حالة الصيام) و (~) 1.9 ملغم/كغ·دقيقة (حالة غنية بالجلوكوز). من أجل تقليد "حالة الجلوكوز الغنية"، تم تعيين معدل ضخ D-الجلوكوز في (~) 18.8 ملغ /(kg·min).
  4. بمجرد إعداد الحلول، قم بتصفية الحلول العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية. قم بتدفئة الحلول لدرجة حرارة الغرفة قبل التسريب. تحميل الحلول على المحاقن 1 مل prelabeled.
  5. إعداد المضخة لتسهيل ضخ معدل ثابت تستعد من غرس الأولى (لحالة القاعدية) التي تحتوي على التتبع فقط، وبرنامج المضخة لضخ معدل ثابت من النظائر في 150 ميكرولتر / ساعة لمدة 3 ساعة.
  6. في نهاية إعداد الصيام 3 ح، واستبدال الحقنة الأولى بثرس مع حقنة غرس الثانية التي تحتوي على التتبع النظيري والجلوكوز D (للدولة تغذية محاكاة)، ورئيس ضخ ل15 دقيقة intial في 600 ميكرولتر / ساعة. تعيين المضخة إلى ضخ معدل ثابت في 150 ميكرولتر / ساعة ل3 ساعة إضافية.

2. إعداد تجارب التسريب

  1. إزالة الفئران من أقفاص منازلهم ووضعها في أقفاص الصيام 3 ساعة قبل بدء التجربة. لهذه التجربة، تم استخدام فئران أنثى عمرها 4 أشهر من سلالة C57BL/6J.
    ملاحظة: لا يتطلب هذا الإجراء أي مسكن قبل أو أثناء العملية نظرا لطبيعته طفيفة التوغل.
  2. تجميع معدات caging عن طريق تجميع الفئران في عدد محدد من الفئران لكل مضخة الأنسولين. ضع أقساما فوق قاعدة مسطحة ومستقرة لإنشاء أكشاك فردية للفئران. من المهم الوصول إلى قسطرة الوريد الذيل للتسريب لتشغيل، لذلك تأكد من أن هناك درجة في الجزء السفلي من باب القفص.
    ملاحظة: تم إجراء الأقفاص المعروضة في الفيديو خصيصا لهذه التجربة. الأقفاص واضحة ومصص (مصنوعة من زجاج شبكي) هناك قاعدة مسطحة ومستقرة (معدات التكاتج القياسية) التي تجلس عليها الأقسام. يتكون هذا الإعداد من عدة قطع للسماح بسهولة الإعداد في بيئات مختلفة عديدة اعتمادا على ارتفاع الجدول واحتياجات المجرب. الباب إلى قفص الشرائح لإغلاق ولديه درجة في الجزء السفلي للسماح للذيل لتناسب من خلال.
  3. تجميع المحاقن 1 مل تحتوي على 1 مل من غرس القاعدية، ومن ثم الاتصال أنابيب مضخة التسريب باستخدام أنابيب البولي ايثيلين 0.28 مم معرف × 0.61 ملم.
  4. إعداد مضخة التسريب عن طريق تحديد معدل إلى 150 ميكرولتر / ساعة، وهو المعدل الأساسي.
  5. سخني حمام مائي إلى 48 درجة مئوية.
  6. قم بإعداد محطة إدخال القسطرة المجاورة لحمام الماء الذي يحتوي على إبر 30 G 0.5 بوصة، و0.3 مم معرف × 0.64 مم أنابيب سيلاستيك، وشريط إرسال واستقبال واضح 1 بوصة.
  7. بعد 3 ساعة من الصيام، ابدأ عملية إدخال القسطرة، والتي هي مفصلة أدناه.

3. إدخال القسطرة

  1. حدد ماوس واحد ووضعه في حامل آمن مع الوصول إلى الذيل. مثال على ما يجب استخدامه هو زجاجة مقطعة إلى نصفين مع درجة للذيل. ضع الحامل على قاعدة مسطحة. ضع شريط قطعة على الجزء القريب من الذيل للسماح مساحة لإدراج القسطرة أكثر distally.
    ملاحظة: يجب أن يكون نوع الشريط الذي تم اختياره لهذه المهمة معتدل القوة واللصق. تم استخدام شريط وضع العلامات الورقي متعدد الأغراض في هذه التجربة لأنه خفيف وسهل التقشير.
  2. إعداد القسطرة (30 إبرة G تعلق على أنابيب 0.3 ملم silastic وPE- 10 تم تعقيم الغاز) عن طريق إرفاقه إلى حقنة 1 مل تحتوي على تدفق ملحي معقم heparinized. اغسل القسطرة برفق.
  3. جلب الماوس إلى حمام الماء وإدراج الذيل في حمام الماء لمدة 30-45 ق تقريبا. وهذا يساعد على توسيع الأوعية الدموية الذيل لوضع القسطرة.
  4. إجراء إدخال القسطرة في ظل ظروف معقمة. مرة واحدة يتم تسخين الذيل، وتنظيف الذيل مع مناديل البنزالكونيوم ووضع النحاس الصغيرة، مشبك التمساح بلا أسنان، التي كانت محاطة سابقا إلى شكل الذيل، كما tourniquet في نهاية قريبة من الذيل. تصور الوريد الذيل الجانبي تحت عدسة مكبرة، ومن ثم إدراج بعناية القسطرة في الوريد الذيل وسحب الإبرة. قم بغسل المحلول برفق لضمان ثبات القسطرة.
  5. التفاف قطعة من شريط الإرسال والاستقبال 1 بوصة حول موقع الإدراج لتأمين القسطرة. إزالة tourniquet الصغيرة من الذيل.

4. ضخ انشاء والتسريب الأول

  1. ضع الماوس في قفصه الفردي واغلق الباب المنزلق ، مما يضمن أن الذيل يبرز من خلال الشق ويبقى خارج القفص.
  2. ضع قطعة إضافية من الشريط على القسطرة بأكملها والذيل لتأمينها إلى لوحة الأساس للقفص. متعددة الأغراض الملونة، تم استخدام الشريط التسمية لهذه الخطوة.
  3. افصل التدفق عن قسطرة الوريد الذيل وضع مشبك صغير على أنابيب القثطار للوقاية من التدفق الخلفي أثناء توصيل الخط المغرس من المضخة.
  4. مرة واحدة متصلة بشكل آمن، وإزالة المشبك وتدفق مع حل فتيلة، والذي يتكون من غرس. تأكد من أن الحل واضح في الأنابيب وليس ملطخة بالدماء.
  5. دون وقت بدء التسريب لضمان تشغيله في الوقت الإجمالي الذي يبلغ حوالي 3 ح. إذا تم استخدام أقفاص متعددة في وقت واحد ، فيجب أن تكون متداخلة لإدارة أوقات التسريب بشكل فعال.
  6. بمجرد ملاحظة خطوط التسريب لتكون تعمل بشكل صحيح، وإزالة الغطاء من الماوس. وضع الفراش القياسية حول الماوس.
  7. بدء التسريب مع أول غرسة تحتوي على التتبع وتشغيله لمدة 3 ساعة بشكل مستمر. لمدة التسريب، والاستمرار في التحقق من رفاهية الفئران، فضلا عن خطوط التسريب. تأكد من أن أنابيب التسريب مؤمنة بشكل صحيح وأنه لا توجد تسربات من نقاط اتصال الخط.

5. أخذ عينات الدم

  1. بعد اكتمال التسريب الأول ، أوقف التسريب ، ضع مشبكا على الأنابيب الانسيابية على القسطرة لمنع التدفق الخلفي. إزالة الفئران بلطف من المرفقات دون إزعاج القسطرة من أجل جمع الدم. ضعهم في مكان بالقرب من الأقفاص لسحب الدم. لهذه التجربة ، خضعت الفئران لفينبونكتور الخد باستخدام لانسيت 4 ملم.
  2. جمع ~ 75 ميكرولتر من الدم في القارورة المطلوبة. لإلغاء حماية العينات استعدادا لقياس الطيف الكتلي، أضف ما يقرب من 15 ميكرولتر من الدم إلى 500 ميكرولتر من الأسيتون. يمكن استخدام الدم المتبقي للتحقق من مستوى السكر في الدم عن طريق جهاز الجلوكومتر و/ أو الطرد المركزي لفصل البلازما عن فحوصات الهرمونات المستقبلية.

6. ضخ الثانية

  1. إزالة الضخات من مضخات الحقنة عن طريق فصل الأنابيب من المحاقن واستبدالها بثاني يحتوي على التتبع جنبا إلى جنب مع الجلوكوز. كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.7 باستخدام ضخ الجلوكوز النظيري الغني بالجلوكوز.
    1. للوصول إلى حالة ثابتة، قم بتشغيل بولوس من غرس الثاني في 600 ميكرولتر / ساعة لمدة 15 دقيقة. لاحظ وقت البدء لكل مجموعة من الأقفاص. خفض معدل التسريب إلى 150 ميكرولتر / ساعة لإكمال 3 ساعة من إجمالي وقت التسريب.
  2. كرر الخطوتين 5.1 و 5.2.
  3. أوقف مضخة التسريب وأزل قسطرة الوريد الذيل برفق، وممارسة الضغط في مواقع القسطرة حتى يتوقف النزيف، وإعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية.
  4. Santize وتطهير الإعداد caging جيدا مع الصابون والماء القياسية.
    ملاحظة: هذا إجراء البقاء على قيد الحياة. يمكن إعادة الفئران إلى الأقفاص والاحتفاظ بها لمزيد من التجهيزات إذا لزم الأمر. ويوصى بعدم إجراء أي عملية إضافية للتكسير لمدة أسبوع على الأقل بعد هذا الإجراء لضمان الرفاه الكافي للحيوانات.

7. قياس الطيف الكتلي

  1. أرسل العينات لقياس الطيف الكتلي.
  2. تحاليل
    1. قياس الإثراء النظائري للجلوكوز [6,6-2H2] عن طريق قياس خواص الغاز - قياس الطيف الكتلي (GCMS) باستخدام مشتقة الخماسي21,22. باختصار، تتضمن هذه الطريقة إعداد مشتق بنتاسيتات الجلوكوز، يليه تحليل العينة باستخدام GCMS 20,22.
  3. الحسابات
    1. إجراء جميع القياسات الحركية في ظل ظروف الحالة الثابتة. تم حساب إجمالي معدل ظهور الجلوكوز في البلازما (الجلوكوز ريا) من إثراء M +2 من الجلوكوز [6,6-2H2] في البلازما باستخدام معادلات تخفيف النظائر المنشأة21. في ظل ظروف الحالة الثابتة ، يفترض أن معدل ظهور الجلوكوز يساوي معدل اختفاء الجلوكوز. معدل إنتاج الجلوكوز الداخلي (ملغم/(kg·min)) (GPR) = الجلوكوزيرا - الجلوكوز الخارجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام معادلات تخفيف النظائر الموصوفة سابقا، تم حساب إجمالي معدل الجلوكوز في البلازما (glucoseRa) من إثراء M+2 من الجلوكوز [6,6-2H2] في ظروف الصيام والجلوكوز الغنية باستخدام مشتقة بنتاسيتات21. في ظل ظروف الحالة الثابتة ، يفترض أن معدل ظهور الجلوكوز يساوي معدل اختفاء الجلوكوز. في مجموعة التحكم، كان إجمالي الجلوكوز 19.98 ± 2.53 ملغم/(كجم·دقيقة) بعد صيام 6 ساعة و25.80 ± 1.76 ملغم/(كجم·دقيقة) خلال الظروف الغنية بالجلوكوز. باستخدام الحساب المذكور أعلاه، كان معدل السكر في الدم 19.08 ± 2.53 ملغم/(kg·min) بعد 6 ساعة صيام و8.56 ± 1.40 ملغم/(kg·min)) في ظروف غنية بالجلوكوز (الجدول 1 والشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: معدل إنتاج الجلوكوز في ظروف الصيام والجلوكوز الغنية يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صوم غني بالجلوكوز
(متوسط ± SD) (متوسط ± SD)
الجلوكوز ريا، ملغم/(kg.min) 19.98 ± 2.53 25.80 ± 1.76
GPR، ملغم/ (kg.min) 19.08 ± 2.53 8.56 ± 1.40
ريا, معدل ظهور الجلوكوز; معدل إنتاج الجلوكوز

الجدول 1: رع وGPR في ظروف الصيام والجلوكوز الغنية

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فرط السكر في الدم والتمثيل الغذائي غير طبيعي الجلوكوز / التوازن هي ملامح PCOS. يتم الحفاظ على مستوى السكر في الدم من خلال مزيج من الجلوكوز من النظام الغذائي وإنتاج الجلوكوز عن طريق انحلال الجليكوجين وجلوكونيوجينيسيس و جليكوجينيسيس، تحت سيطرة الهرمونات والإنزيمات. يتم قمع إنتاج الجلوكوز الكبدي من خلال وجود زيادة مستويات الجلوكوز المتداولة. في اضطرابات التمثيل الغذائي غير طبيعي الجلوكوز، وتنظيم قمع إنتاج الجلوكوز للخطر مما يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم. في حين أظهرت العديد من الدراسات قياسات غير مباشرة لإنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج حيواني يكيس المباياء، إلا أن القليل منها قام بقياس إنتاج الجلوكوز الكبدي مباشرة. في هذه الدراسة نصف طريقة مباشرة لقياس معدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في فئران متعددة في نفس الوقت. ويمكن تطبيق هذه التقنية على العديد من الدراسات التي تنطوي على استقلاب الجلوكوز في نماذج الماوس المختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه التقنية بمثابة الأساس الذي يمكن أن تطبق عليه قياسات إضافية، مثل قياس تولد الجلوكونوجينيسيس والتحلل الجليكوجين20،23.

المكونات الحاسمة لهذه التجربة هي إدخال القسطرة وتحديد القياسات الدقيقة للجلوكوز [6,6-2H2] والجلوكوز الطبيعي عند إنشاء حلول التسريب من أجل إجراء GCMS بشكل كاف. وصف تقنية إدخال القسطرة المستخدمة من قبل ماريني وآخرون 200624. على الرغم من وجود طرق الغازية لإدارة التسريبات وأخذ العينات عن طريق الشريان السباتي والقسطرة الوريدية الوداجي25,26,27, إدراج قسطرة الوريد الذيل طفيفة التوغل يحقق نفس الأهداف بطريقة أقل الغازية وأقل كثافة من الوقت. على الرغم من أنه يمكن وضع قسطرة اثنين في كل وريد ذيل ، واحدة للغرس وواحدة لأخذ العينات ، استخدمنا قسطرة واحدة للتسريب ثم قمنا بأخذ العينات عبر لحم الغزال الخد حيث لم يكن هناك سوى نقطتين زمنيتين لأخذ العينات. ومع ذلك ، إذا تضمنت دراسة نقاط زمنية متعددة لأخذ العينات ، فإن إدخال قسطرة وريد الذيل الثاني يمكن أن يساعد في تسهيل هذا28.

القياسات الدقيقة حاسمة بالنسبة للحسابات التي تنطوي على قياس الطيف الكتلي لضمان نتائج دقيقة. استخدمنا متتبع الجلوكوز لقياس مظهر الجلوكوز هو [6,6-2H2]الجلوكوز21. على الرغم من أن أجهزة التتبع غير المشعة الأخرى قد استخدمت في دراسات أخرى، إلا أن هذا النظير المستقر يستخدم عادة في مختبرنا20. ويفضل تتبع الجلوكوز مستقرة على تتبع الجلوكوز المشعة بسبب تحسن ملف السلامة، والحضور الطبيعي، وعدم وجود نصف العمر التي تؤثر على وقت الدراسة، والقدرة على الجمع بين التتبع المختلفة29. اختيار التتبع متروك لتقدير وخبرة الباحثين الذين يجرون الدراسة.

هناك بعض القيود على هذه الدراسة، بما في ذلك الطلب التقني للإجراء. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التقنيات الأكثر توغلا للقسطرة (أي كاثرة الشريان السباتي والوريد الوداجي الخارجي) ، فإن هذه التقنية واضحة وفعالة وأقل مرضا. إذا كان استخدام اثنين من القسطرة الوريد الذيل، كانت هناك تقارير عن قيم الإثراء الخاطئة من ضخ تتداخل مع القسطرة أخذ العينات24. ومع ذلك ، في معظم الدراسات الحاجة إلى عينات متعددة لا مبرر لها لأن الحالة الثابتة معروفة. وأخيرا، على الرغم من أن قياس الطيف الكتلي يعطي قياسات دقيقة، إلا أنه يتطلب مهارات وخبرات وتكلفة إضافية.

في هذه الدراسة، نقوم بوصف طريقة واضحة ودقيقة لقياس معدل إجمالي إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PCOS. وينبغي أن تكون هذه التقنية بمثابة الأساس لدراسات متعددة تنطوي على استقلاب الجلوكوز من نماذج الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح التدريب من قبل قسم أمراض النساء والتوليد، وكلية بايلور للطب (ALG) ومنحة البحث R-01 (منحة # DK114689) لCSB، SC وJM من المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride solution McKesson 275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe VWR 75846-756 Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape 3M 70200400169
1-inch Labeling tape Fisher GS07F161BA Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush McKesson 191-MIH-2235 One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets Fisher Scientific NC9891620 5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone Sigma-Aldrich 650501
Advanced hot plate stirrer VWR 97042-602 Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles Health Warehouse A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles Medvet 305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
Beaker, 1000 mL Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap Fisher Scientific 05-719-120 For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet Amazon Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5% Sigma-Aldrich G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD VWR 62999-042
Magnifying glass Amazon Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance Ohaus Adventurer Pro AV264C Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL Sigma-Aldrich B0158-12EA Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump Harvard Apparatus 70-3024A
Plexiglass sheet Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers Any brand; used to cage mice during infusion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
  2. Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
  3. Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
  4. Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
  5. Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
  6. Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
  7. Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
  8. Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
  9. Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
  10. Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
  11. Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
  12. Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
  13. Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
  14. Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
  15. Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
  16. Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
  17. Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
  18. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  19. Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
  20. Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
  21. Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
  22. Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
  23. Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
  24. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
  25. Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
  26. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
  27. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
  28. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
  29. Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).

Tags

الطب، العدد 181، إنتاج الجلوكوز الكبدي، PC أو إس، ضخ الجلوكوز النظيري، مقاومة الأنسولين، تسريب الوريد الذيل
تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gannon, A. L., Chacko, S. K.,… More

Gannon, A. L., Chacko, S. K., Didelija, I. C., Marini, J. C., Blesson, C. S. Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (181), e62991, doi:10.3791/62991 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter