Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62991
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Reproductive Endocrinology and Infertility, Baylor College of Medicine, 2Family Fertility Center, Texas Children’s Hospital, 3Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 4Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Summary

מחקר זה מתאר את המדידה הישירה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי יציב באמצעות וריד הזנב הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז יחד.

Abstract

תסמונת השחלות הפוליצסטיות (PCOS) היא מחלה נפוצה המביאה להפרעות בחילוף החומרים של גלוקוז, כגון עמידות לאינסולין ואי סבילות לגלוקוז. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של המחלה והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה. מעט מאוד מחקרים כימתו את ייצור הגלוקוז בכבד ישירות בדגמי PCOS באמצעות מעקבים לא רדיואקטיביים של גלוקוז. במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת העשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז - ספקטרומטריית מסה (GCMS). הליך זה כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב הגלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. ההעשרה של [6,6-2H2]] גלוקוז נמדדת באמצעות נגזרת פנטאצטאט ב- GCMS. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מחקרים מעורבים מדידה ישירה של קצב ייצור הגלוקוז בכבד.

Introduction

תסמונת השחלות הפוציסטיות (PCOS) היא הפרעה נפוצה המתרחשת ב 12%-20% של נשים בגיל הרבייה1,2. זוהי מחלה מורכבת וכתוצאה מכך פנוטיפים משתנים מעורבים שחלות פוליציסטיות, menses לא סדיר וראיות קליניות או מעבדה של hyperandrogenemia, והוא מאובחן בדרך כלל כאשר אישה עומדת בשניים משלושת הקריטריונים3. היבט דומיננטי של PCOS, וגורם מפתח בפתוגנזה שלה, הוא דעים מטבוליים שנמצאים אצל נשים שיש להם את המחלה. נשים עם PCOS יש שכיחות גבוהה יותר של תנגודת לאינסולין, אי סבילות לגלוקוז, השמנת יתר, תסמונת מטבולית3,4,5,6. תנגודת לאינסולין היא לא רק ביטוי של המחלה, אבל הוא חשב לתרום פתוגנזה שלה על ידי potentiating הפעולה של הורמון תחליב בשחלה ובכך מוביל ייצור אנדרוגן מוגבר7,8. תנגודת לאינסולין נחשבת יש מספר מקורות אפשריים אבל מחקרים מראים שזה יכול להיות בגלל דפוסים חריגים של קולטן אינסולין איתות9,10. מחקרים העריכו עמידות לאינסולין בחולי PCOS באמצעות טכניקת הזהב הסטנדרטית של מלחציים היפראינסולנמיים-אוגליקמיים11,12,13,14,15. לנשים עם PCOS, ללא קשר ל- BMI, יש רמות גבוהות יותר של תנגודת לאינסולין בהשוואה לבקרות. בקרת אינסולין על ייצור גלוקוז נפגעת בהפרעות של תנגודת לאינסולין המובילה לייצור עודף גלוקוז. לדוגמה, חולי סוכרת יש שיעורים מוגברים של gluconeogenesis ודיכוי לקוי של גליקוגנוליזה16. יתר על כן, דיכוי לקוי של ייצור גלוקוז נצפתה בחולדות סוכרת17. למרות שמחקרים מהדקים יכולים לתת מדידה של תנגודת לאינסולין, מחקרים מעטים ב- PCOS מתמקדים במדידה ישירה של ייצור גלוקוז במדינות צום ומזון. זה דורש שימוש עירוי מעקב איזוטופי איזוטופי לא רדיואקטיבי ומדידה באמצעות ספקטרומטריית מסה.

דגמים של בעלי חיים שימשו בהרחבה במחקר PCOS. מודלים מוריניים PCOS רזה והשמנת יתר נוצרו על ידי מתן אנדרוגנים לפני ההפלגה, prepubertally, או לאחר pubertally18. דגמי PCOS מכרסמים מדגימים גם הבדלים מטבוליים בהשוואה לבקרות שלהם. נתונים קודמים מהמעבדה שלנו הדגימו בדיקות סובלנות גלוקוז חריגות (GTT) בדגמי עכבר PCOS (רזה והשמנת יתר), העולים בקנה אחד עם ספרות PCOS אנושית19. שימוש במודל בעלי חיים רזה והשמנת יתר מאפשר חקירה נוספת של הבדלים מטבוליים. באופן ספציפי, מודל זה מאפשר הערכה של קצב ייצור הגלוקוז ישירות באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי. אחד ממעקב הגלוקוז האיזוטופי היציב הנפוץ ביותר הוא [6,6-2H2]גלוקוז. ניתן למדוד את העשרת הגלוקוז [6,6-2H2]באמצעות נגזרת פנטאצטאט כפי שתואר קודם לכן20.

במחקר זה, המטרה שלנו הייתה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בצום ובמצב עשיר בגלוקוז בעכברים PCOS באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי. טכניקות אלה ניתן ליישם על מגוון רחב של ניסויים מעורבים קינטיקה גלוקוז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה.

1. הכנת [6,6-2H2]גלוקוז

  1. יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים. בניסוי זה, [6,6-2H2]גלוקוז שימש כמעקב למדידת קצב הופעת הגלוקוז בפלזמה.
    הערה: בניסוי זה נמדדו ייצור גלוקוז במהלך צום ותנאים עשירים בגלוקוז, ולכן איזוטופ הגלוקוז הוכן בשתי תכשירים שונים. הכן את הפתרונות באופן כזה כי המינון הסופי infusing יהיה קרוב 1 מ"ג /(kg·min) ו 2 מ"ג /(kg·min), בהתאמה. ריכוזים אלה היו אופטימיזציה על ידי מספר מחקרי פיילוט קודמים.
  2. הכן את ההטמה הראשונה עם גלוקוז [6,6-2H2] בלבד כמעקב כדי לייצג את מצב הצום על ידי המסת גלוקוז סטרילי ופירוגן [6,6-2H2] בתמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9%.
  3. הכן את ההטמה השנייה על ידי המסת שניהם [6,6-2H2]מעקב גלוקוז יחד עם גלוקוז לא איזוטופי (~ 20 מ"ג / קילוגרם) בתמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9% כדי לדמות את מצב המזון.
    הערה: בניסוי הנוכחי, עירוי קצב קבוע ראשוני של [6,6-2H2]גלוקוז ב (~) 1.08 מ"ג /(קג"מ) (מצב צום) ו (~) 1.9 מ"ג/ק"ג (מצב עשיר בגלוקוז) שימש. על מנת לחקות את 'מצב עשיר גלוקוז', שיעור עירוי D-גלוקוז נקבע על (~) 18.8 מ"ג /(kg·min).
  4. לאחר הכנת הפתרונות, לסנן את הפתרונות עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (50 °F). מחממים את הפתרונות לטמפרטורת החדר לפני העירוי. טען את הפתרונות על מזרקי 1 מ"ל עם תווית מראש.
  5. הגדר את המשאבה כדי להקל על עירוי קצב קבוע של אינפוזאט הראשון (עבור מצב בסיסי) המכיל רק את המעקב, ולתכנת את המשאבה עבור עירוי קצב קבוע של איזוטופ ב 150 μL / שעה עבור 3 שעות.
  6. בסוף צום 3 שעות להגדיר, להחליף את המזרק הראשון infusate עם מזרק אינפוזיט השני המכיל את המעקב האיזוטופי D-גלוקוז (עבור מצב הפד מדומה), וראש עירוי עבור 15 דקות intial ב 600 μL / שעה. הגדר את המשאבה לעירוי קצב קבוע ב 150 μL / שעה עבור 3 שעות נוספות.

2. הקמת ניסויי עירוי

  1. מוציאים את העכברים מכלובי הבית שלהם ומניחים אותם בכלובי הצום שלהם 3 שעות לפני תחילת הניסוי. לניסוי זה נעשה שימוש בעכברות בנות 4 חודשים מזן C57BL/6J.
    הערה: הליך זה אינו דורש כל שךך לפני או במהלך ההליך בהתחשב באופיו הפלגני המינימלי.
  2. להרכיב את ציוד caging על ידי קיבוץ העכברים למספר מוגדר של עכברים לכל משאבת אינסולין. מניחים מחיצות על בסיס שטוח ויציב כדי ליצור דוכנים בודדים לעכברים. חשוב שתהיה גישה לקטטר הווריד הזנב עבור עירוי לרוץ, כדי להבטיח כי יש חריץ בתחתית דלת הכלוב.
    הערה: כלובים המוצגים בסרטון נעשו במיוחד עבור ניסוי זה. הכלובים נקיים ועשויים מפלקסיגלס. יש בסיס שטוח ויציב (ציוד קליט סטנדרטי) שעליו יושבות המחיצות. התקנה זו מורכבת ממספר חלקים כדי לאפשר קלות התקנה במספר סביבות שונות בהתאם לגובה הטבלה ולצרכים של הנסיין. הדלת לכלוב מחליקה להיסגר ויש לה חריץ בתחתית כדי לאפשר לזנב להיכנס.
  3. להרכיב את מזרקי 1 מ"ל המכילים 1 מ"ל של אינפוסאט בזאלי, ולאחר מכן להתחבר צינורות משאבת עירוי באמצעות צינורות פוליאתילן 0.28 מ"מ מזהה x 0.61 מ"מ.
  4. הכן את משאבת עירוי על ידי הגדרת הקצב ל 150 μL / שעה, שהוא שיעור בזאלי.
  5. מחממים אמבט מים ל 48 °C (70 °F).
  6. הכן את תחנת החדרת הצנתר הסמוכה לאמבט המים המכיל את המחטים בגודל 30 G 0.5 אינץ', מזהה 0.3 מ"מ x 0.64 מ"מ צינורות סילאסטיים, וסרט טרנספורי ברור בגודל 1 אינץ'.
  7. לאחר 3 שעות של צום, להתחיל את תהליך החדרת קטטר, אשר מפורט להלן.

3. החדרת קטטר

  1. בחר עכבר אחד והצב אותו במחזיק מאובטח עם גישה לזנב. דוגמה של מה להשתמש הוא בקבוק לחתוך לשניים עם חריץ לזנב. מניחים את המחזיק על בסיס שטוח. מניחים סרט הדבקה על החלק הפרוקסימלי של הזנב כדי לאפשר מקום להכנסת קטטר בצורה מרוקנת יותר.
    הערה: סוג הקלטת שנבחרה עבור משימה זו חייב להיות כוח ודבק מתונים. בניסוי זה נעשה שימוש בסרט תיוג רב תכליתי ומבוסס נייר, שכן היא קלה וקלה לקלף אותה.
  2. הכן את הקטטר (מחט 30 G מחובר צינורות סילאסטיים 0.3 מ"מ ו PE- 10 היו מעוקרים גז) על ידי חיבורו מזרק 1 מ"ל המכיל סומק מלוח סטרילי. לשטוף את הקטטר בעדינות.
  3. להביא את העכבר לאמבט המים ולהכניס את הזנב באמבט המים במשך כ 30-45 s. זה עוזר להרחיב את כלי הזנב עבור מיקום קטטר.
  4. בצע את החדרת הצנתר בתנאים סטריליים. לאחר שהזנב מתחמם, נקו את הזנב עם מגבוני בנזלקוניום והנחו מהדק תנין קטן וחסר שיניים, שהיה מקודם בעבר לצורת הזנב, כחוסם עורקים בקצה הפרוקסימלי של הזנב. דמיינו את וריד הזנב לרוחב מתחת לזכוכית מגדלת, ואז מכניסים בזהירות את הקטטר לווריד הזנב ונסוגים את המחט. יש לשטוף את הפתרון בעדינות כדי להבטיח טפיחה של הקטטר.
  5. עטפו חתיכה של סרט טרנספורי בגודל 1 אינץ' סביב אתר הכניסה כדי לאבטח את הצנתר. הסר את חוסם העורקים הקטן מהזנב.

4. הגדרת עירוי וחליטה ראשונה

  1. מניחים את העכבר בכלוב הבודד שלו וסוגרים את דלת ההזזה, ומבטיחים שהזנב בולט דרך החריץ ונשאר מחוץ לכלוב.
  2. מניחים פיסת סרט נוספת על כל הקטטר והזנב כדי לאבטח אותו ללוח הבסיס של הכלוב. עבור שלב זה, סרט צבעוני מרובה תכליתים.
  3. נתק את הסומק מצנתר הוורידים של הזנב והניח מהדק קטן על הצינורות הסילאסטיים של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית תוך חיבור קו החדירה מהמשאבה.
  4. לאחר חיבור מאובטח, להסיר את המהדק לשטוף עם פתרון priming, אשר מורכב infusate. ודא כי הפתרון ברור צינורות ולא מוכתם בדם.
  5. שים לב לזמן החניכה של עירוי כדי להבטיח כי הוא פועל לזמן הכולל של כ 3 שעות. אם כלובים מרובים משמשים בו זמנית, הם צריכים להיות מתנדנדים לנהל זמני עירוי ביעילות.
  6. לאחר קווי עירוי הם ציינו לתפקד כראוי, להסיר את הכיסוי מן העכבר. מקם מצעים סטנדרטיים סביב העכבר.
  7. התחל את עירוי עם אינפוזיט הראשון המכיל את המעקב ולהפעיל אותו במשך 3 שעות ברציפות. למשך העירוי, להמשיך לבדוק את רווחת העכברים, כמו גם קווי עירוי. ודא כי צינורות עירוי מאובטח כראוי וכי אין דליפות מנקודות החיבור הקו.

5. דגימת דם

  1. לאחר העירוי הראשון הושלם, להפסיק את עירוי, מניחים מלחציים על צינורות sylastic על הקטטר כדי למנוע את זרימת הגב. מוציאים בעדינות את העכברים מהמתחמים שלהם מבלי להפריע לצנתר כדי לאסוף דם. הנח אותם במקום ליד הכלובים להוצאת דם. לניסוי זה, העכברים עברו ווניפונקטור לחי באמצעות 4 מ"מ lancet.
  2. לאסוף ~ 75 μL של דם בוויאלי הרצוי. כדי deproteinize דגימות כהכנה ספקטרומטריית מסה, להוסיף כ 15 μL של דם כדי 500 μL של אצטון. הדם הנותר יכול לשמש כדי לבדוק את רמת הגלוקוז בדם באמצעות glucometer ו/או צנטריפוגה כדי להפריד פלזמה לבדיקות הורמון בעתיד.

6. עירוי שני

  1. הסר את infusates מן משאבות המזרק על ידי ניתוק הצינורות מן המזרקים ולהחליף אותו עם infusate השני המכיל את המעקב יחד עם גלוקוז. חזור על שלבים 4.2 עד 4.7 באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי עשיר גלוקוז.
    1. כדי להגיע למצב יציב, להפעיל בולוס של אינפוזיט השני ב 600 μL / שעה במשך 15 דקות. שים לב לזמן ההתחלה עבור כל קבוצה של כלובים. להקטין את קצב עירוי ל 150 μL / שעה כדי להשלים את 3 שעות של זמן עירוי הכולל.
  2. חזור על שלבים 5.1 ו- 5.2.
  3. עצרו את משאבת העירוי והסירו בעדינות את צנתר וריד הזנב, החל לחץ באתרי הצנתר עד שהדימום ייפסק, והחזירו עכברים לכלובים הביתיים שלהם.
  4. יש להקפיד ולחטא את מערך ההזדקנות ביסודיות עם סבון ומים סטנדרטיים.
    הערה: זהו הליך הישרדות. עכברים ניתן להחזיר לכלובים ושמר על experiements נוספים במידת הצורך. מומלץ כי לא יבוצע הסברה נוספת למשך שבוע לפחות לאחר הליך זה כדי להבטיח רווחת בעלי חיים נאותה.

7. ספקטרומטריית מסה

  1. שלח את הדגימות לספקטרומטריית מסה.
  2. ניתוחים
    1. מדוד את ההעשרה האיזוטופית של [6,6-2H2]] גלוקוז על ידי גסכרומטוגרפיה - ספקטרומטריית מסה (GCMS) באמצעות נגזרת המחומש21,22. בקצרה, שיטה זו כרוכה בהכנת נגזרת המחומש של גלוקוז, ואחריה ניתוח מדגם באמצעות GCMS 20,22.
  3. חישובים
    1. בצע את כל המדידות הקינטיות בתנאי מצב יציבים. קצב הופעת הגלוקוז הכולל של פלזמה (גלוקוז Ra) חושב מהעשרת M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בפלזמה באמצעות משוואות דילול איזוטופים מבוססות21. בתנאי מצב יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. קצב ייצור הגלוקוז האדוגוגני (מ"ג/קג"מ)) (GPR) = גלוקוז - גלוקוז אקסוגני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, שיעור הגלוקוז הכולל בפלזמה (גלוקוזRa) חושב מהעשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בתנאי צום וגלוקוז עשירים בגלוקוז באמצעות נגזרת המחומש21. בתנאים יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. בקבוצת הביקורת, סך הגלוקוזRa היה 19.98 ± 2.53 מ"ג/(קג"מ) לאחר צום של 6 שעות ו-25.80 ± 1.76 מ"ג/ק"ג(ק"ג) בתנאים עשירים בגלוקוז. באמצעות החישוב המפורט לעיל, GPR היה 19.08 ± 2.53 מ"ג /(קג"מ) לאחר צום של 6 שעות ו-8.56 ± 1.40 מ"ג/ק"ג(ק"ג)) בתנאים עשירים בגלוקוז (טבלה 1 ואיור 1).

Figure 1
איור 1: קצב ייצור הגלוקוז בתנאים עשירים בצום ובגלוקוז אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

צום עשיר בגלוקוז
(ממוצע ± SD) (ממוצע ± SD)
גלוקוז Ra, מ"ג/(ק"ג.דקה) 19.98 ± 2.53 25.80 ± 1.76
GPR, מ"ג / (ק"ג.דקה) 19.08 ± 2.53 8.56 ± 1.40
Ra, שיעור הופעת הגלוקוז; GPR, קצב ייצור גלוקוז

טבלה 1: Ra ו- GPR בתנאים עשירים בצום וגלוקוז

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היפרגליקמיה ומטבוליזם גלוקוז חריג/הומאוסטזיס הם תכונות של PCOS. רמת הגלוקוז בדם נשמרת על ידי שילוב של גלוקוז מתזונה וייצור גלוקוז באמצעות גליקוגנוליזה וגלוקונוגנזה וגליקוגנזה, בשליטת הורמון ואנזימים. ייצור גלוקוז בכבד מדוכא על ידי נוכחות של רמות גלוקוז במחזור מוגבר. בהפרעות של חילוף חומרים חריג גלוקוז, ויסות של דיכוי ייצור גלוקוז נפגע המוביל היפרגליקמיה. בעוד שמחקרים רבים הדגימו מדידות עקיפות של ייצור גלוקוז בכבד במודל של בעלי חיים PCOS, מעטים מדדו את ייצור הגלוקוז בכבד ישירות. במחקר זה אנו מתארים דרך פשוטה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בעכברים מרובים בו זמנית. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים רבים מעורבים חילוף החומרים גלוקוז במודלים עכבר שונים. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש כבסיס שעליו ניתן ליישם מדידות נוספות, כגון מדידה של גלוקונוגנזה וגליקוגנוליזיס20,23.

המרכיבים הקריטיים של ניסוי זה הם החדרת צנתר והגדרת המדידות המדויקות של [6,6-2H2]גלוקוז טבעי בעת יצירת פתרונות עירוי על מנת לבצע כראוי GCMS. טכניקת החדרת הצנתר המשמשת מתוארת על ידי Marini et al. 200624. למרות שיש שיטות פולשניות של מתן חליטות ודגימה באמצעות עורק עורק עורקים וצנתרי וריד הצוואר25,26,27, החדרת צנתר וריד זנב זעיר פולשני משיגה את אותן מטרות בצורה פחות פולשנית ופחות אינטנסיבית בזמן. למרות שני קטטרים עשויים להיות ממוקמים בכל וריד זנב, אחד עבור infusing ואחד לדגימה, השתמשנו קטטר אחד עבור עירוי ולאחר מכן ביצע דגימה באמצעות הלחי venipuncture מאז היו רק שתי נקודות זמן עבור דגימה. עם זאת, אם מחקר כלל מספר נקודות זמן לדגימה, החדרת קטטר וריד זנב שני יכול לעזור להקל על זה28.

מדידות מדויקות חיוניות לחישובים הכוללים ספקטרומטריית מסה כדי להבטיח תוצאות מדויקות. השתמשנו במעקב הגלוקוז כדי למדוד את המראה של גלוקוז הוא [6,6-2H2]גלוקוז21. למרות שעוצבים לא רדיואקטיביים אחרים הועסקו במחקרים אחרים, זה איזוטופ יציב כי הוא נפוץ במעבדה שלנו 20. מעקב גלוקוז יציב עדיף על פני מעקב גלוקוז רדיואקטיבי בשל פרופיל בטיחות משופר, נוכחות טבעית, חוסר זמן חיים המשפיע על זמן המחקר, ואת היכולת לשלב עוקבים שונים29. הבחירה במעקב תלויה בשיקול דעתם ובמומחיותם של החוקרים המבצעים את המחקר.

ישנן כמה מגבלות של מחקר זה, כולל הדרישה הטכנית של ההליך. עם זאת, בהשוואה לטכניקות פולשניות יותר עבור צנתור (כלומר, קתירה של עורק הראש וריד הצוואר החיצוני), טכניקה זו היא פשוטה, יעילה, ופחות חולנית. אם משתמשים בשני צנתרים של וריד הזנב, היו דיווחים על ערכי העשרה שגויים מהחליטה המפריעה לקטטר הדגימה24. עם זאת, ברוב המחקרים הצורך בדגימות מרובות אינו מוצדק מכיוון שמצב יציב ידוע. לבסוף, למרות ספקטרומטריית מסה נותן מדידות מדויקות, זה דורש מיומנויות נוספות, מומחיות, ועלות.

במחקר זה, אנו מתארים דרך פשוטה ומדויקת למדוד את קצב ייצור הגלוקוז הכבד הכולל במודל עכבר PCOS. טכניקה זו צריכה לשמש כבסיס למחקרים מרובים מעורבים חילוף החומרים גלוקוז של מודלים עכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הכשרה על ידי המחלקה למיילדות וגינקולוגיה, מכללת ביילור לרפואה (ALG) ומענק מחקר R-01 (מענק # DK114689) עבור CSB, SC ו- JM מהמכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride solution McKesson 275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe VWR 75846-756 Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape 3M 70200400169
1-inch Labeling tape Fisher GS07F161BA Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush McKesson 191-MIH-2235 One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets Fisher Scientific NC9891620 5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone Sigma-Aldrich 650501
Advanced hot plate stirrer VWR 97042-602 Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles Health Warehouse A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles Medvet 305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
Beaker, 1000 mL Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap Fisher Scientific 05-719-120 For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet Amazon Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5% Sigma-Aldrich G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD VWR 62999-042
Magnifying glass Amazon Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance Ohaus Adventurer Pro AV264C Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL Sigma-Aldrich B0158-12EA Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump Harvard Apparatus 70-3024A
Plexiglass sheet Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers Any brand; used to cage mice during infusion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
  2. Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
  3. Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
  4. Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
  5. Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
  6. Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
  7. Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
  8. Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
  9. Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
  10. Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
  11. Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
  12. Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
  13. Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
  14. Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
  15. Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
  16. Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
  17. Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
  18. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  19. Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
  20. Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
  21. Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
  22. Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
  23. Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
  24. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
  25. Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
  26. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
  27. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
  28. Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
  29. Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).

Tags

תרופות גיליון 181 ייצור גלוקוז בכבד PCOS עירוי גלוקוז איזוטופי תנגודת לאינסולין עירוי וריד זנב
הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gannon, A. L., Chacko, S. K.,… More

Gannon, A. L., Chacko, S. K., Didelija, I. C., Marini, J. C., Blesson, C. S. Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (181), e62991, doi:10.3791/62991 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter