Summary
Denne undersøgelse beskriver den direkte måling af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel ved hjælp af en stabil isotop glukose tracer via hale vene i både faste og glukose-rige stater i tandem.
Abstract
Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig sygdom, der resulterer i lidelser i glukosemetabolismen, såsom insulinresistens og glukoseintolerance. Dysreguleret glukosemetabolisme er en vigtig manifestation af sygdommen og er nøglen til dens patogenese. Derfor er undersøgelser, der involverer evaluering af glukosemetabolisme i PCOS, af allerstørste betydning. Meget få undersøgelser har kvantificeret hepatisk glukoseproduktion direkte i PCOS-modeller ved hjælp af ikke-radioaktive glukosesporere. I denne undersøgelse diskuterer vi trinvise instruktioner til kvantificering af satsen for hepatisk glukoseproduktion i en PCOS-musemodel ved at måle M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukose tracer, via gaskromatografi - massespektrometri (GCMS). Denne procedure indebærer oprettelse af stabil isotop glukose tracer opløsning, brug af hale venekateter placering og infusion af glukose tracer i både faste og glukose-rige stater i samme mus i tandem. Berigelsen af [6,6-2H2]glukose måles ved hjælp af pentaacetatderivater i GCMS. Denne teknik kan anvendes på en lang række undersøgelser, der involverer direkte måling af hastigheden af leverglukoseproduktion.
Introduction
Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig lidelse forekommer hos 12%-20% af reproduktive alderen kvinder1,2. Det er en kompleks sygdom, der resulterer i variable fænotyper, der involverer polycystiske æggestokke, uregelmæssig menstruation og klinisk eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og er typisk diagnosticeret, når en kvinde opfylder to af de tre kriterier3. Et fremherskende aspekt af PCOS, og en nøglefaktor i sin patogenese, er metaboliske sindsforvirring, der findes hos kvinder, der har sygdommen. Kvinder med PCOS har højere forekomster af insulinresistens, glukoseintolerance, fedme og metabolisk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke kun en manifestation af sygdommen, men det menes at bidrage til sin patogenese ved at forstærke virkningen af luteiniserende hormon i æggestokken og derved føre til øget androgen produktion7,8. Insulinresistens menes at have flere mulige oprindelser, men undersøgelser tyder på, at det kan skyldes unormale mønstre af insulinreceptor signalering9,10. Undersøgelser har evalueret insulinresistens hos PCOS-patienter ved hjælp af guldstandardteknikken hyperinsulinæmisk-euglykæmisk klemme11,12,13,14,15. Kvinder med PCOS, uanset BMI, har højere niveauer af insulinresistens sammenlignet med kontrol. Insulinkontrol over glukoseproduktionen er nedsat i lidelser af insulinresistens, der fører til overskydende glukoseproduktion. For eksempel har diabetikere øget glukoneogenese og nedsat undertrykkelse af glykogenolyse16. Desuden er nedsat undertrykkelse af glukoseproduktionen blevet observeret hos diabetiske rotter17. Selvom klemmeundersøgelser kan give en måling af insulinresistens, fokuserer få undersøgelser i PCOS på direkte måling af glukoseproduktion i faste- og fodrede tilstande. Dette kræver brug af en ikke-radioaktiv isotopisk glukose tracer infusion og måling via massespektrometri.
Dyremodeller er blevet flittigt anvendt i PCOS-forskning. Både lean og fede-type PCOS murine modeller er blevet skabt ved at administrere androgener prænatally, prepubertally, eller post-puberteten18. Gnaver PCOS-modeller viser også metaboliske forskelle sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra vores laboratorium viste unormale glukosetolerancetest (GTT) i PCOS-musemodeller (lean og fede), i overensstemmelse med human PCOS-litteratur19. Brug af en slank og overvægtig dyremodel giver mulighed for yderligere undersøgelse af metaboliske forskelle. Specifikt tillader denne model evaluering af glukoseproduktionen direkte ved hjælp af isotopiske glukosesporere. En af de mest almindeligt anvendte stabile isotopiske glukose tracer er [6,6-2H2]glukose. Glukoseberigelsen [6,6-2H2] kan måles ved hjælp af et pentaacetatderivater som tidligere beskrevet20.
I denne undersøgelse var vores mål at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i faste- og glukoserig tilstand hos PCOS-mus ved hjælp af isotopisk glukoseinfusion. Disse teknikker kan anvendes på en lang række eksperimenter, der involverer glukose kinetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprocedurer blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og anvendelseskomité (IACUC) fra Baylor College of Medicine.
1. Tilberedning af [6,6-2H2]glukose
- En dag før proceduren forberedes det stabile isotop glukosesporer i normal saltvand. Til dette eksperiment blev [6,6-2H2]glukose brugt som sporstof til at måle plasmaglukoseudseendeligheden.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev glukoseproduktionen under faste- og glukoserige forhold målt, så glukoseisotopen blev fremstillet i to forskellige præparater. Opløsningerne forberedes på en sådan måde, at den endelige infunderende dosis vil være tæt på henholdsvis 1 mg/(kg·min) og 2 mg/(kg·min). Disse koncentrationer blev optimeret af flere tidligere pilotundersøgelser. - Forbered den første infundat med kun [6,6-2H2]glukose som sporstof til at repræsentere fastende tilstand ved at opløse steril og pyrogenfri [6,6-2H2]glukose i steril 0,9% natriumchloridopløsning.
- Det andet infundat opløses ved at opløse både [6,6-2H2]glukosesporeren sammen med ikke-isotopisk glukose (~20 mg/kg·min) i steril 0,9 % natriumchloridopløsning for at simulere fed tilstand.
BEMÆRK: I dette forsøg blev der anvendt en primet konstant infusion af [6,6-2H2]glukose ved (~) 1,08 mg/(kg·min) (fastende tilstand) og (~) 1,9 mg/kg(glukoserig tilstand). For at efterligne den »glukoserige tilstand« blev infusionshastigheden for D-glucose fastsat til (~) 18,8 mg/(kg·min). - Når opløsningerne er forberedt, sterilt filtreres opløsningerne med et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C. Varm opløsningerne til stuetemperatur før infusionen. Læg opløsningerne på præmærkede 1 mL sprøjter.
- Sæt pumpen op for at lette en primet konstant rate infusion af den første infundaate (for basal tilstand), der kun indeholder sporstoffet, og programmer pumpen til en konstant infusion af isotopen ved 150 μL/h i 3 timer.
- Ved afslutningen af 3 timers fasteopsætningen udskiftes den første infundatile sprøjte med den anden infundaate sprøjte, der indeholder isotop tracer og D-glucose (for simuleret fodret tilstand), og infusionen til intial 15 min ved 600 μL/h. Indstil pumpen til en konstant infusion ved 150 μL/h for de ekstra 3 timer.
2. Opsætning af infusionsforsøg
- Fjern musene fra deres hjemmebure og læg dem i deres fastebure 3 timer før eksperimentets start. Til dette eksperiment blev der anvendt en 4 måneder gammel hunmus fra C57BL/6J-stammen.
BEMÆRK: Denne procedure kræver ingen smertestillende midler før eller under proceduren på grund af dens minimalt invasive karakter. - Saml caging-udstyret ved at gruppere musene i et bestemt antal mus pr. insulinpumpe. Placer skillevægge oven på en flad, stabil base for at lave individuelle boder til musene. Det er vigtigt at have adgang til haleårekatetret for infusionen at køre, så sørg for, at der er et hak i bunden af burdøren.
BEMÆRK: Bure vist i videoen blev lavet specielt til dette eksperiment. Bure er klare og lavet af plexiglas. Der er en flad, stabil base (standard caging udstyr), hvorpå skillevæggene sidder. Denne opsætning består af flere stykker for at gøre det nemt at konfigurere i flere forskellige miljøer afhængigt af tabellens højde og eksperimentatorens behov. Døren til buret glider for at lukke og har et hak i bunden for at lade halen passe igennem. - Saml de 1 ML sprøjter, der indeholder 1 mL basal infundat, og derefter tilsluttes infusionspumpe slangen ved hjælp af polyethylen slanger 0,28 mm ID x 0,61 mm.
- Tilbered infusionspumpen ved at indstille hastigheden til 150 μL/h, som er den basale hastighed.
- Opvarm et vandbad til 48 °C.
- Forbered kateteret indsættelse station støder op til vandbad indeholder 30 G 0,5 tommer nåle, 0,3 mm ID x 0,64 mm silastic slange, og 1 tommer klar transpor tape.
- Efter 3 timers faste skal du begynde kateteret indsættelsesprocessen, som er beskrevet nedenfor.
3. Kateter indsættelse
- Vælg en mus og placere den i en sikker holder med adgang til halen. Et eksempel på, hvad man skal bruge, er en flaske skåret i halvdelen med et hak til halen. Placer holderen på en flad base. Placer et stykke tape over den proksimale del af halen for at give plads til kateter indsættelse mere distally.
BEMÆRK: Den type tape, der vælges til denne opgave, skal have moderat styrke og klæbeevne. Multifunktionelt, papirbaseret mærkningstape blev brugt i dette eksperiment, da det er mildt og let at skrælle af. - Kateteret (30 G nål fastgjort til 0,3 mm silastic slange og PE-10 blev gassteriliseret) ved at fastgøre det til en 1 mL sprøjte indeholdende steril hepariniseret saltvand flush. Skyl kateteret forsigtigt.
- Bring musen til vandbadet og indsæt halen i vandbadet i ca. 30-45 s. Dette hjælper med at spile halen vaskulatur for kateter placering.
- Udfør kateteret indsættelse under sterile forhold. Når halen er opvarmet, rengør halen med benzalkoniumservietter og læg en lille kobber, tandløs alligatorklemme, der tidligere var kontureret til halens form, som en årepresse i den proksimale ende af halen. Visualiser den laterale haleåre under et forstørrelsesglas, og sæt derefter kateteret forsigtigt ind i haleåren og træk nålen tilbage. Skyl opløsningen forsigtigt for at sikre patency af kateteret.
- Wrap et stykke 1 tommer transpor tape omkring indsættelsesstedet for at sikre kateteret. Fjern den lille årepresse fra halen.
4. Infusion set-up og første infusion
- Placer musen i sit individuelle bur og luk skydedøren, så halen stikker gennem hakket og forbliver uden for buret.
- Placer et ekstra stykke tape over hele kateteret og halen for at fastgøre det til burets bundplade. Multifunktionsfarvet etikettape blev brugt til dette trin.
- Afbryd skyllen fra haleårekatetret, og læg en lille klemme på kateterets silasticslange for at forhindre tilbagestrømning, mens den infundatiske linje forbindes fra pumpen.
- Når den er forsvarligt tilsluttet, skal du fjerne klemmen og flugte med primingopløsningen, som består af infunderes. Sørg for, at opløsningen er klar i slangen og ikke blodplettet.
- Bemærk tidspunktet for infusionens indledning for at sikre, at den kører i den samlede tid på ca. 3 timer. Hvis der anvendes flere bure samtidigt, skal de vakles for at styre infusionstider effektivt.
- Når infusionslinjer er noteret for at fungere korrekt, skal dækslet fjernes fra musen. Placer standard sengetøj omkring musen.
- Start infusionen med den første infundatil, der indeholder sporstoffet, og kør den i 3 timer kontinuerligt. I infusionsperioden fortsætter du med at kontrollere musenes trivsel samt infusionslinjer. Sørg for, at infusionsslangen er korrekt fastgjort, og at der ikke er lækager fra linjetilslutningspunkterne.
5. Blodprøvetagning
- Når den første infusion er afsluttet, skal du stoppe infusionen, placere en klemme på sylasticslangen på kateteret for at forhindre tilbagestrømning. Fjern forsigtigt musene fra deres kabinetter uden at forstyrre kateteret for at samle blod. Placer dem på et sted i nærheden af burene til blodprøve. Til dette eksperiment gennemgik musene kind venipuncture ved hjælp af en 4 mm lancet.
- Saml ~75 μL blod i det ønskede hætteglas. For at deproteinisere prøver som forberedelse til massespektrometri tilsættes ca. 15 μL blod til 500 μL acetone. Det resterende blod kan bruges til at kontrollere blodsukkerniveauet via glucometeret og/eller centrifugeret til at adskille plasma til fremtidige hormonanalyser.
6. Anden infusion
- Fjern infusates fra sprøjtepumperne ved at frakoble slangen fra sprøjterne og udskift den med den anden infundasat, der indeholder sporstoffet sammen med glukose. Gentag trin 4.2 til 4.7 ved hjælp af den glukoserige isotopiske glukoseinfusion.
- For at nå en stabil tilstand skal du køre en bolus af den anden infundatur ved 600 μL/h i 15 min. Bemærk starttidspunktet for hver gruppe bure. Reducer infusionshastigheden til 150 μL/h for at fuldføre den samlede infusionstid på 3 timer.
- Gentag trin 5.1 og 5.2.
- Stop infusionspumpen og fjern haleårekatetret forsigtigt, tryk forsigtigt på kateteret, indtil blødningen stopper, og returner mus til deres hjemmebure.
- Santize og desinficere caging setup grundigt med standard sæbe og vand.
BEMÆRK: Dette er en overlevelsesprocedure. Mus kan returneres til bure og opbevares til yderligere oplevelser, hvis det er nødvendigt. Det anbefales, at der ikke foretages yderligere erfaringer i mindst en uge efter denne procedure for at sikre tilstrækkelig dyrevelfærd.
7. Massespektrometri
- Send prøverne ud for massespektrometri.
- Analyser
- Mål isotopberigelsen af [6,6-2H2]glukose ved hjælp af gaskromatografi - massespektrometri (GCMS) ved hjælp af pentaacetatderivater21,22. Kort sagt indebærer denne metode fremstilling af pentaacetatderivat af glukose, efterfulgt af prøveanalyse ved hjælp af GCMS 20,22.
- Beregninger
- Udfør alle kinetiske målinger under stabile tilstandsforhold. Den samlede plasmaglukoseudseendelse (glukose Ra) blev beregnet ud fra M+2-berigelsen af [6,6-2H2]glukose i plasma ved hjælp af etablerede isotopfortyndingsligninger21. Under stabile tilstandsforhold antages det, at glukosehastigheden er lig med glukosehastigheden. Hyppigheden af endogene glukoseproduktion (mg/(kg·min)) (GPR) = glucoseRa - eksogen glukose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af tidligere beskrevne isotopfortyndingsligninger blev den samlede plasmaglukoserate (glucoseRa) beregnet ud fra M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose under faste- og glukoserige forhold ved hjælp af pentaacetatderivater21. Under steady-state betingelser antages det, at glukosehastigheden er lig med glukosehastigheden. I kontrolgruppen var den samlede glukoseregne 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 timers faste og 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) under glukoserige forhold. Ved hjælp af ovennævnte beregning var GPR 19,08 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 timers faste og 8,56 ± 1,40 mg/(kg·min)) i glukoserige forhold (tabel 1 og figur 1).
Figur 1: Glukoseproduktionshastighed i faste- og glukoserige forhold Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fastende | Glukose-rige | |
| (gennemsnit ± SD) | (gennemsnit ± SD) | |
| Glukose Ra, mg/(kg.min) | 19.98 ± 2.53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR, mg/ (kg.min) | 19.08 ± 2.53 | 8.56 ± 1.40 |
| Ra, hyppigheden af glukose udseende; GPR, glukoseproduktionshastighed | ||
Tabel 1: Ra og GPR i faste- og glukoserige forhold
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperglykæmi og unormal glukose metabolisme / homøostase er funktioner i PCOS. Blodsukkerniveauet opretholdes ved en kombination af glukose fra kost- og glukoseproduktion via glykogenolyse og glukoneogenese og glykogene under kontrol af hormon og enzymer. Leverglukoseproduktion undertrykkes af tilstedeværelsen af øgede cirkulerende glukoseniveauer. I lidelser af unormal glukose metabolisme, regulering af undertrykkelsen af glukoseproduktionen er kompromitteret fører til hyperglykæmi. Mens mange undersøgelser har vist indirekte målinger af leverglukoseproduktion i en PCOS-dyremodel, har få målt hepatisk glukoseproduktion direkte. I denne undersøgelse beskriver vi en enkel måde at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i flere mus på samme tid. Denne teknik kan anvendes på mange undersøgelser, der involverer glukosemetabolisme i forskellige musemodeller. Desuden kan denne teknik tjene som grundlag for yderligere målinger kan anvendes, såsom måling af glukoneogenese og glykogenolyse20,23.
De kritiske komponenter i dette eksperiment er kateterets indsættelse og definition af de nøjagtige målinger af [6,6-2H2]glukose og naturlig glukose, når der skabes infusionsløsninger for at kunne udføre GCMS på passende vis. Den anvendte kateterindføringsteknik er beskrevet af Marini et al. 200624. Selv om der er invasive metoder til administration af infusioner og prøveudtagning via halspulsåren og halsvene katetre25,26,27, indsættelse af en minimalt invasiv hale venekateter opnår de samme mål i en mindre invasiv og mindre tidskrævende måde. Selv om to katetre kan placeres i hver hale vene, en til infusion og en til prøveudtagning, vi brugte et kateter til infusion og derefter udført prøveudtagning via kind venipuncture da der kun var to tidspunkter for prøveudtagning. Men hvis en undersøgelse omfattede flere tidspunkter for prøveudtagning, indsættelse af en anden hale venekateter kan bidrage til at lette dette28.
Nøjagtige målinger er afgørende for beregninger, der involverer massespektrometri for at sikre nøjagtige resultater. Vi brugte glukose tracer til at måle udseendet af glukose er [6,6-2H2]glucose21. Selv om andre ikke-radioaktive sporstoffer har været ansat i andre undersøgelser, dette en stabil isotop, der er almindeligt anvendt i vores lab20. Stabile glukosesporere foretrækkes frem for radioaktive glukosesporere på grund af den forbedrede sikkerhedsprofil, naturlig tilstedeværelse, mangel på halveringstid, der påvirker studietiden, og evnen til at kombinere forskellige sporstoffer29. Valget af tracer er op til skøn og ekspertise af de forskere, der udfører undersøgelsen.
Der er nogle begrænsninger i denne undersøgelse, herunder den tekniske efterspørgsel efter proceduren. Men sammenlignet med mere invasive teknikker til kateterisering (dvs. catherization af halspulsåren og ekstern halspulsåre), denne teknik er ligetil, effektiv og mindre sygelig. Hvis der anvendes to hale venekatetre, har der været rapporter om fejlagtige berigelsesværdier fra infusionen, der forstyrrer prøveudtagningskatet24. Men i de fleste undersøgelser er behovet for flere prøver ikke berettiget, fordi steady-state er kendt. Endelig, selv om massespektrometri giver præcise målinger, det kræver yderligere færdigheder, ekspertise og omkostninger.
I denne undersøgelse beskriver vi en enkel og præcis måde at måle hastigheden af den samlede hepatiske glukoseproduktion i en PCOS-musemodel. Denne teknik bør tjene som grundlag for flere undersøgelser, der involverer glukosemetabolisme af musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af uddannelsesstipendier fra Institut for Obstetrik og Gynækologi, Baylor College of Medicine (ALG) og R-01 forskningstilskud (Tilskud # DK114689) til CSB, SC og JM fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
References
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).
