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Medicine

एक पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम माउस मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन का मूल्यांकन

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62991
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Reproductive Endocrinology and Infertility, Baylor College of Medicine, 2Family Fertility Center, Texas Children’s Hospital, 3Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 4Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Summary

यह अध्ययन एक पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम माउस मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन के प्रत्यक्ष माप का वर्णन करता है, जो उपवास और ग्लूकोज-समृद्ध दोनों राज्यों में पूंछ शिरा के माध्यम से एक स्थिर आइसोटोपिक ग्लूकोज ट्रेसर का उपयोग करके अग्रानुक्रम में है।

Abstract

पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओएस) एक आम बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप ग्लूकोज चयापचय के विकार होते हैं, जैसे कि इंसुलिन प्रतिरोध और ग्लूकोज असहिष्णुता। Dysregulated ग्लूकोज चयापचय रोग की एक महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति है और इसके रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, पीसीओएस में ग्लूकोज चयापचय के मूल्यांकन से जुड़े अध्ययन अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं। बहुत कम अध्ययनों ने गैर-रेडियोधर्मी ग्लूकोज अनुरेखकों का उपयोग करके सीधे पीसीओएस मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन की मात्रा निर्धारित की है। इस अध्ययन में, हम गैस क्रोमैटोग्राफी - मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसीएमएस) के माध्यम से [6,6-2H2] ग्लूकोज, एक स्थिर आइसोटोपिक ग्लूकोज ट्रेसर के एम + 2 संवर्धन को मापकर एक पीसीओएस माउस मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन की दर के परिमाणीकरण के लिए चरण-दर-चरण निर्देशों पर चर्चा करते हैं। इस प्रक्रिया में स्थिर आइसोटोपिक ग्लूकोज अनुरेखक समाधान का निर्माण, पूंछ शिरा कैथेटर प्लेसमेंट का उपयोग और एक ही माउस में उपवास और ग्लूकोज-समृद्ध दोनों राज्यों में ग्लूकोज ट्रेसर का जलसेक शामिल है। [6,6-2H2] ग्लूकोज के संवर्धन को जीसीएमएस में पेंटासिटेट व्युत्पन्न का उपयोग करके मापा जाता है। इस तकनीक को यकृत ग्लूकोज उत्पादन की दर के प्रत्यक्ष माप से जुड़े विभिन्न प्रकार के अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओएस) एक सामान्य विकार है जो 12% -20% प्रजनन आयु वर्ग की महिलाओं में होता है। यह एक जटिल बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप पॉलीसिस्टिक अंडाशय, अनियमित मासिक धर्म और हाइपरएंड्रोजेनेमिया के नैदानिक या प्रयोगशाला साक्ष्य शामिल चर फेनोटाइप होते हैं, और आमतौर पर निदान किया जाता है जब एक महिला तीन मानदंडों में से दो को पूरा करती है3। पीसीओएस का एक प्रमुख पहलू, और इसके रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक, चयापचय derangements है जो उन महिलाओं में पाए जाते हैं जिन्हें बीमारी है। पीसीओएस वाली महिलाओं में इंसुलिन प्रतिरोध, ग्लूकोज असहिष्णुता, मोटापा और चयापचय सिंड्रोम 3,4,5,6 की उच्च घटनाएं होती हैं। इंसुलिन प्रतिरोध न केवल बीमारी की अभिव्यक्ति है, बल्कि यह अंडाशय में ल्यूटिनाइज़िंग हार्मोन की कार्रवाई को potentiating द्वारा इसके रोगजनन में योगदान करने के लिए सोचा जाता है जिससे एण्ड्रोजन उत्पादन में वृद्धि होती है7,8। इंसुलिन प्रतिरोध को कई संभावित मूल माना जाता है, लेकिन अध्ययनों से पता चलता है कि यह इंसुलिन रिसेप्टर सिग्नलिंग 9,10 के असामान्य पैटर्न के कारण हो सकता है। अध्ययनों ने पीसीओएस रोगियों में इंसुलिन प्रतिरोध का मूल्यांकन किया है जो हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप 11,12,13,14,15 की सोने की मानक तकनीक का उपयोग कर रहा है। पीसीओएस वाली महिलाएं, बीएमआई के बावजूद, नियंत्रण की तुलना में इंसुलिन प्रतिरोध के उच्च स्तर में होती हैं। ग्लूकोज उत्पादन पर इंसुलिन नियंत्रण इंसुलिन प्रतिरोध के विकारों में बिगड़ा हुआ है जिससे अतिरिक्त ग्लूकोज उत्पादन होता है। उदाहरण के लिए, मधुमेह रोगियों में ग्लूकोनोजेनेसिस की दर में वृद्धि हुई है और ग्लाइकोजेनोलिसिस 16 का बिगड़ा हुआ दमन है। इसके अलावा, मधुमेह चूहों 17 में ग्लूकोज उत्पादन का बिगड़ा हुआ दमन देखा गया है। हालांकि क्लैंप अध्ययन इंसुलिन प्रतिरोध का माप दे सकते हैं, पीसीओएस में कुछ अध्ययन उपवास और खिलाए गए राज्यों में ग्लूकोज उत्पादन के प्रत्यक्ष माप पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से एक गैर-रेडियोधर्मी आइसोटोपिक ग्लूकोज ट्रेसर जलसेक और माप के उपयोग की आवश्यकता होती है।

पशु मॉडल को बड़े पैमाने पर पीसीओएस अनुसंधान में उपयोग किया गया है। दुबला और मोटापे से ग्रस्त दोनों प्रकार के पीसीओएस मुरीन मॉडल को एण्ड्रोजन को प्रसवपूर्व, प्रीप्युबर्टल, या पोस्ट-यौवन 18 के प्रशासन द्वारा बनाया गया है। कृंतक पीसीओएस मॉडल भी अपने संबंधित नियंत्रणों की तुलना में चयापचय अंतर प्रदर्शित करते हैं। हमारी प्रयोगशाला के पिछले डेटा ने पीसीओएस माउस मॉडल (दुबला और मोटापे से ग्रस्त) में असामान्य ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (जीटीटी) का प्रदर्शन किया, जो मानव पीसीओएस साहित्य 19 के अनुरूप था। एक दुबला और मोटापे से ग्रस्त पशु मॉडल का उपयोग चयापचय मतभेदों में आगे की जांच की अनुमति देता है। विशेष रूप से, यह मॉडल आइसोटोपिक ग्लूकोज ट्रेसर्स का उपयोग करके सीधे ग्लूकोज उत्पादन की दर के मूल्यांकन की अनुमति देता है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले स्थिर आइसोटोपिक ग्लूकोज ट्रेसर में से एक [6,6-2H2] ग्लूकोज है। [6,6-2H2] ग्लूकोज संवर्धन को एक पेंटासिटेट व्युत्पन्न का उपयोग करके मापा जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित किया गया था20।

इस अध्ययन में, हमारा उद्देश्य आइसोटोपिक ग्लूकोज जलसेक का उपयोग करके पीसीओएस चूहों में उपवास और ग्लूकोज-समृद्ध राज्य में यकृत ग्लूकोज उत्पादन की दर को मापना था। इन तकनीकों को ग्लूकोज कैनेटीक्स से जुड़े प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को Baylor College of Medicine की Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. [6,6-2H2] ग्लूकोज की तैयारी

  1. प्रक्रिया से एक दिन पहले, सामान्य खारा में स्थिर आइसोटोप ग्लूकोज अनुरेखक तैयार करें। इस प्रयोग के लिए, [6,6-2H2] ग्लूकोज का उपयोग प्लाज्मा ग्लूकोज उपस्थिति दर को मापने के लिए एक अनुरेखक के रूप में किया गया था।
    नोट: इस प्रयोग में, उपवास और ग्लूकोज युक्त स्थितियों के दौरान ग्लूकोज उत्पादन को मापा गया था, इसलिए ग्लूकोज आइसोटोप को दो अलग-अलग तैयारियों में तैयार किया गया था। समाधानों को इस तरह से तैयार करें कि अंतिम infusing खुराक क्रमशः 1 मिलीग्राम / (kg · min) और 2 मिलीग्राम / (kg · min) के करीब होगी। इन सांद्रता को कई पूर्व पायलट अध्ययनों द्वारा अनुकूलित किया गया था।
  2. बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में बाँझ और पाइरोजेन मुक्त [6,6-2H2] ग्लूकोज को भंग करके उपवास की स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक अनुरेखक के रूप में केवल [6,6-2H2] ग्लूकोज के साथ पहला इनफ्यूसेट तैयार करें।
  3. दोनों [6,6-2H2] ग्लूकोज अनुरेखक के साथ-साथ गैर-आइसोटोपिक ग्लूकोज (~ 20 मिलीग्राम / किग्रा · मिनट) को बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में भंग करके दूसरा इनफ्यूसेट तैयार करें ताकि खिलाया गया स्थिति का अनुकरण किया जा सके।
    नोट: वर्तमान प्रयोग में, (~) 1.08 मिलीग्राम / (kg ·min) (उपवास की स्थिति) और (~) 1.9 मिलीग्राम / किग्रा · मिनट (ग्लूकोज समृद्ध स्थिति) पर [6,6-2H2] ग्लूकोज की एक प्राइमेड स्थिर दर जलसेक का उपयोग किया गया था। 'ग्लूकोज समृद्ध स्थिति' की नकल करने के लिए, डी-ग्लूकोज जलसेक दर (~) 18.8 मिलीग्राम / (kg · min) पर सेट की गई थी।
  4. एक बार समाधान तैयार होने के बाद, बाँझ 0.22 μm फ़िल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर करें और 4 °C पर स्टोर करें। जलसेक से पहले कमरे के तापमान के लिए समाधान गर्म करें। पूर्व लेबल 1 mL सिरिंज पर समाधान लोड करें।
  5. पंप को स्थापित करने के लिए पहले infusate (बेसल स्थिति के लिए) के एक primed स्थिर दर जलसेक की सुविधा के लिए केवल अनुरेखक युक्त, और 3 ज के लिए 150 μL / h पर आइसोटोप की एक स्थिर दर जलसेक के लिए पंप कार्यक्रम.
  6. 3 ज उपवास सेट अप के अंत में, आइसोटोपिक अनुरेखक और डी-ग्लूकोज (नकली खिलाया राज्य के लिए) युक्त दूसरे infusate सिरिंज के साथ पहले infusate सिरिंज की जगह, और 600 μL / h पर intial 15 मिनट के लिए जलसेक प्राइम। अतिरिक्त 3 ज के लिए 150 μL / h पर एक स्थिर दर जलसेक के लिए पंप सेट करें।

2. जलसेक प्रयोगों के सेट-अप

  1. अपने घर के पिंजरों से चूहों को हटा दें और प्रयोग की शुरुआत से 3 घंटे पहले उन्हें अपने उपवास पिंजरों में रखें। इस प्रयोग के लिए, C57BL / 6J तनाव से एक 4 महीने की मादा चूहों का उपयोग किया गया था।
    नोट: इस प्रक्रिया से पहले या प्रक्रिया के दौरान किसी भी एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है इसकी न्यूनतम इनवेसिव प्रकृति को देखते हुए।
  2. चूहों को इंसुलिन पंप प्रति चूहों की एक निर्धारित संख्या में समूहीकृत करके कैजिंग उपकरण ों को इकट्ठा करें। चूहों के लिए अलग-अलग स्टाल बनाने के लिए एक फ्लैट, स्थिर आधार के शीर्ष पर विभाजन रखें। जलसेक को चलाने के लिए पूंछ शिरा कैथेटर तक पहुंच होना महत्वपूर्ण है, इसलिए सुनिश्चित करें कि पिंजरे के दरवाजे के नीचे एक पायदान है।
    नोट: वीडियो में दिखाए गए पिंजरों को विशेष रूप से इस प्रयोग के लिए बनाया गया था। पिंजरे स्पष्ट हैं और plexiglass से बने हैं। एक फ्लैट, स्थिर आधार (मानक कैजिंग उपकरण) है जिस पर विभाजन बैठते हैं। इस सेटअप में टेबल की ऊंचाई और प्रयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर कई अलग-अलग वातावरणों में सेटअप की आसानी की अनुमति देने के लिए कई टुकड़े होते हैं। पिंजरे का दरवाजा बंद करने के लिए स्लाइड करता है और पूंछ के माध्यम से फिट होने की अनुमति देने के लिए नीचे एक पायदान है।
  3. बेसल infusate के 1 mL युक्त 1 mL सिरिंज इकट्ठा, और फिर 0.28 मिमी आईडी x 0.61 मिमी polyethylene टयूबिंग का उपयोग कर जलसेक पंप टयूबिंग से कनेक्ट।
  4. 150 μL / h, जो बेसल दर है करने के लिए दर सेट करके जलसेक पंप तैयार करें।
  5. 48 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान को गर्म करें।
  6. कैथेटर सम्मिलन स्टेशन 30 जी 0.5 इंच सुइयों, 0.3 मिमी आईडी x 0.64 मिमी silastic टयूबिंग, और 1 इंच स्पष्ट transpore टेप युक्त पानी स्नान से सटे स्टेशन तैयार करें।
  7. उपवास के 3 घंटे के बाद, कैथेटर सम्मिलन प्रक्रिया शुरू करें, जो नीचे विस्तृत है।

3. कैथेटर सम्मिलन

  1. एक माउस का चयन करें और इसे पूंछ तक पहुंच के साथ एक सुरक्षित धारक में रखें। क्या उपयोग करने का एक उदाहरण पूंछ के लिए एक पायदान के साथ आधे में कटौती की गई बोतल है। धारक को एक फ्लैट बेस पर रखें। कैथेटर सम्मिलन के लिए अंतरिक्ष को अधिक दूरस्थ रूप से अनुमति देने के लिए पूंछ के समीपस्थ भाग पर एक टुकड़ा टेप रखें।
    नोट:: इस कार्य के लिए चुने गए टेप के प्रकार में मध्यम शक्ति और चिपकने की क्षमता होनी चाहिए। बहुउद्देशीय, कागज-आधारित लेबलिंग टेप का उपयोग इस प्रयोग में किया गया था क्योंकि यह हल्का और छीलने में आसान है।
  2. कैथेटर तैयार करें (30 जी सुई 0.3 मिमी सिलास्टिक ट्यूबिंग से जुड़ी हुई है और पीई- 10 गैस निष्फल थे) इसे बाँझ हेपरिनाइज्ड खारा फ्लश युक्त 1 एमएल सिरिंज से जोड़कर तैयार करें। कैथेटर को धीरे से फ्लश करें।
  3. माउस को पानी के स्नान में लाएं और लगभग 30-45 सेकंड के लिए पानी के स्नान में पूंछ डालें। यह कैथेटर प्लेसमेंट के लिए पूंछ वास्कुलचर को फैलाने में मदद करता है।
  4. बाँझ परिस्थितियों में कैथेटर सम्मिलन निष्पादित करें। एक बार पूंछ को गर्म करने के बाद, बेंजाल्कोनियम वाइप्स के साथ पूंछ को साफ करें और एक छोटा तांबा, दंतहीन मगरमच्छ क्लैंप रखें, जिसे पहले पूंछ के आकार के लिए समोच्च किया गया था, पूंछ के समीपस्थ छोर पर एक टूर्निकेट के रूप में। एक आवर्धक ग्लास के नीचे पार्श्व पूंछ शिरा की कल्पना करें, और फिर सावधानीसे पूंछ की नस में कैथेटर डालें और सुई को वापस ले लें। कैथेटर की पैटेन्सी सुनिश्चित करने के लिए समाधान को धीरे से फ्लश करें।
  5. कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए सम्मिलन साइट के चारों ओर 1 इंच ट्रांसपोर टेप का एक टुकड़ा लपेटें। पूंछ से छोटे tourniquet निकालें.

4. जलसेक सेट-अप और पहले जलसेक

  1. माउस को अपने व्यक्तिगत पिंजरे में रखें और स्लाइडिंग दरवाजे को बंद करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूंछ पायदान के माध्यम से उभरी हुई है और पिंजरे के बाहर बनी हुई है।
  2. पूरे कैथेटर और पूंछ पर टेप का एक अतिरिक्त टुकड़ा रखें ताकि इसे पिंजरे की बेस प्लेट में सुरक्षित किया जा सके। बहुउद्देशीय रंगीन, लेबल टेप इस चरण के लिए उपयोग किया गया था।
  3. पूंछ शिरा कैथेटर से फ्लश डिस्कनेक्ट करें और पंप से इन्फुसेट लाइन को जोड़ते समय बैकफ्लो को रोकने के लिए कैथेटर के सिलिस्टिक टयूबिंग पर एक छोटा सा क्लैंप रखें।
  4. एक बार सुरक्षित रूप से जुड़े होने के बाद, क्लैंप को हटा दें और प्राइमिंग समाधान के साथ फ्लश करें, जिसमें इंफ्यूजेट होता है। सुनिश्चित करें कि समाधान टयूबिंग में स्पष्ट है और रक्त-सना हुआ नहीं है।
  5. जलसेक की दीक्षा के समय को ध्यान में रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह लगभग 3 घंटे के कुल समय के लिए चलता है। यदि कई पिंजरों का एक साथ उपयोग किया जाता है, तो उन्हें जलसेक समय को प्रभावी ढंग से प्रबंधित करने के लिए अलग किया जाना चाहिए।
  6. एक बार जलसेक लाइनों को ठीक से काम करने के लिए नोट किया जाता है, तो माउस से कवर को हटा दें। माउस के चारों ओर मानक बिस्तर रखें।
  7. ट्रेसर युक्त पहले infusate के साथ जलसेक शुरू करें और इसे लगातार 3 ज के लिए चलाने के लिए। जलसेक की अवधि के लिए, चूहों की भलाई के साथ-साथ जलसेक लाइनों की जांच करना जारी रखें। सुनिश्चित करें कि जलसेक टयूबिंग ठीक से सुरक्षित है और यह कि लाइन कनेक्शन बिंदुओं से कोई रिसाव नहीं है।

5. रक्त का नमूना

  1. पहले जलसेक के पूरा होने के बाद, जलसेक को रोकें, वापस प्रवाह को रोकने के लिए कैथेटर पर सिलिस्टिक ट्यूबिंग पर एक क्लैंप रखें। रक्त एकत्र करने के लिए कैथेटर को परेशान किए बिना चूहों को धीरे से उनके बाड़ों से हटा दें। उन्हें रक्त खींचने के लिए पिंजरों के पास एक स्थान पर रखें। इस प्रयोग के लिए, चूहों ने 4 मिमी लैंसेट का उपयोग करके गाल वेनिपंक्चर किया।
  2. वांछित शीशी में रक्त के ~ 75 μL इकट्ठा. मास स्पेक्ट्रोमेट्री की तैयारी में नमूनों को डिप्रोटीनाइज़ करने के लिए, एसीटोन के 500 μL में लगभग 15 μL रक्त जोड़ें। शेष रक्त का उपयोग ग्लूकोमीटर के माध्यम से रक्त शर्करा के स्तर की जांच करने के लिए किया जा सकता है और / या भविष्य के हार्मोन एसेस के लिए प्लाज्मा को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है।

6. दूसरा जलसेक

  1. सिरिंज से टयूबिंग को डिस्कनेक्ट करके सिरिंज पंपों से इनफ्यूजेट को हटा दें और ग्लूकोज के साथ ट्रेसर युक्त दूसरे इन्फुसेट के साथ इसे बदलें। ग्लूकोज-समृद्ध आइसोटोपिक ग्लूकोज जलसेक का उपयोग करके चरण 4.2 से 4.7 तक दोहराएं।
    1. एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने के लिए, 15 मिनट के लिए 600 μL / h पर दूसरे infusate का एक बोलस चलाएं। पिंजरों के प्रत्येक समूह के लिए शुरुआती समय नोट करें। कुल जलसेक समय के 3 ज को पूरा करने के लिए जलसेक दर को 150 μL / h तक कम करें।
  2. चरण 5.1 और 5.2 को दोहराएँ।
  3. जलसेक पंप को रोकें और पूंछ नस कैथेटर को धीरे से हटा दें, रक्तस्राव बंद होने तक कैथेटर साइटों पर दबाव लागू करें, और चूहों को अपने घर के पिंजरों में वापस कर दें।
  4. मानक साबुन और पानी के साथ अच्छी तरह से कैजिंग सेटअप को व्यवस्थित और कीटाणुरहित करें।
    नोट: यह एक उत्तरजीविता प्रक्रिया है। चूहों को पिंजरों में वापस किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो आगे के अनुभवों के लिए रखा जा सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि पर्याप्त पशु कल्याण सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया के बाद कम से कम एक सप्ताह के लिए कोई और अनुभव नहीं किया जाता है।

7. मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूने भेजें।
  2. विश्लेषण
    1. गैसक्रोमैटोग्राफी द्वारा [6,6-2H2] ग्लूकोज के आइसोटोपिक संवर्धन को मापें - द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसीएमएस) पेंटासीटेट व्युत्पन्न 21,22 का उपयोग करके। संक्षेप में, इस विधि में ग्लूकोज के पेंटासीटेट व्युत्पन्न की तैयारी शामिल है, इसके बाद जीसीएमएस 20,22 का उपयोग करके नमूना विश्लेषण किया जाता है।
  3. गणना
    1. स्थिर स्थिति परिस्थितियों के तहत सभी गतिज मापन करें। कुल प्लाज्मा ग्लूकोज उपस्थिति दर (ग्लूकोज आरए) की गणना स्थापित आइसोटोप कमजोर पड़ने के समीकरणों 21 का उपयोग करके प्लाज्मा में [6,6-2H2] ग्लूकोज के एम + 2 संवर्धन से की गई थी। स्थिर स्थिति की स्थिति के तहत, यह माना जाता है कि ग्लूकोज की उपस्थिति की दर ग्लूकोज के गायब होने की दर के बराबर है। अंतर्जात ग्लूकोज उत्पादन की दर (mg/(kg·min)) (GPR) = glucoseRa - बहिर्जात ग्लूकोज।

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Representative Results

पहले वर्णित आइसोटोप कमजोर पड़ने के समीकरणों का उपयोग करते हुए, कुल प्लाज्मा ग्लूकोज दर (ग्लूकोजआरए) की गणना पेंटाएसीटेट डेरिवेटिव 21 का उपयोग करके उपवास और ग्लूकोज-समृद्ध स्थितियों में [6,6-2H2] ग्लूकोज के एम + 2 संवर्धन से की गई थी। स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत, यह माना जाता है कि ग्लूकोज की उपस्थिति की दर ग्लूकोज के गायब होने की दर के बराबर है। नियंत्रण समूह में, कुल ग्लूकोजआरए 19.98 ± 6 घंटे उपवास के बाद 2.53 मिलीग्राम / (किग्रा · मिनट) और ग्लूकोज युक्त स्थितियों के दौरान 1.76 मिलीग्राम / (किग्रा · मिनट) ± 25.80 था। ऊपर सूचीबद्ध गणना का उपयोग करते हुए, GPR 19.08 ± 2.53 mg/(kg·min) 6 घंटे के उपवास के बाद और ग्लूकोज समृद्ध स्थितियों (तालिका 1 और चित्रा 1) में 8.56 ± 1.40 mg/(kg·min)) था।

Figure 1
चित्रा 1: उपवास और ग्लूकोज-समृद्ध स्थितियों में ग्लूकोज उत्पादन दर कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उपवास ग्लूकोज युक्त
(एसडी ± मतलब) (एसडी ± मतलब)
ग्लूकोज रा, मिलीग्राम / (kg.min) 19.98 ± 2.53 25.80 ± 1.76
GPR, mg/ (kg.min) 19.08 ± 2.53 8.56 ± 1.40
आरए, ग्लूकोज उपस्थिति की दर; GPR, ग्लूकोज उत्पादन दर

तालिका 1: उपवास और ग्लूकोज युक्त स्थितियों में रा और जीपीआर

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Discussion

हाइपरग्लाइसेमिया और असामान्य ग्लूकोज चयापचय / होमियोस्टैसिस पीसीओएस की विशेषताएं हैं। रक्त शर्करा का स्तर हार्मोन और एंजाइमों के नियंत्रण में ग्लाइकोजेनोलिसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस और ग्लाइकोजेनेसिस के माध्यम से आहार और ग्लूकोज उत्पादन से ग्लूकोज के संयोजन द्वारा बनाए रखा जाता है। यकृत ग्लूकोज उत्पादन में वृद्धि हुई परिसंचारी ग्लूकोज के स्तर की उपस्थिति से दबा दिया जाता है। असामान्य ग्लूकोज चयापचय के विकारों में, ग्लूकोज उत्पादन के दमन के विनियमन से समझौता किया जाता है जिससे हाइपरग्लाइसेमिया होता है। जबकि कई अध्ययनों ने पीसीओएस पशु मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन के अप्रत्यक्ष माप का प्रदर्शन किया है, कुछ ने सीधे यकृत ग्लूकोज उत्पादन को मापा है। इस अध्ययन में हम एक ही समय में कई चूहों में यकृत ग्लूकोज उत्पादन की दर को मापने के लिए एक सीधा तरीका बताते हैं। इस तकनीक को विभिन्न माउस मॉडल में ग्लूकोज चयापचय से जुड़े कई अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह तकनीक उस नींव के रूप में काम कर सकती है जिस पर अतिरिक्त माप लागू किए जा सकते हैं, जैसे कि ग्लूकोनोजेनेसिस और ग्लाइकोजेनोलिसिस 20,23 का माप।

इस प्रयोग के महत्वपूर्ण घटक कैथेटर सम्मिलन हैं और [6,6-2H2] ग्लूकोज और प्राकृतिक ग्लूकोज के सटीक माप को परिभाषित करते हैं जब पर्याप्त रूप से जीसीएमएस करने के लिए जलसेक समाधान बनाते हैं। कैथेटर सम्मिलन तकनीक का उपयोग Marini et al. 200624 द्वारा किया गया है। यद्यपि कैरोटिड धमनी और जुगुलर शिरा कैथेटर 25,26,27 के माध्यम से जलसेक और नमूने के प्रशासन के आक्रामक तरीके हैं, एक न्यूनतम इनवेसिव पूंछ शिरा कैथेटर का सम्मिलन एक कम आक्रामक और कम समय-गहन फैशन में एक ही लक्ष्य को पूरा करता है। यद्यपि प्रत्येक पूंछ की नस में दो कैथेटर रखे जा सकते हैं, एक इंफ्यूजिंग के लिए और एक नमूना लेने के लिए, हमने जलसेक के लिए एक कैथेटर का उपयोग किया और फिर गाल वेनिपंक्चर के माध्यम से नमूना करण किया क्योंकि नमूने के लिए केवल दो समय बिंदु थे। हालांकि, यदि एक अध्ययन में नमूने के लिए कई समय बिंदु शामिल हैं, तो दूसरी पूंछ शिरा कैथेटर का सम्मिलन इस 28 को सुविधाजनक बनाने में मदद कर सकता है।

सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री से जुड़ी गणनाओं के लिए सटीक माप महत्वपूर्ण हैं। हमने ग्लूकोज की उपस्थिति को मापने के लिए ग्लूकोज ट्रेसर का उपयोग किया [6,6-2H2] ग्लूकोज 21 है। हालांकि अन्य गैर-रेडियोधर्मी अनुरेखकों को अन्य अध्ययनों में नियोजित किया गया है, यह एक स्थिर आइसोटोप है जो आमतौर पर हमारे प्रयोगशाला 20 में उपयोग किया जाता है। स्थिर ग्लूकोज अनुरेखकों को बेहतर सुरक्षा प्रोफ़ाइल, प्राकृतिक उपस्थिति, अध्ययन के समय को प्रभावित करने वाले आधे जीवन की कमी और विभिन्न ट्रेसर्स को संयोजित करने की क्षमता के कारण रेडियोधर्मी ग्लूकोज ट्रेसर्स पर पसंद किया जाता है29। अनुरेखक का विकल्प अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के विवेक और विशेषज्ञता पर निर्भर करता है।

इस अध्ययन की कुछ सीमाएं हैं, जिनमें प्रक्रिया की तकनीकी मांग भी शामिल है। हालांकि, कैथीटेराइजेशन के लिए अधिक आक्रामक तकनीकों की तुलना में (यानी, कैरोटिड धमनी और बाहरी जुगुलर नस का कैथेराइजेशन), यह तकनीक सीधी, कुशल और कम रुग्ण है। यदि दो पूंछ शिरा कैथेटर का उपयोग कर रहे हैं, तो नमूना कैथेटर 24 के साथ हस्तक्षेप करने वाले जलसेक से गलत संवर्धन मूल्यों की रिपोर्टें आई हैं। हालांकि, अधिकांश अध्ययनों में कई नमूनों की आवश्यकता को वारंट नहीं किया जाता है क्योंकि स्थिर-राज्य ज्ञात है। अंत में, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री सटीक माप देता है, इसके लिए अतिरिक्त कौशल, विशेषज्ञता और लागत की आवश्यकता होती है।

इस अध्ययन में, हम पीसीओएस माउस मॉडल में कुल यकृत ग्लूकोज उत्पादन की दर को मापने के लिए एक सीधा, सटीक तरीका बताते हैं। इस तकनीक को माउस मॉडल के ग्लूकोज चयापचय से जुड़े कई अध्ययनों के लिए नींव के रूप में काम करना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को प्रसूति और स्त्री रोग विभाग, Baylor College of Medicine (ALG) और R-01 अनुसंधान अनुदान (अनुदान # DK114689) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से CSB, SC और JM के लिए प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride solution McKesson 275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe VWR 75846-756 Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape 3M 70200400169
1-inch Labeling tape Fisher GS07F161BA Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush McKesson 191-MIH-2235 One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets Fisher Scientific NC9891620 5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone Sigma-Aldrich 650501
Advanced hot plate stirrer VWR 97042-602 Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles Health Warehouse A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles Medvet 305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm VWR 63019-004
Beaker, 1000 mL Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap Fisher Scientific 05-719-120 For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet Amazon Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5% Sigma-Aldrich G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD VWR 62999-042
Magnifying glass Amazon Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance Ohaus Adventurer Pro AV264C Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL Sigma-Aldrich B0158-12EA Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump Harvard Apparatus 70-3024A
Plexiglass sheet Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers Any brand; used to cage mice during infusion

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References

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चिकित्सा मुद्दा 181 यकृत ग्लूकोज उत्पादन पीसीओएस आइसोटोपिक ग्लूकोज जलसेक इंसुलिन प्रतिरोध पूंछ शिरा जलसेक
एक पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम माउस मॉडल में यकृत ग्लूकोज उत्पादन का मूल्यांकन
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Gannon, A. L., Chacko, S. K.,… More

Gannon, A. L., Chacko, S. K., Didelija, I. C., Marini, J. C., Blesson, C. S. Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (181), e62991, doi:10.3791/62991 (2022).

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