Summary
Bu çalışma, polikistik over sendromu fare modelinde hepatik glikoz üretiminin hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda kuyruk damarı yoluyla stabil bir izotopik glikoz izleyici kullanılarak doğrudan ölçülen ölçümünü açıklar.
Abstract
Polikistik over sendromu (PKOS), insülin direnci ve glikoz intoleransı gibi glikoz metabolizması bozuklukları ile sonuçlanan yaygın bir hastalıktır. Düzensiz glikoz metabolizması hastalığın önemli bir tezahürüdür ve patogenezinin anahtarıdır. Bu nedenle PKOS'ta glikoz metabolizmasının değerlendirilmesini içeren çalışmalar son derece önemlidir. Çok az çalışma radyoaktif olmayan glikoz izleyiciler kullanarak doğrudan PKOS modellerinde hepatik glikoz üretimini ölçtü. Bu çalışmada, gaz kromatografisi - kütle spektrometresi (GCMS) aracılığıyla kararlı bir izotopik glikoz izleyicisi olan M+2 zenginleştirmesini ölçerek bir PKOS fare modelinde hepatik glikoz üretim oranının ölçülmesi için adım adım talimatları tartışıyoruz. Bu prosedür, stabil izotopik glukoz izleyici çözeltisinin oluşturulmasını, kuyruk damar kateteri yerleşiminin kullanılmasını ve aynı farede hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda glikoz izleyicinin infüzyonunu içerir. [6,6-2H2]glikozun zenginleştirilmesi GCMS'de pentaasetat türevi kullanılarak ölçülür. Bu teknik, hepatik glikoz üretim oranının doğrudan ölçülünü içeren çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Introduction
Polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınların %12-20'sinde görülen yaygın bir hastalıktır1,2. Polikistik overler, düzensiz mensesler ve hiperandrogenemi klinik veya laboratuvar kanıtlarını içeren değişken fenotiplerle sonuçlanan karmaşık bir hastalıktır ve tipik olarak bir kadın üç kriterden ikisini karşıladığında teşhis edilir3. PKOS'un baskın bir yönü ve patogenezinde önemli bir faktör, hastalığı olan kadınlarda bulunan metabolik dengesizliklerdir. PKOS'li kadınlarda insülin direnci, glikoz intoleransı, obezite ve metabolik sendrom görülme sıklığı daha yüksektir3,4,5,6. İnsülin direnci sadece hastalığın bir tezahürü değildir, aynı zamanda yumurtalıktaki luteinize edici hormonun etkisini etkileyerek patogenezine katkıda bulunduğu ve böylece androjen üretiminin artmasına yol açtığı düşünülmektedir7,8. İnsülin direncinin birkaç olası kökene sahip olduğu düşünülmektedir, ancak çalışmalar bunun anormal insülin reseptör sinyalleri örüntülerinden kaynaklanabileceğini göstermektedir9,10. Çalışmalar, hiperinsülinemik-ögllikemik kelepçenin altın standart tekniğini kullanarak PKOS hastalarında insülin direncini değerlendirmiş11,12,13,14,15. VKİ'den bağımsız olarak PKOS'lu kadınlar, kontrollere kıyasla daha yüksek insülin direnci seviyelerine sahiptir. Aşırı glikoz üretimine yol açan insülin direnci bozukluklarında glikoz üretimi üzerinde insülin kontrolü bozulur. Örneğin, diyabetik hastalarda glukogenez oranları artmış ve glikojenoliz baskılanması bozulmuş16. Ayrıca diyabetik sıçanlarda glikoz üretiminin baskılanmasında bozulma gözlenmiştir17. Kelepçe çalışmaları insülin direnci ölçümü verebilse de, PKOS'ta çok az çalışma oruç ve beslenen durumlarda glikoz üretiminin doğrudan ölçümüne odaklanmaktadır. Bu, radyoaktif olmayan izotopik glukoz izleyici infüzyonu ve kütle spektrometresi yoluyla ölçüm kullanılmasını gerektirir.
Hayvan modelleri PKOS araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hem yağsız hem de obez tipi PKOS murine modelleri androjenlerin prenatal, prepubertal veya post-ergenlik döneminden sonra uygulanmasıyla oluşturulmuştur18. Kemirgen PKOS modelleri de ilgili kontrollerine kıyasla metabolik farklılıklar gösterir. Laboratuvarımızdan elde edilen önceki veriler, PCOS fare modellerinde (yalın ve obez) insan PKOS literatürü ile uyumlu anormal glikoz tolerans testleri (GTT) göstermiştir19. Yalın ve obez bir hayvan modelinin kullanılması metabolik farklılıkların daha fazla araştırılmasını sağlar. Özellikle, bu model doğrudan izotopik glikoz izleyicileri kullanılarak glikoz üretim oranının değerlendirilmesine izin verir. En sık kullanılan stabil izotopik glukoz izleyicilerinden biri [6,6-2H2]glikozdur. [6,6-2H2]glikoz zenginleştirme, daha önce açıklandığı gibi bir pentaasetat türevi kullanılarak ölçülebilir20.
Bu çalışmada amacımız izotopik glikoz infüzyonu kullanarak PKOS farelerinde oruç ve glikoz bakımından zengin durumda hepatik glikoz üretim oranını ölçmekti. Bu teknikler glikoz kinetiği içeren çok çeşitli deneylere uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. [6,6-2H2] glikozun hazırlanması
- İşlemden bir gün önce, normal salin içinde kararlı izotop glukoz izleyicisini hazırlayın. Bu deney için plazma glukoz görünüm oranını ölçmek için izleyici olarak [6,6-2H2]glikoz kullanılmıştır.
NOT: Bu deneyde, oruç sırasında glikoz üretimi ve glikoz bakımından zengin koşullar ölçüldü, bu nedenle glikoz izotop iki farklı preparat halinde hazırlandı. Çözeltileri, son infüzyon dozu sırasıyla 1 mg/(kg·dk) ve 2 mg/(kg·dk)'a yakın olacak şekilde hazırlayın. Bu konsantrasyonlar daha önceki birkaç pilot çalışma ile optimize edilmiştir. - Steril ve pirojen içermeyen [6,6-2H2]glikoz'u steril %0,9 sodyum klorür çözeltisinde eriterek oruç durumunu temsil etmek için ilk infüzyonu sadece [6,6-2H2]glikoz ile hazırlayın.
- Fed durumunu simüle etmek için steril % 0,9 sodyum klorür çözeltisinde izotopik olmayan glikoz (~20 mg/kg·dk) ile birlikte [6,6-2H2]glikoz izleyicisini çözerek ikinci infüzeyi hazırlayın.
NOT: Mevcut deneyde, (~) 1.08 mg/(kg·dk) (açlık durumu) ve (~) 1.9 mg/kg·dk (glikoz bakımından zengin durum) seviyesinde [6,6-2H2]glikoz astarlı sabit oran infüzyonu kullanılmıştır. 'Glikoz bakımından zengin durumu' taklit etmek için D-glikoz infüzyon oranı (~) 18,8 mg/(kg·dk) olarak belirlendi. - Çözeltiler hazırlandıktan sonra, çözeltileri 0,22 μm filtre ile steril filtreleyin ve 4 °C'de saklayın. Çözeltileri infüzyondan önce oda sıcaklığına ısıtın. Çözeltileri önceden etiketlenmiş 1 mL şırınna yükleyin.
- Pompayı, yalnızca izleyiciyi içeren ilk infüzyonun (bazal durum için) astarlı sabit oran infüzyonunu kolaylaştırmak için ayarlayın ve pompayı 3 saat boyunca 150 μL / s'de izotopun sabit bir oran infüzyonu için programlayın.
- 3 saat oruç kurulumunun sonunda, ilk infüzyon şırıngını izotopik izleyici ve D-glikoz içeren ikinci infüzyon şırıngıyla değiştirin (simüle edilmiş fed durumu için) ve infüzyonu 600 μL / s'de 15 dakika boyunca astar edin. Pompayı ek 3 saat için 150 μL/s sabit bir hız infüzyona ayarlayın.
2. infüzyon deneylerinin kurulumu
- Fareleri ev kafeslerinden çıkarın ve deney başlamadan 3 saat önce oruç kafeslerine yerleştirin. Bu deney için, C57BL / 6J suşundan 4 aylık bir dişi fare kullanıldı.
NOT: Bu prosedür, minimal invaziv yapısı göz önüne alındığında işlemden önce veya işlem sırasında herhangi bir analjezi gerektirmez. - Fareleri insülin pompası başına belirli sayıda fareye gruplandırarak kafes ekipmanını monte edin. Fareler için bireysel tezgahlar yapmak için bölümleri düz, kararlı bir tabanın üzerine yerleştirin. infüzyonun çalışması için kuyruk damar kateterine erişime sahip olmak önemlidir, bu nedenle kafes kapısının dibinde bir çentik olduğundan emin olun.
NOT: Videoda gösterilen kafesler bu deney için özel olarak yapılmıştır. Kafesler berraktır ve pleksiglastan yapılmıştır. Bölümlerin üzerine oturduğu düz, kararlı bir taban (standart kafes ekipmanı) vardır. Bu kurulum, tablonun yüksekliğine ve deneycinin gereksinimlerine bağlı olarak birkaç farklı ortamda kurulum kolaylığı sağlamak için birkaç parçadan oluşur. Kafesin kapısı kapanmak için kayar ve kuyruğun sığmasını sağlamak için altta bir çentik vardır. - 1 mL bazal infüzyon içeren 1 mL şırınnaları monte edin ve ardından 0,28 mm ID x 0,61 mm polietilen boruyu kullanarak infüzyon pompası tüpüne bağlayın.
- Oranı bazal hız olan 150 μL/sa'ye ayarlayarak infüzyon pompasını hazırlayın.
- Bir su banyosuzları 48 °C'ye ısıtın.
- 30 G 0,5 inç iğneler, 0,3 mm kimlik x 0,64 mm silastic boru ve 1 inç şeffaf transpore bant içeren su banyosuna bitişik kateter yerleştirme istasyonunu hazırlayın.
- 3 saat oruç tuttuktan sonra, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan kateter takma işlemine başlayın.
3. Kateter takılması
- Bir fare seçin ve kuyruğa erişimi olan güvenli bir tutucuya yerleştirin. Ne kullanılacağına bir örnek, kuyruk için bir çentikle ikiye kesilmiş bir şişedir. Tutucuyu düz bir tabana yerleştirin. Kateter takılması için daha fazla boşluk sağlamak için kuyruğun proksimal kısmının üzerine bir parça bant yerleştirin.
NOT: Bu görev için seçilen bant türü orta mukavemete ve yapışkanlığa sahip olmalıdır. Bu deneyde çok amaçlı, kağıt bazlı etiketleme bandı hafif ve soyulması kolay olduğu için kullanılmıştır. - Kateteri (0,3 mm silastic boruya bağlı 30 G iğne ve PE- 10 gaz sterilize edildi) steril heparinize salin yıkama içeren 1 mL şırıngaya takarak hazırlayın. Kateteri nazikçe yıkayın.
- Fareyi su banyosuna getirin ve kuyruğu yaklaşık 30-45 sn su banyosuna yerleştirin. Bu, kateter yerleşimi için kuyruk vaskülatını genişletmeye yardımcı olur.
- Kateter yerleştirme işlemini steril koşullarda gerçekleştirin. Kuyruk ısındıktan sonra kuyruğu benzalkonyum mendillerle temizleyin ve kuyruğun proksimal ucunda turnike olarak daha önce kuyruğun şekline konturlanmış küçük bir bakır, dişsiz timsah kelepçesi yerleştirin. Yanal kuyruk damarını büyüteç altında görselleştirin ve ardından kateteri dikkatlice kuyruk damarına yerleştirin ve iğneyi geri çekin. Kateterin açıklığını sağlamak için çözeltiyi hafifçe yıkayın.
- Kateteri sabitlemek için ekleme bölgesinin etrafına 1 inç transpore bant parçası sarın. Küçük turnikeyi kuyruktan çıkarın.
4. İnfüzyon kurulumu ve ilk infüzyon
- Fareyi tek tek kafesine yerleştirin ve kayan kapıyı kapatın, kuyruğun çentikten çıkıntılı olduğundan ve kafesin dışında kaldığından emin olun.
- Kafesin taban plakasına sabitlemek için tüm kateter ve kuyruğun üzerine ek bir bant yerleştirin. Bu adım için çok amaçlı renkli, etiket bandı kullanılmıştır.
- Floşun kuyruk damarı kateterinden çıkarın ve demlenme hattını pompadan bağlarken geri akışı önlemek için kateterin siltik tüpüne küçük bir kelepçe yerleştirin.
- Güvenli bir şekilde bağlandıktan sonra, kelepçeyi çıkarın ve infüzyondan oluşan astar çözeltisi ile yıkayın. Çözeltinin tüpte açık olduğundan ve kan lekeli olmadığından emin olun.
- Toplam yaklaşık 3 saat boyunca çalıştığından emin olmak için infüzyonun başlama zamanını not edin. Aynı anda birden fazla kafes kullanılıyorsa, infüzyon sürelerini etkili bir şekilde yönetmek için kademelendirilmelidir.
- infüzyon çizgilerinin düzgün çalıştığından, kapağı fareden çıkarın. Farenin etrafına standart yatak takımları yerleştirin.
- İnfüzyonu izleyiciyi içeren ilk infüzyonla başlatın ve sürekli olarak 3 saat çalıştırın. infüzyon süresince, infüzyon hatlarının yanı sıra farelerin refahını kontrol etmeye devam edin. infüzyon borusundan düzgün bir şekilde emin olun ve hat bağlantı noktalarından sızıntı olmamasını sağlayın.
5. Kan örneklemesi
- İlk infüzyon tamamlandıktan sonra, infüzyonu durdurun, geri akışı önlemek için kateter üzerindeki sylaztik boruya bir kelepçe yerleştirin. Kan toplamak için kateteri bozmadan fareleri muhafazalarından yavaşça çıkarın. Kan almak için kafeslerin yakınındaki bir yere yerleştirin. Bu deney için, fareler 4 mm'lik bir mızrak kullanarak yanak venipunkture geçirdiler.
- İstenilen şişede ~ 75 μL kan toplayın. Kütle spektrometresine hazırlık için örnekleri deproteinize etmek için, 500 μL asetona yaklaşık 15 μL kan ekleyin. Kalan kan, kan şekeri seviyesini glukometre ile kontrol etmek için kullanılabilir ve/veya gelecekteki hormon tahlilleri için plazmayı ayırmak için santrifüjlenebilir.
6. İkinci infüzyon
- Boruyu şırındlardan ayırarak infüzyonları şırındıcı pompalarından çıkarın ve glikozla birlikte izleyiciyi içeren ikinci infüzyonla değiştirin. Glikoz bakımından zengin izotopik glukoz infüzyonunu kullanarak 4.2 ile 4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Sabit bir duruma ulaşmak için, 15 dakika boyunca 600 μL / s'de ikinci infüzyonun bir bolus'ını çalıştırın. Her kafes grubunun başlangıç saatine dikkat edin. Toplam infüzyon süresinin 3 saatini tamamlamak için infüzyon oranını 150 μL/s'ye düşürin.
- 5.1 ve 5.2 adımlarını yineleyin.
- infüzyon pompasını durdurun ve kuyruk damar kateterini nazikçe çıkarın, kanama durana kadar kateter bölgelerine basınç uygulayın ve fareleri ev kafeslerine geri verin.
- Kafes kurulumunu standart sabun ve suyla iyice santize edin ve dezenfekte edin.
NOT: Bu bir hayatta kalma prosedürüdür. Fareler kafeslere geri döndürülebilir ve gerekirse daha fazla deneyim için tutulabilir. Yeterli hayvan refahını sağlamak için bu prosedürü takip eden en az bir hafta boyunca daha fazla deneyimlenme yapılmaması önerilir.
7. Kütle spektrometresi
- Kütle spektrometresi için örnekleri gönderin.
- Analiz
- Pentaasetat türevini kullanarak [6,6-2H2]glikozun gaskromatografi - kütle spektrometresi (GCMS) ile izotopik zenginleştirmesini ölçün21,22. Kısaca, bu yöntem glikozun pentaasetat türevinin hazırlanmasını ve ardından GCMS 20,22 kullanılarak örnek analizi içerir.
- Hesaplama
- Tüm kinetik ölçümleri sabit durum koşullarında gerçekleştirin. Toplam plazma glukoz görünüm oranı (glikoz Ra), kurulan izotop seyreltme denklemleri kullanılarak plazmadaki [6,6-2H2]glikozun M+2 zenginleştirilmesinden hesaplanmıştır21. Sabit durum koşullarında, glikozun ortaya çıkma oranının glikozun kaybolma hızına eşit olduğu varsayılıyor. Endojen glikoz üretim oranı (mg/(kg·dk)) (GPR) = glikozRa - eksojen glikoz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce tanımlanmış izotop seyreltme denklemleri kullanılarak, toplam plazma glikoz oranı (glikozRa), pentaasetat türevi kullanılarak oruç ve glikoz bakımından zengin koşullarda [6,6-2H2]glikozun M+2 zenginleştirilmesinden hesaplanmıştır21. Sabit durum koşullarında, glikozun ortaya çıkma oranının glikozun kaybolma hızına eşit olduğu varsayılıyor. Kontrol grubunda glikoz bakımından zengin koşullarda 6 saat oruç sonrası toplam glikozRa 19.98 ± 2.53 mg/(kg·dk) ve 25.80 ± 1.76 mg/(kg·dk) idi. Yukarıda sıralanan hesaplamayı kullanarak Glukoz bakımından zengin koşullarda GPR 6 saat oruç tuttuktan sonra 19,08 ± 2,53 mg/(kg·dk) ve 8,56 ± 1,40 mg/(kg·dk)) idi (Tablo 1 ve Şekil 1).
Şekil 1: Oruç ve glikoz bakımından zengin koşullarda glikoz üretim oranı Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Oruç | Glikoz bakımından zengin | |
| (ortalama ± SD) | (ortalama ± SD) | |
| Glikoz Ra, mg/(kg.dk) | 19,98 ± 2,53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR, mg/ (kg.dk) | 19,08 ± 2,53 | 8,56 ± 1,40 |
| Ra, glikoz görünüm oranı; GPR, glikoz üretim oranı | ||
Tablo 1: Oruç ve glikoz bakımından zengin koşullarda Ra ve GPR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hiperglisemi ve anormal glikoz metabolizması/homeostaz PKOS'un özellikleridir. Kan şekeri seviyesi, hormon ve enzimlerin kontrolü altında glikogenoliz ve glukogenez ve glikogenez yoluyla diyet ve glikoz üretiminden elde edilen glikozun bir kombinasyonu ile korunur. Hepatik glikoz üretimi, dolaşımdaki glikoz seviyelerinin artmasıyla bastırılır. Anormal glikoz metabolizması bozukluklarında, glikoz üretiminin baskılanması düzenlemesi hiperglisemiye yol açan tehlikeye girer. Birçok çalışma bir PKOS hayvan modelinde hepatik glikoz üretiminin dolaylı ölçümlerini ortaya koymuş olsa da, çok azı doğrudan hepatik glikoz üretimini ölçtürdü. Bu çalışmada, aynı anda birden fazla farede hepatik glikoz üretim oranını ölçmenin basit bir yolunu açıklıyoruz. Bu teknik çeşitli fare modellerinde glikoz metabolizmasını içeren birçok çalışmaya uygulanabilir. Ayrıca, bu teknik glukogenez ve glikojenoliz ölçümü20,23 gibi ek ölçümlerin uygulanabileceği temel görevi görebilirsiniz.
Bu deneyin kritik bileşenleri kateter takılması ve GCMS'yi yeterince gerçekleştirmek için infüzyon çözeltileri oluştururken [6,6-2H2] glikoz ve doğal glikozun tam ölçümlerini tanımlamadır. Kullanılan kateter takma tekniği Marini ve ark. 200624 tarafından açıklanmıştır. Karotis arter ve juguler ven kateterleri25,26,27 ile infüzyon ve örneklemenin invaziv yöntemleri olmasına rağmen, minimal invaziv bir kuyruk damar kateterinin yerleştirilmesi aynı hedefleri daha az invaziv ve daha az zaman yoğun bir şekilde gerçekleştirir. Her kuyruk damarı içine biri infüzyon, diğeri örnekleme için olmak üzere iki kateter yerleştirilse de, infüzyon için bir kateter kullandık ve daha sonra örnekleme için sadece iki zaman noktası olduğu için yanak venipnforisi ile örnekleme yaptık. Bununla birlikte, bir çalışma örnekleme için birden fazla zaman noktası içeriyorsa, ikinci bir kuyruk damar kateteri takılması bunu kolaylaştırmaya yardımcı olabilir28.
Kesin ölçümler, doğru sonuçlar elde etmek için kütle spektrometresi içeren hesaplamalar için çok önemlidir. Glikozun görünümünü ölçmek için glikoz izleyicisini kullandık [6,6-2H2]glikoz21. Diğer çalışmalarda radyoaktif olmayan diğer izleyiciler kullanılmış olsa da, bu laboratuvarımızda yaygın olarak kullanılan kararlı bir izotop20. Gelişmiş güvenlik profili, doğal varlık, çalışma süresini etkileyen yarı ömür eksikliği ve farklı izleyicileri birleştirme yeteneği nedeniyle radyoaktif glikoz izleyiciler yerine kararlı glikoz izleyiciler tercih edilir29. İzleyici seçimi, çalışmayı gerçekleştiren araştırmacıların takdirine ve uzmanlığına bağlıdır.
Prosedürün teknik talebi de dahil olmak üzere bu çalışmanın bazı sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, kateterizasyon için daha invaziv tekniklerle (yani karotid arter ve dış şah damarının katerizasyonu) karşılaştırıldığında, bu teknik basit, verimli ve daha az morbiddir. İki kuyruk damarı kateteri kullanıyorsanız, örnekleme kateterine müdahale eden infüzyondan hatalı zenginleştirme değerleri rapor edilmiştir24. Bununla birlikte, çoğu çalışmada, sabit durum bilindiğinden birden fazla numuneye ihtiyaç garanti değildir. Son olarak, kütle spektrometresi hassas ölçümler verse de, ek beceriler, uzmanlık ve maliyet gerektirir.
Bu çalışmada, bir PCOS fare modelinde toplam hepatik glikoz üretim oranını ölçmenin basit ve doğru bir yolunu açıklıyoruz. Bu teknik, fare modellerinin glikoz metabolizmasını içeren birden fazla çalışmanın temeli olarak hizmet etmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Baylor Tıp Fakültesi (ALG) Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ve Ulusal Sağlık Enstitülerinden CSB, SC ve JM için R-01 araştırma hibesi (Grant # DK114689) tarafından eğitim hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
References
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).
