Summary
Denna studie beskriver direkt mätning av lever glukos produktion i en polycystiskt äggstock syndrom mus modell genom att använda en stabil isotopisk glukos tracer via svans ven i både fasta och glukos-rika stater i tandem.
Abstract
Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som resulterar i störningar i glukosmetabolismen, såsom insulinresistens och glukosintolerans. Dysreglerad glukosmetabolism är en viktig manifestation av sjukdomen och är nyckeln till dess patogenes. Därför är studier som involverar utvärdering av glukosmetabolism i PCOS av yttersta vikt. Mycket få studier har kvantifierat lever glukosproduktion direkt i PCOS-modeller med icke-radioaktiva glukosspårare. I denna studie diskuterar vi steg-för-steg instruktioner för kvantifiering av graden av lever glukos produktion i en PCOS musmodell genom att mäta M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos, en stabil isotopisk glukos tracer, via gas kromatografi - masspektrometri (GCMS). Denna procedur innebär skapandet av stabil isotopisk glukosspårare lösning, användning av svansveter kateter placering och infusion av glukosspåraren i både fasta och glukosrika tillstånd i samma mus i tandem. Berikningen av [6,6-2H2]glukos mäts med pentaacetatderivat i GCMS. Denna teknik kan tillämpas på en mängd olika studier som involverar direkt mätning av graden av lever glukosproduktion.
Introduction
Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som förekommer hos 12-20% av reproduktiva kvinnor1,2. det är en komplex sjukdom som resulterar i varierande fenotyper som omfattar polycystiska äggstockar, oregelbundna menstruationer och kliniska eller laboratorium bevis på hyperandrogenemia, och diagnostiseras vanligtvis när en kvinna uppfyller två av de tre kriterierna3. En dominerande aspekt av PCOS, och en nyckelfaktor i dess patogenes, är metaboliska derangements som finns hos kvinnor som har sjukdomen. Kvinnor med PCOS har högre förekomster av insulinresistens, glukosintolerans, fetma och metaboliskt syndrom3,4,5,6. Insulinresistens är inte bara en manifestation av sjukdomen, men det tros bidra till dess patogenes genom att förstärka verkan av luteiniserande hormon i äggstocken och därmed leda till ökad androgenproduktion7,8. Insulinresistens tros ha flera möjliga ursprung men studier tyder på att det kan bero på onormala mönster av insulinreceptorsignalering9,10. Studier har utvärderat insulinresistens hos PCOS-patienter med hjälp av guldstandardtekniken hyperinsulinisk-euglykemisk klämma11,12,13,14,15. Kvinnor med PCOS, oavsett BMI, har högre nivåer av insulinresistens jämfört med kontroller. Insulinkontrollen över glukosproduktionen är nedsatt vid störningar i insulinresistens som leder till överdriven glukosproduktion. Till exempel har diabetiker patienter ökad frekvens av glukoneogenes och nedsatt undertryckande av glykogenolys16. Dessutom har nedsatt undertryckande av glukosproduktionen observerats hos diabetiker råttor17. Även om klämstudier kan ge en mätning av insulinresistens, fokuserar få studier i PCOS på direkt mätning av glukosproduktion i fasta och matade tillstånd. Detta kräver användning av en icke-radioaktiv isotopisk glukosspårare infusion och mätning via masspektrometri.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning i PCOS-forskning. Både mager och överviktig PCOS murine modeller har skapats genom att administrera androgener prenatally, prepubertally, eller post-pubertally18. Gnagare PCOS-modeller visar också metaboliska skillnader jämfört med deras respektive kontroller. Tidigare data från vårt labb visat onormal glukos tolerans tester (GTT) i PCOS mus modeller (mager och överviktig), överensstämmer med mänskliga PCOS litteratur19. Användning av en mager och överviktig djurmodell möjliggör ytterligare undersökning av metaboliska skillnader. Specifikt tillåter denna modell utvärdering av glukosproduktionens hastighet direkt med isotopiska glukosspårare. En av de vanligaste stabila isotopiska glukosspåraren är [6,6-2H2]glukos. [6,6-2H2]glukosberikning kan mätas med hjälp av ett pentaacetatderivat som tidigare beskrivits20.
I denna studie var vårt mål att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i fasta och glukos-rikt tillstånd i PCOS möss med hjälp av isotopisk glukos infusion. Dessa tekniker kan tillämpas på ett brett spektrum av experiment som involverar glukoskinetik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine.
1. Beredning av [6,6-2H2]glukos
- En dag före proceduren, förbered den stabila isotop glukosspåraren i normal saltlösning. För detta experiment användes [6,6-2H2]glukos som en spårämne för att mäta plasma glukos utseende.
OBS: I detta experiment mättes glukosproduktion under fasta och glukosrika förhållanden, så glukosisotopen förbereddes i två olika preparat. Förbered lösningarna på ett sådant sätt att den slutliga infunderingsdosen blir nära 1 mg/(kg·min) respektive 2 mg/(kg·min). Dessa koncentrationer optimerades av flera tidigare pilotstudier. - Förbered det första infusatet med endast [6,6-2H2]glukos som spårämne för att representera fastetillståndet genom att lösa steril och pyrogenfri [6,6-2H2]glukos i steril 0,9% natriumkloridlösning.
- Förbered den andra infusate genom att lösa upp både [6,6-2H2]glukosspårämne tillsammans med icke-isotopisk glukos (~ 20 mg/kg·min) i steril 0,9% natriumkloridlösning för att simulera det matade tillståndet.
OBS: I detta experiment användes en primed konstant hastighet infusion av [6,6-2H2]glukos vid (~) 1,08 mg/(kg·min) (fastande tillstånd) och (~) 1,9 mg/kg·min (glukosrikt tillstånd). För att efterlikna det "glukosrika tillståndet" fastställdes D-glukosinfusionshastigheten till (~) 18,8 mg/(kg·min). - När lösningarna är förberedda filtrerar du lösningarna med ett 0,22 μm-filter och förvarar vid 4 °C. Värm lösningarna till rumstemperatur före infusionen. Ladda lösningarna på förmärkta 1 ml-sprutor.
- Ställ in pumpen för att underlätta en primed konstant hastighet infusion av det första infusatet (för basalt tillstånd) som endast innehåller spårämnet, och programmera pumpen för en konstant hastighet infusion av isotopen vid 150 μL/h för 3 h.
- Byt ut den första infusatsprutan i slutet av 3 timmars fastesättning med den andra infusatsprutan som innehåller isotopspårämnet och D-glukos (för simulerat matat tillstånd) och prima infusionen för intial 15 min vid 600 μL/h. Ställ in pumpen på en infusion med konstant hastighet vid 150 μL/h för ytterligare 3 timmar.
2. Inställda infusionsexperiment
- Ta bort mössen från deras hemburar och placera dem i deras fasta burar 3 h innan experimentet börjar. För detta experiment användes en 4 månader gammal honmöss från C57BL/6J stam.
OBS: Denna procedur kräver inte något smärtstillande medel före eller under proceduren med tanke på dess minimalt invasiva natur. - Montera hylsutrustningen genom att gruppera mössen i ett visst antal möss per insulinpump. Placera skiljeväggar ovanpå en platt, stabil bas för att göra enskilda bås för mössen. Det är viktigt att ha tillgång till svansvetertetern för att infusionen ska kunna köras, så se till att det finns ett hack i botten av burdörren.
OBS: Burar som visas i videon gjordes specifikt för detta experiment. Burar är tydliga och gjorda av plexiglas. Det finns en platt, stabil bas (standard caging utrustning) på vilken skiljeväggarna sitter. Den här inställningen består av flera delar för att underlätta installationen i flera olika miljöer beroende på tabellens höjd och experimenterarens behov. Dörren till buret glider för att stänga och har ett hack i botten för att låta svansen passa igenom. - Montera 1 ml-sprutorna som innehåller 1 ml basalinfusat och anslut sedan till infusionspumpslangen med hjälp av polyetenslangen 0,28 mm ID x 0,61 mm.
- Förbered infusionspumpen genom att ställa in hastigheten på 150 μL/h, vilket är basalhastigheten.
- Värm ett vattenbad till 48 °C.
- Förbered kateterinsättningsstationen intill vattenbadet som innehåller 30 G 0,5 tums nålar, 0,3 mm ID x 0,64 mm silastisk slang och 1 tum klar transporetejp.
- Efter 3 timmars fasta, börja kateterns införingsprocess, som beskrivs nedan.
3. Kateter införing
- Välj en mus och placera den i en säker hållare med tillgång till svansen. Ett exempel på vad man ska använda är en flaska halverad med ett hack för svansen. Placera hållaren på en platt botten. Placera en bittejp över den proximala delen av svansen så att utrymmet för kateter införs mer distally.
OBS: Den typ av tejp som valts för denna uppgift måste ha måttlig styrka och vidhäftning. Mångsidig, pappersbaserad märkningstejp användes i detta experiment eftersom det är milt och lätt att skala av. - Förbered katetern (30 G nål fäst vid 0,3 mm silastisk slang och PE- 10 gas steriliserades) genom att fästa den på en 1 ml spruta som innehåller steril hepariniserad saltlösning spolning. Spola katetern försiktigt.
- Ta musen till vattenbadet och sätt in svansen i vattenbadet i ca 30-45 s. Detta hjälper till att vidga svansvaskulaturen för kateterplacering.
- Utför kateterinsättningen under sterila förhållanden. När svansen är uppvärmd, rengör svansen med bensalkoniumservetter och placera en liten koppar, tandlös alligatorklämma, som tidigare konturerades till svansens form, som en stass i svansens proximala ände. Visualisera den laterala svansvenen under ett förstoringsglas och sätt sedan försiktigt in katetern i svansvenen och dra ut nålen. Spola lösningen försiktigt för att säkerställa kateterns patency.
- Linda en bit av 1 tums transpore tejp runt införingsstället för att säkra katetern. Ta bort den lilla stassen från svansen.
4. Infusionsuppsättning och första infusionen
- Placera musen i sin individuella bur och stäng skjutdörren, se till att svansen sticker ut genom skåran och förblir utanför buret.
- Placera ytterligare en tejpbit över hela katetern och svansen för att fästa den på burets bottenplatta. Mångsidig färgad etiketttejp användes för det här steget.
- Koppla bort spolningen från svansvetetern och placera en liten klämma på kateterns silastiska slangar för att förhindra återflöde samtidigt som infusatledningen ansluts från pumpen.
- När klämman är ordentligt ansluten, ta bort klämman och spola med priminglösningen, som består av infusatet. Se till att lösningen är klar i slangen och inte blodfläckad.
- Notera tidpunkten för initiering av infusionen för att säkerställa att den löper under den totala tiden på cirka 3 timmar. Om flera burar används samtidigt bör de spridas för att hantera infusionstider effektivt.
- När infusionslinjerna har noterats fungera korrekt, ta bort locket från musen. Placera standardsängkläder runt musen.
- Starta infusionen med det första infusatet som innehåller spåraren och kör den i 3 timmar kontinuerligt. Under infusionen, fortsätt att kontrollera mössens välbefinnande såväl som infusionslinjer. Se till att infusionsslangen är ordentligt fastsatt och att det inte finns några läckor från linjeanslutningspunkterna.
5. Blodprov
- När den första infusionen är klar, stoppa infusionen, placera en klämma på den sylastiska slangen på katetern för att förhindra ryggflöde. Ta försiktigt bort mössen från deras höljen utan att störa katetern för att samla blod. Placera dem på en plats nära burarna för bloddragning. För detta experiment genomgick mössen kind venipuncture med en 4 mm lansett.
- Samla ~75 μL blod i önskad injektionsflaska. För att avproteinisera prover som förberedelse för masspektrometri, tillsätt cirka 15 μL blod till 500 μL aceton. Det återstående blodet kan användas för att kontrollera blodsockernivån via glucometern och/eller centrifugeras för att separera plasma för framtida hormonanalyser.
6. Andra infusionen
- Ta bort infundaterna från sprutpumparna genom att koppla bort slangen från sprutorna och byt ut den mot det andra infusatet som innehåller spåraren tillsammans med glukosen. Upprepa steg 4,2 till 4,7 med den glukosrika isotopiska glukosinfusionen.
- För att nå ett stabilt tillstånd, kör en bolus av den andra infusate vid 600 μL/h i 15 min. Notera starttiden för varje grupp av burar. Minska infusionshastigheten till 150 μL/h för att slutföra den totala infusionstiden på 3 timmar.
- Upprepa steg 5.1 och 5.2.
- Stoppa infusionspumpen och ta försiktigt bort svansvetertetern, tryck på kateterplatserna tills blödningen upphör och återför möss till sina hemburar.
- Sätt fast och desinficera höljet noggrant med standardtvål och vatten.
OBS: Detta är en överlevnadsprocedur. Möss kan återföras till burar och hållas för ytterligare erfarenheter om det behövs. Det rekommenderas att ingen ytterligare erfarenhet utförs under minst en vecka efter detta förfarande för att säkerställa adekvat djurvälfärd.
7. Masspektrometri
- Skicka ut proverna för masspektrometri.
- Analyser
- Mät isotopberikningen av [6,6-2H2]glukos med gaskromatografi - masspektrometri (GCMS) med hjälp av pentaacetatderivatet21,22. Kortfattat innebär denna metod beredning av pentaacetatderivatet av glukos, följt av provanalys med GCMS 20,22.
- Beräkningar
- Utför alla kinetiska mätningar under steady state-förhållanden. Den totala plasmaglukosens utseendehastighet (glukos Ra) beräknades utifrån M+2-anrikningen av [6,6-2H2]glukos i plasma med hjälp av etablerade isotoputspädningsekvationer21. Under stabila förhållanden antas det att glukosens utseende är lika med graden av försvinnande av glukos. Frekvens av endogen glukosproduktion (mg/(kg·min)) (GPR) = glukosRa - exogen glukos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av tidigare beskrivna isotop utspädningsekvationer beräknades den totala plasma glukoshastigheten (glukosRa) från M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos i fasta och glukos-rika villkor med hjälp av pentaacetate derivat21. Under steady-state förhållanden antas det att glukosens utseende är lika med graden av försvinnande av glukos. I kontrollgruppen var den totala glukosRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 h fasta och 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) under glukosrika förhållanden. Enligt beräkningen ovan var GPR 19,08 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 h fasta och 8,56 ± 1,40 mg/(kg·min)) under glukosrika förhållanden (tabell 1 och figur 1).
Bild 1: Glukosproduktionshastighet i fasta och glukosrika förhållanden Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fasta | Glukosrik | |
| (medelvärde ± SD) | (medelvärde ± SD) | |
| Glukos Ra, mg/(kg.min) | 19.98 ± 2.53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR, mg/ (kg.min) | 19.08 ± 2.53 | 8.56 ± 1.40 |
| Ra, glukosutseende; GPR, glukosproduktionshastighet | ||
Tabell 1: Ra och GPR i fasta och glukosrika förhållanden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperglykemi och onormal glukosmetabolism/homeostas är funktioner i PCOS. Blodsockernivån upprätthålls av en kombination av glukos från kost- och glukosproduktion via glykogenolys och glukoneogenes och glykogenes, under kontroll av hormon och enzymer. Lever glukosproduktion undertrycks av närvaron av ökade cirkulerande glukosnivåer. Vid störningar av onormal glukosmetabolism äventyras regleringen av undertryckandet av glukosproduktionen vilket leder till hyperglykemi. Medan många studier har visat indirekta mätningar av lever glukosproduktion i en PCOS djurmodell, har få mätt lever glukosproduktion direkt. I denna studie beskriver vi ett enkelt sätt att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i flera möss samtidigt. Denna teknik kan tillämpas på många studier som involverar glukosmetabolism i olika musmodeller. Dessutom kan denna teknik fungera som den grund på vilken ytterligare mätningar kan tillämpas, såsom mätning av glukoneogenes och glykogenolys20,23.
De kritiska komponenterna i detta experiment är kateterinsättningen och definierar de exakta mätningarna av [6,6-2H2]glukos och naturlig glukos när infusionslösningar skapas för att utföra GCMS på ett adekvat sätt. Katetern införingstekniken beskrivs av Marini et al. 200624. Även om det finns invasiva metoder för att administrera infusioner och provtagning via halsartären och halsvenkatetrar25,26,27, uppnår införandet av en minimalt invasiv svansvenkateter samma mål på ett mindre invasivt och mindre tidsintensivt sätt. Även om två katetrar kan placeras i varje svans ven, en för infundering och en för provtagning, använde vi en kateter för infusion och utförde sedan provtagning via kinden venipuncture eftersom det bara fanns två tidpunkter för provtagning. Men om en studie inkluderade flera tidpunkter för provtagning kan införandet av en andra svansveter kateter hjälpa till att underlätta detta28.
Exakta mätningar är avgörande för beräkningar som involverar masspektrometri för att säkerställa exakta resultat. Vi använde glukosspåraren för att mäta utseendet på glukos är [6,6-2H2]glukos21. Även om andra icke-radioaktiva spårämnen har använts i andra studier, är detta en stabil isotop som ofta används i vårt labb20. Stabila glukosspårare föredras framför radioaktiva glukosspårare på grund av förbättrad säkerhetsprofil, naturlig närvaro, brist på halveringstid som påverkar studietiden och förmågan att kombinera olika spårämnen29. Valet av spårämne är upp till diskretion och expertis hos de forskare som utför studien.
Det finns vissa begränsningar i denna studie, inklusive förfarandets tekniska efterfrågan. Men jämfört med mer invasiva tekniker för catheterization (dvs. kataherisering av halsartären och yttre halsven) är denna teknik enkel, effektiv och mindre morbid. Vid användning av två svansvetetrar har det förekommit rapporter om felaktiga anrikningsvärden från infusionen som stör provtagningskatetern24. I de flesta studier är dock behovet av flera prover inte motiverat eftersom steady-state är känt. Slutligen, även om masspektrometri ger exakta mätningar, kräver det ytterligare färdigheter, expertis och kostnad.
I denna studie beskriver vi ett enkelt, exakt sätt att mäta hastigheten på den totala leverglukosproduktionen i en PCOS-musmodell. Denna teknik bör fungera som grund för flera studier som involverar glukosmetabolism av musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av utbildningsbidrag från institutionen för obstetrik och gynekologi, Baylor College of Medicine (ALG) och R-01 forskningsanslag (Anslag # DK114689) för CSB, SC och JM från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
References
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).
