Summary
本研究では、多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の直接測定を、タンデムにおける空腹時およびグルコースが豊富な状態の両方で尾静脈 を介して 安定同位体グルコーストレーサーを用いて説明する。
Abstract
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、インスリン抵抗性およびグルコース不耐症などのグルコース代謝の障害をもたらす一般的な疾患である。調節不秩序なグルコース代謝は、疾患の重要な現れであり、その病因の鍵です。したがって、PCOSにおけるグルコース代謝の評価に関する研究が最も重要である。非常に少数の研究は、非放射性グルコーストレーサーを使用してPCOSモデルで直接肝グルコース産生を定量化している。本研究では、安定同位体グルコーストレーサーである[6,6-2H2]グルコースのM+2濃縮をガスクロマトグラフィー-質量分析(GCMS)を介して測定することにより、PCOSマウスモデルにおける肝グルコース産生速度の定量化に関するステップバイステップの説明を検討する。この手順は、安定な同位体グルコーストレーサー溶液の作成、尾静脈カテーテル配置の使用および同じマウスの同じマウスにおけるグルコーストレーサーの注入を伴う。グルコースの濃縮は、GCMSでペンタセテート誘導体を用いて測定される。この技術は、肝グルコース産生速度の直接測定を含む多種多様な研究に適用することができる。
Introduction
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、生殖年齢の女性の12%〜20%で起こる一般的な障害である1,2。これは、多嚢胞性卵巣、不規則な月経および高アンドロゲン血症の臨床または実験室の証拠を含む可変的な形型をもたらす複雑な疾患であり、典型的には、女性が3つの基準のうちの2つを満たすと診断される3。PCOSの主な側面とその病因の重要な要因は、病気を持つ女性に見られる代謝変性です。PCOSを有する女性は、インスリン抵抗性、耐糖不耐症、肥満、およびメタボリックシンドロームの発生率が高い3,4,5,6。インスリン抵抗性は、疾患の現れであるだけでなく、卵巣における黄体形成ホルモンの作用を増強することによってその病態に寄与すると考えられ、それによってアンドロゲン産生の増加に繋がる7,8。インスリン抵抗性はいくつかの可能な起源を有すると考えられているが、研究は、それがインスリン受容体シグナル伝達の異常なパターンに起因する可能性を示唆しています 9,10.研究は、高インスリン法順性クランプ11、12、13、14、15の金標準技術を用いてPCOS患者におけるインスリン抵抗性を評価した。PCOSを持つ女性は、BMIに関係なく、コントロールと比較してインスリン抵抗性のレベルが高い。ブドウ糖産生に対するインスリン制御は、過剰なグルコース産生をもたらすインスリン抵抗性の障害において障害される。例えば、糖尿病患者は糖新生の割合を増加させ、グリコーゲン分解16の抑制を損なった。さらに、糖尿病ラット17ではグルコース産生の抑制障害が認められている。クランプ研究はインスリン抵抗性の測定を与えることができますが、PCOSでは断食状態と供給状態でのグルコース産生の直接測定に焦点を当てた研究はほとんどありません。これには、非放射性同位体グルコーストレーサーの注入と質量分析による測定の使用が必要です。
動物モデルは、PCOSの研究で広く使用されています。無駄のないおよび肥満タイプPCOSの両方のマウスモデルは、アンドロゲンを出生前、前立て、または後pubertally18に投与することによって作成された。げっ歯類PCOSモデルはまた、それぞれのコントロールと比較して代謝の違いを示しています。私たちの研究室からの以前のデータは、PCOSマウスモデル(リーンおよび肥満)における異常なグルコース耐性試験(GTT)を実証し、ヒトPCOS文献19と一致しました。無駄のない肥満の動物モデルの使用は、代謝の違いのさらなる調査を可能にする。具体的には、同位体グルコーストレーサーを用いてグルコース産生率を直接評価することができる。最も一般的に使用される安定同位体グルコーストレーサーの1つは[6,6-2H2]グルコースである。[6,6-2H2]グルコース濃縮は、先述したペンタセテート誘導体20を用いて測定することができる。
本研究では、同位体グルコース注入を用いたPCOSマウスにおける空腹時及びグルコースが豊富な状態における肝グルコース産生率を測定することを目的とした。これらの技術は、グルコース動態を含む幅広い実験に適用することができる。
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Protocol
すべての動物の手順は、ベイラー医科大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. [6,6-2H2]グルコースの調製
- 処置の1日前に、安定同位体グルコーストレーサーを正常食節で調製する。この実験では、[6,6-2H2]グルコースをトレーサーとして用い、血漿グルコースの出現率を測定した。
注:この実験では、空腹時およびグルコースが豊富な条件でのグルコース産生を測定し、グルコース同位体を2つの異なる調製物で調製した。最終的な注入用量がそれぞれ1mg/(kg·min)と2mg/(kg·min)に近くなるような方法で溶液を準備します。これらの濃度は、いくつかの以前のパイロット研究によって最適化されました。 - 滅菌および発熱物質を溶解して空腹時状態を表す[6,6-2H2]グルコースのみ[6,6-2H2]で最初のインフューズ酸を調製し、無菌0.9%の塩化ナトリウム溶液に溶解します。
- 2番目のインフュージングを準備し、2番目のインフューズ酸トレーサーを無等位のグルコース(〜20mg/kg·min)と共に無菌0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解させ、供給条件をシミュレートします。
注意:本実験では、(~)1.08mg/(kg·分)(空腹時)および(〜)1.9mg/kg·分(グルコースリッチコンディション)で[6,6-2H2]グルコースのプライミングされた一定速度注入を使用した。「グルコースリッチ条件」を模倣するために、D-グルコースの注入速度を(~)18.8mg/(kg·min)に設定した。 - 溶液が準備されたら、無菌は0.22 μmのフィルターで溶液をフィルターし、4 °Cで貯蔵します。 注入前に溶液を室温まで温めます。あらかじめラベル付けされた1 mLのシリンジにソリューションをロードします。
- トレーサーのみを含む最初のインフューズ(基底状態)のプライミングされた一定速度注入を容易にするようにポンプを設定し、3時間150 μL/hで同位体の一定速度注入のためにポンプをプログラムします。
- 3時間の断食セットアップの最後に、第1の注入された注入体シリンジを同位体トレーサーとDグルコースを含む第2の注入体シリンジ(シミュレートされた供給状態)に置き換え、600 μL/hでインティアル15分の注入をプライムします。追加の3時間のために150 μL/hで一定の速度注入にポンプを設定します。
2. 輸液実験のセットアップ
- マウスを自宅のケージから取り出し、実験開始の3時間前に断食ケージに入れます。この実験では、C57BL/6J株から生後4ヶ月の雌マウスを用いた。
注:この手順は、その最小限の侵襲性を与えられた手順の前または中に鎮痛を必要としません。 - マウスをインスリンポンプ当たりの一定数のマウスにグループ化して、ケージ装置を組み立てます。平らで安定したベースの上にパーティションを置き、マウスの個々の屋台を作ります。注入が実行されるために尾静脈カテーテルにアクセスすることが重要であるため、ケージドアの底部にノッチがあることを確認してください。
注: ビデオに示されているケージは、この実験のために特別に作られました。ケージは透明でプレキシガラスで作られています。パーティションが座っているフラット、安定したベース(標準的なケージ機器)があります。この設定は、テーブルの高さと実験者のニーズに応じて、いくつかの異なる環境でのセットアップを容易にする複数の部分で構成されています。ケージのドアは閉じるようにスライドし、尾が通り抜けられるように下部にノッチがあります。 - 1 mL の基底注入体を含む 1 mL のシリンジを組み立て、ポリエチレンチューブ 0.28 mm ID x 0.61 mm を使用して注入ポンプチューブに接続します。
- 注入ポンプを準備するには、150 μL/h(基礎速度)を設定します。
- 水浴を48°Cに加熱します。
- 30 G 0.5 インチの針、0.3 mm ID x 0.64 mm の流胞性チューブ、および 1 インチの透明な経散テープを含む、水浴に隣接するカテーテル挿入ステーションを準備します。
- 断食の3時間後、下で詳述されているカテーテルの挿入プロセスを開始する。
3. カテーテル挿入
- マウスを1本選択し、尾部にアクセスできるセキュアホルダーに置きます。何を使用するかの例は、尾のためのノッチで半分にカットボトルです。ホルダーを平らなベースに置きます。尾の近位部分にピーステープを置き、カテーテル挿入のスペースをより遠位にします。
メモ:このタスクに選択したテープの種類は、適度な強度と粘着性を持っている必要があります。この実験では、多目的紙ベースのラベルテープを用いて、軽度で剥がし易い。 - カテーテル(0.3mmの流動管に取り付けられた30G針及びPE−10をガス滅菌した)を、滅菌ヘパリン化した生理食音を含む1mLシリンジに取り付けて準備する。カテーテルをやさしく洗い流します。
- マウスを水浴に持ち込み、約30~45sの水浴に尾を差し込みます。これは、カテーテルの配置のための尾の脈管を拡張するのに役立ちます。
- 滅菌条件下でカテーテルの挿入を行います。尾が温まったら、ベンザルコニウムの拭き取りで尾を拭き取り、尾の近位端の止血帯として、以前は尾の形に輪郭を描いていた小さな銅、歯のないワニクランプを置きます。虫眼鏡の下に横の尾静脈を視覚化し、慎重に尾静脈にカテーテルを挿入し、針を引き出します。溶液を静かに洗い流して、カテーテルの正愛を確実にします。
- 1インチのトランスポアテープを挿入部位に巻き付け、カテーテルを固定します。尾から小さな止血帯を取り除きます。
4. 注入セットアップと初注入
- マウスを個々のケージに入れ、引き戸を閉じて、尾がノッチを突き出してケージの外に残っていることを確認します。
- カテーテル全体と尾部にテープを追加して、ケージのベースプレートに固定します。多目的色、ラベルテープはこのステップに使用されました。
- テール静脈カテーテルからフラッシュを外し、カテーテルの膠流管に小さなクランプを置いて、ポンプからインフューゼートラインを接続しながら逆流を防ぎます。
- しっかりと接続したら、クランプを取り外し、インフューズ処理で構成されるプライミング溶液でフラッシュします。溶液がチューブ内で明確であり、血液に染められていないことを確認します。
- 注入の開始時刻を書き留め、合計時間約3時間の間実行するようにします。複数のケージを同時に使用する場合は、注入時間を効果的に管理するために、それらはずらされるべきです。
- 注入ラインが正常に機能していると指摘されたら、マウスからカバーを取り外します。マウスの周りに標準の寝具を置きます。
- トレーサーを含む最初の注入物で注入を開始し、3時間連続して実行します。注入の期間、マウスのウェルビンスと注入ラインをチェックし続けます。注入管が適切に固定されていること、およびライン接続ポイントからの漏出がないことを確認します。
5. 血液サンプリング
- 最初の注入が完了した後、注入を停止し、背中の流れを防ぐためにカテーテルの気管の上にクランプを置きます。血液を採取するためにカテーテルを邪魔することなく、注意深い血管からマウスをそっと取り除きます。ケージの近くの場所に置いて、引き分けします。この実験では、マウスは4mmランセットを使用して頬静脈穿刺を受けた。
- 所望のバイアルに~75μLの血液を採取する。質量分析の準備のためにサンプルを分解するには、約15μLの血液をアセトン500μLに加えます。残りの血液は、グルコメータを 介して 血糖値をチェックするために使用され、将来のホルモンアッセイのために分離血漿に遠心分離することができます。
6. 第二の注入
- 注射器からチューブを取り外して注射器ポンプからインフュージングを取り除き、グルコースと一緒にトレーサーを含む第2のインフューズトに置き換えます。グルコースが豊富な同位体グルコース注入を使用して、ステップ4.2〜4.7を繰り返します。
- 定常状態にするには、2番目のインフューズートのボーラスを600 μL/hで15分間実行します。ケージの各グループの開始時刻に注意してください。注入速度を150 μL/hに下げ、3時間の全注入時間を完了します。
- ステップ 5.1 と 5.2 を繰り返します。
- 注入ポンプを停止し、尾静脈カテーテルを穏やかに取り外し、出血が止まるまでカテーテル部位に圧力をかけ、マウスを自宅のケージに戻します。
- 標準的な石鹸と水でケージのセットアップを徹底的に消毒し、消毒してください。
注:これは生存手順です。マウスはケージに戻し、必要に応じてさらなる試験的に保管することができます。十分な動物の福祉を確保するために、この手順の後に少なくとも1週間は、それ以上の検査を行うことをお勧めします。
7. 質量分析
- 質量分析のためにサンプルを送り出します。
- 分析
- [6,6-2H2]グルコースの同位体濃縮をガスクロマトグラフィーによる測定 - 五酢酸塩誘導体21,22を用いた質量分析(GCMS)。簡単に言えば、この方法は、グルコースのペンタアセテート誘導体の調製を含み、続いてGCMS 20,22を用いたサンプル分析を行う。
- 計算
- 定常状態の下ですべての運動測定を行います。血漿グルコース外観率(グルコースRa)の合計は、確立された同位体希釈式s21を用いて血漿中の[6,6-2H2]グルコースのM+2濃縮から算出した。定常状態下では、グルコースの出現率はグルコースの消失率と等しいと仮定される。内因性グルコース産生率(mg/(kg/min))(GPR)=グルコースラ - 外因性グルコース。
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Representative Results
先に説明した同位体希釈方程式を用いて、全血漿グルコース速度(glucoseRa)を、ペンタセテート誘導体21を用いた空腹時及びグルコースリッチ条件における[6,6-2H2]グルコースのM+2濃縮から算出した。定常状態下では、グルコースの出現率はグルコースの消失率と等しいと仮定される。対照群では、6時間の断食後に2.53mg/(kg·min)±19.98±、グルコースが豊富な状態で25.80±1.76mg/(kg)であった。上記の計算を用いて、GPRは6時間の断食後に2.53mg/(kg·min)±19.08、グルコースリッチ条件で8.56±1.40mg/(kg·min)であった(表1および図1)。
図1:空腹時およびブドウ糖が豊富な条件におけるグルコース生産率 は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 断食 | グルコースが豊富 | |
| (平均±SD) | (平均±SD) | |
| グルコースラ、mg/(kg.min) | 19.98 ± 2.53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR、 mg/ (kg.min) | 19.08 ± 2.53 | 8.56 ± 1.40 |
| Ra, グルコースの外観の速度;GPR、グルコース生産率 | ||
表1:空腹時およびグルコースが豊富な条件におけるRaおよびGPR
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Discussion
高血糖と異常なグルコース代謝/恒常性はPCOSの特徴です。血糖値は、ホルモンと酵素の制御下で、グリコーゲン分解および糖新生および糖生成を介した食事とグルコース産生からのグルコースの組み合わせによって維持される。肝グルコース産生は、循環グルコースレベルの上昇の存在によって抑制される。異常なグルコース代謝の障害では、高血糖をもたらすグルコース産生の抑制の調節が損なわれる。多くの研究は、PCOS動物モデルにおける肝グルコース産生の間接的な測定を実証しているが、少数は、直接肝グルコース産生を測定している。本研究では、複数マウスにおける肝グルコース産生率を同時に測定する簡単な方法を説明する。この技術は、様々なマウスモデルにおけるグルコース代謝を含む多くの研究に適用することができる。さらに、この技術は、糖新生およびグリコーゲン分解20,23の測定など、追加の測定を適用できる基礎として役立ちます。
この実験の重要な要素は、GCMSを適切に実行するために注入溶液を作成する際の[6,6-2H2]グルコースおよび天然グルコースの正確な測定値をカテーテル挿入および定義することです。使用するカテーテル挿入技術は、Mariniらら200624によって記述される。頸動脈および頸静脈カテーテル25,26,27を介して注入およびサンプリングを投与する侵襲的な方法があるが、低侵襲尾静脈カテーテルの挿入は、より低侵襲で、より少ない時間を要する方法で同じ目標を達成する。各尾翼静脈には2つのカテーテルを配置し、1つは注入用、もう1つはサンプリング用に配置できますが、1つのカテーテルを注入に使用し、サンプリングのタイムポイントが2つしかないため、頬静脈穿刺を介してサンプリングを行いました。しかし、研究にサンプリングのための複数のタイムポイントが含まれていた場合、第2の尾部静脈カテーテルの挿入は、この28を容易にするのに役立ちます。
正確な測定は、正確な結果を確実にするために質量分析を含む計算に不可欠です。グルコーストレーサーを用い、グルコースの外観を測定するために[6,6-2H2]グルコース21である。他の非放射性トレーサーは他の研究で採用されていますが、これは私たちのlab20で一般的に使用されている安定した同位体です。安定したグルコーストレーサーは、改善された安全性プロファイル、自然な存在、研究時間に影響を与える半減期の欠如、および異なるトレーサー29を組み合わせる能力のために放射性グルコーストレーサーよりも好ましい。トレーサーの選択は、研究を行う研究者の裁量と専門知識次第です。
この研究には、手順の技術的要求を含むいくつかの制限があります。しかし、カテーテル法のより侵襲的な技術(すなわち、頸動脈および外頸静脈のカテライゼーション)と比較して、この技術は、簡単で効率的で、病的ではない。2つの尾部静脈カテーテルを利用する場合、サンプリングカテーテル24に干渉する注入からの誤った濃縮値の報告があった。しかし、ほとんどの研究では、定常状態が知られているため、複数のサンプルの必要性は保証されていません。最後に、質量分析は正確な測定を行いますが、追加のスキル、専門知識、コストが必要です。
本研究では、PCOSマウスモデルにおける総肝グルコース産生率を測定する、簡単で正確な方法を説明する。この技術は、マウスモデルのグルコース代謝を含む複数の研究のための基礎として役立つ必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所のCSB、SC、JMに対する産婦人科、ベイラー医科大学(ALG)、R-01研究助成金(グラント#DK114689)のトレーニング助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
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